专利名称：MiRNA生物芯片及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物芯片，尤其涉及一种MiRNA生物芯片；此外，本发明还涉及该MiRNA生物芯片的应用。
背景技术：
MiRNA(microRNA)是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA，约20～24nt长度(也有少数小于20nt的)，由一段具有发夹环结构的70～80nt长度的单链RNA前体(pre-MiRNA)剪切后生成。它通过与其目标mRNA分子的3′端非编码区域互补匹配导致该mRNA分子的翻译受到抑制。
MiRNA的合成及作用通路是首先，在细胞核内的编码MiRNA的基因转录成pri-microRNA(pri-MiRNA)。pri-MiRNA在一种Drosha Rnase(Nature，2003，425415～419)的作用下，剪切为约70个核苷酸长度、具有茎环结构的MiRNA前体(pre-MiRNA)。pre-MiRNA在Ran-GTP依赖的核质/细胞质转运蛋白Exportin-5的作用下从核内运输到胞质中(Science，2004，30395-98)。在Dicer酶(双链RNA专一性RNA内切酶)(Nature，2001，409363-366)的作用下，MiRNA前体被剪切成21～25个核苷酸长度的双链MiRNA(EMBO，2002，J.214663-4670)。起初，成熟MiRNA与其互补序列互相结合成所谓MiRNAmi-RNA*双螺旋结构(MiRNA*是MiRNA的互补序列)(Science，2001，293834-838，Cell，2001，10623-34，Genes Dev.2001，152654-2659)。随后，双螺旋解旋，其中一条结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中，形成非对称RISC复合物(asymmetric RISC assembly)(Cell，2003，115，199-208，Cell，2003，115209-216)。该复合物会结合到目标靶mRNA上，在大多数情况下(例如在动物中)，复合物中的单链MiRNA与靶mRNA的3′端非编码区(3′-untranslated region，3′UTR)不完全互补配对，从而阻断该基因的翻译过程。该翻译抑制的详细机理尚不清楚。
由于MiRNA表现出组织特异性并活跃在发育初期，研究人员认为MiRNA在生物体整个生命阶段中起到一个基础性的作用。到目前，已经确定出了200多种MiRNA。2005年6月9日的《自然》杂志上的文章显示MiRNA的活动模式能够被用于诊断癌症。研究表明MiRNA表达特征能用于划分人类癌症及区分正常细胞和癌细胞，甚至能鉴别出那些外形上无法确定的癌细胞。发表在同期《自然》杂志上的第二篇文章表明一种特殊的MiRNA束能够导致小鼠的淋巴瘤。Jefferson医学院的微生物学和免疫学教授Carlo Croce博士及其同事已通过实验证明MiRNA基因的缺失与B细胞慢性淋巴性白血病(B-cell chronic lymphocytic leukemia，CLL)有关。他们还报道人类MiRNA基因常位于易发生突变的基因组的“脆性”区域(“fragile”areas)。由此可见，MiRNA基因可能与人类的多种癌症有关。
诞生于上世纪90年代初的真正意义上的生物芯片，是一种能对生物分子进行快速并行处理和分析的薄型固体器件。生物芯片上集成有成千上万密集排列的分子微阵列，通过自动化的检测软件，能够在短时间内分析大量的生物分子，使人们快速准确地获取样品中的生物信息，效率是传统检测手段的成百上千倍。
所以，用MiRNA生物芯片技术来检测每种组织特有的MiRNA表达模式具有高通量的优势，且大大减少了RNA用量。另外，MiRNA生物芯片能使我们对正常组织和癌变组织进行比较，给我们提供有关正常和癌变组织的细胞中基因表达差异的线索，为治疗癌症开辟一条新的道路，因为这些MiRNA非常小，它们能进入细胞并作为治疗药物，而确定它们的靶标可能有助于了解癌症表型。总之，MiRNA生物芯片的产生和应用将为疾病诊断和治疗、新药开发、分子生物学、食品卫生和环境监测等领域做出新的巨大贡献，另一方面还为人类提供了能够对个体生物信息进行高速、并行采集和分析的强有力的技术手段。而在本发明之前，还没有出现涉及MiRNA生物芯片的公开报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种MiRNA生物芯片。
本发明要解决的技术问题之二是提供一种应用MiRNA生物芯片的检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现一种MiRNA生物芯片，包括固相基质及点载在基质上的探针，所述探针为MiRNA探针，且该MiRNA探针具有人体内自然存在的MiRNA序列。
一种应用MiRNA生物芯片进行检测的方法，包括如下步骤1)在固相基质表面点上MiRNA探针；2)样品RNA的标记；3)标记好的样品RNA与点载在固相基质上的MiRNA探针杂交；4)洗涤后进行显色，再通过扫描检测信号点；5)数据分析。
本发明的MiRNA生物芯片运用MiRNA作为生物芯片载体上的检测用探针，而每种组织的MiRNA表达模式是特有的，所以应用MiRNA生物芯片检测能使我们对正常组织和癌变组织进行比较，发现正常和癌变组织的细胞中MiRNA差异表达的信息，从而为疾病诊断和治疗、药物筛选和新药开发、中药基因组学研究及环境保护等领域带来一场新的革命，同时也为个体生物信息的高速、并行采集和分析提供强有力的技术手段。
图1是本发明的MiRNA生物芯片杂交双色荧光标记叠加图；图2是应用本发明的MiRNA生物芯片检测片内重复性的MiRNA表达的聚类分析图；图3是图2的相关系数图；图4是应用本发明的MiRNA生物芯片检测片间重复性的MiRNA表达的聚类分析图；图5是图4的相关系数图；图6是应用本发明的MiRNA生物芯片检测所得的不同组织MiRNA差异表达图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
MiRNA的种类与序列信息来源于www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/MiRNA，其中，MiRNA生物芯片包括有191个人的MiRNA作为检测探针、2个拟南芥的MiRNA作为内阴性对照探针及9个针对tRNA、2个U6的探针作为内阳性对照。探针设计时，为了区分成熟MiRNA和MiRNA前体，针对每个MiRNA都设计二条探针一条对应于成熟MiRNA的活性区域，另一条特异地匹配于MiRNA前体序列。探针的Tm值定于60度左右，长度为20-40之间，G/C含量在30-60％，且二段序列之间重复碱基不超过5个碱基对。设计好的探针由公司合成。
应用MiRNA生物芯片进行检测时，首先需制备RNA样本。待测样品中总RNA的抽提步骤如下取细胞株、正常组织、胚胎组织、癌组织和癌旁组织，例如，若要对肝癌进行研究，可取细胞株、正常肝脏、胎肝、肝癌旁组织和肝癌组织，再用TRIZol法抽提总RNA。抽提时，每5×106细胞加入1ml TRIzol，在旋涡震荡器上混匀；对于组织样品，每100mg组织可加入1ml TRIzol，用液氮研磨或采用电动匀浆器充分打碎组织块。再加入大约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀1分钟左右，室温下静置5分钟。然后，4℃，12000rpm离心15分钟后小心将上清液转入新的1.5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置5分钟。再4℃，12000rpm离心10分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70％乙醇，4℃，12000rpm离心洗涤沉淀15分钟。去上清，沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解沉淀，测定A260和A280值。从总RNA中分离出MiRNA，可采用mirVanaTMMiRNA Isolation Kit，按照其Protocol上的步骤说明分离提取MiRNA。
提取的总RNA可进一步用于cDNA探针制备，其过程如下
1)荧光探针的制备(cDNA第一链标记)从-70℃冰箱中取出RNA，在室温下解冻，然后在0.2ml PCR管中配制反应溶液，若用Cy3/Cy5荧光标记探针，则PCR管中配制的反应溶液体系是，总RNA 5～50μg(MiRNA1～2μg)、荧光标记的引物1μg，再加入无核酸酶的水Xμl使总反应体积为10μl，若用生物素标记探针，则PCR管中配制的反应溶液体系是总RNA 5～50μg(MiRNA 1～2μg)、生物素标记的引物1μg，再加入无核酸酶的水Xμl组成10μl的总反应体积，其中，所有荧光标记的引物都采用随机八聚体引物；再在70℃预变性10分钟，变性反应结束后在PCR管中配制cDNA第一链反应体系，在该体系中分别加入4ul的5xfirst-strand buffer(第一链合成缓冲液)、2ul的0.1M DTT、1ul的5mMUnlabeled dNTP mix(未标记的dNTP混合液，对于引物用生物素标记的情况则换为加入1μl的10mM dNTP mix)、1μl的1mM Cy3/Cy5dCTP、1μl的RNA抑制剂及1ul的SuperScript II RNaseHreverse transcriptase(逆转录酶，200U/μl)，从而组成20μl的总体积；然后，42℃保温2小时，70℃变性5分钟。在PCR管中加入2μl 2.5N的NaOH水解RNA终止反应，37℃保温15分钟，加入10μl 2N HEPES中和。
2)荧光探针的纯化可应用QIAquick Nucleotide Removal Kit进行纯化，首先，标记好的探针转移至1.5ml离心管中，加入大约10倍体积的PN缓冲液，混匀，将QIAquick柱套入2ml离心管中，并转移探针至QIAquick柱，6000rpm离心1分钟，弃去滤过液；再向柱中加入700～750μl的PE缓冲液，6000rpm离心1分钟，弃去滤过液；再于13000rpm离心1分钟，并将QIAquick柱子转入一新的1.5ml Eppendorf管上，然后，向柱中加入100～150μl的EB缓冲液，13000rpm离心1分钟。
3)荧光探针的定量将下清液转移至酶标板中，分别测定A260、A550、A650；再通过Cy3-probe(pmol)＝A550×洗脱体积/0.15和Cy5-probe(pmol)＝A650×洗脱体积/0.25的计算公式进行定量；定量后的探针吸回至1.5ml离心管中，加热抽干，保存于-20℃，待杂交。在芯片杂交前，还应将预先设计并合成好的204个探针通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片、硅片等材质的固相基质上。片基采用FullMoon Oligo片基，GeneMachine公司的Ominigrid 100型号的点样仪，在湿度65-75％(以FullMoon片基为准)，温度为25℃的条件下点样，点样的格式为4X3，每个矩阵为8X9，点样完毕后，放置半小时后，将芯片放于饱和食盐水盒中，37℃水化过夜，次日取出，600mJ交联，交联完毕之芯片即可使用。通常，每个MiRNA探针均需重复点样三次或三次以上，以检测MiRNA生物芯片的片内重复性。另外，还需做好以下几点准备工作1)洗涤盖玻片，将盖玻片依次放入ddH2O、95％乙醇、ddH2O，各3min，最后放入干燥的50ml离心管中1000rpm，离心3min，去除残留的水渍，放置待用；2)配制10％PBS溶液；3)平衡杂交炉，用水平仪校准杂交炉，保持水平；4)配制如下洗片液20×SSC溶液、10％SDS溶液、洗液I(2×SSC/0.5％SDS)、洗液II(1×SSC/0.1％SDS)、洗片溶液III(0.1×SSC)。
芯片杂交前，预杂交不可少。预杂交液的配制是30μl的总体积中有9μl的20×SSPE缓冲液、3μl的50×Denhandts缓冲液及18μl ddH2O，再从干燥箱中取出芯片，将适量的预杂交液滴加于芯片上，盖上盖玻片，然后将芯片放入加有PBS的杂交盒中，置于42℃杂交箱中预杂交约1小时。预杂交完成之后取出芯片用ddH2O浸洗片刻，待盖玻片脱落后将芯片放入干燥的离心管中离心，去除残留的水渍，放置待用。
芯片杂交时，取出经定量的Cy3和Cy5标记的探针，各用9～15μlddH2O充分溶解混合于1.5ml离心管内，然后配制杂交液，Cy3/Cy5荧光标记探针的杂交液由20×SSPE缓冲液、50×Denhandts缓冲液和溶解有探针的ddH2O组成，而生物素标记探针的杂交液由20×SSPE缓冲液、50×Denhandts缓冲液、SA-Cy3/SA-Cy5及溶解有探针的ddH2O组成，接着，取杂交液滴加在芯片上，并盖上盖玻片，同时保证盖玻片覆盖在含有杂交液的芯片的有效点样区域。最后，将该杂交芯片放入加有PBS的杂交盒，置于42℃杂交箱中杂交12～20小时。
芯片杂交反应结束后，需进行芯片洗涤。先将洗液I与洗液II置于42℃水浴预热，再用镊子取出片子，浸入经过42℃预热的洗液I中，当盖玻片从芯片上脱离后，再在42℃洗液I中洗涤8～20min。然后将片子换着浸入经过42℃预热的洗液II中，洗涤8～12min，从洗液II中取出片子后，再将片子浸入洗液III中，洗涤3～8min。最后把片子在ddH2O中洗涤1～2min，转入干净离心管离心，以去除残留的水滴，经过上述洗涤，可将芯片放入芯片盒，待扫描分析。
通过特定的扫描仪比如激光共聚焦扫描仪进行扫描，扫描后将图像转化为基于荧光强度的数字信号，随后进行数据分析和处理。使用Agilent扫描仪扫描肝癌研究的MiRNA芯片，可得Cy3/Cy5两种荧光的复合图(见图1)。Cy3标记肝癌旁组织的总RNA作为对照组，Cy5标记肝癌组织的总RNA作为实验组，分别与芯片杂交后进行双色荧光叠加。对于某一点的两种叠加荧光信号，如果Cy3信号较强，该点多显示绿色(下调)；如果Cy5信号较强，该点多显示红色(上调)；如果强度相似，即显示黄色。该复合图须经软件分割成单色荧光图像，再将图像导入图像分析软件Imagene，经过自动和人工定位与排列，确定杂交点的范围，过滤背景噪音，提取得到基因表达的荧光信号强度值，最后以列表形式输出，从而完成将扫描得到的图像定量转化为数值。输出的数据通常需要包括信号强度，背景，信噪比等参数。
由于样本差异、荧光标记效率和检出率的不平衡，需对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正才能进一步分析实验数据，Normalization正是基于此种目的。数据导入分析软件Genespring，用Backgroundsubtraction based on negativecontrols和per spot and per chip Intensitydependentnormalization(non-linear or LOWESS normalization)方法标准化，计算得到ratio值(两种荧光Cy3与Cy5的比值)。一般认为ratio值在0.5-2.0范围内的基因不存在显著的表达差异，而在该范围之外的基因则被认为表达出现显著改变，此域值范围可根据具体实验条件有所调整，再通过使用genespring和cluster分析软件进行聚类分析，建立各种不同的数学模型，可以得到各种统计分析结果，确定不同基因在表达上的相关性，从而找到未知基因的功能信息或已知基因的未知功能。图6显示了44个肝癌病人的癌旁组织与癌组织中MiRNA的差异表达情况，且通过聚类分析可得出肝癌组织中某些MiRNA的表达与癌旁组织相比出现了明显下调，如hsa-miR-218-2、hsa-miR-031，而肝癌组织中有些MiRNA的表达却出现了显著上调，如hsa-miR-125b-2、hsa-miR-153-1。Gene tree，experiment tree，K-means，SOM，PCA等方法均可通过Genespring实现和展示。由cluster软件分析结果可通过treeview软件以图形显示。
最后，为了消除双色荧光造成的差异和其它偶然，需进行芯片重复实验。这种芯片重复实验可分成片内重复和片间重复两种，一般当片内重复性大于80％，片间重复性大于70％时，运用生物芯片检测所得的结果才是可靠的，通常采用相关系数来验证实验数据的准确性，相关系数越接近1说明重复性越好。本发明的应用MiRNA生物芯片检测肝癌组织得到的实验结果，其片内重复性符合大于80％的要求，图2显示的就是一肝癌病人的癌旁组织与癌组织样品MiRNA在片内重复3次得到的MiRNA表达的聚类分析图，其相关系数R2＝0.8448(见图3)，另外，实验结果也显示片间重复性大于70％，符合要求，图4所示的就是在两次不同的MiRNA生物芯片上重复点同一样品RNA得到的MiRNA表达的聚类分析图，其中所用样品为肝癌病人的癌旁组织和癌组织，01-08的数字代表了8个肝癌病人，图4的相关系数R2＝0.9013(见图5)。以相同样品同时标记两种荧光，得到芯片假阳性率小于0.5％。
权利要求
1.一种MiRNA生物芯片，包括固相基质及点载在基质上的探针，其特征在于，所述探针为MiRNA探针，且该MiRNA探针具有人体内自然存在的MiRNA序列。
2.如权利要求1所述的MiRNA生物芯片，其特征在于，所述探针包括人MiRNA检测探针、阴性对照探针和阳性对照探针。
3.如权利要求1所述的MiRNA生物芯片，其特征在于，所述的固相基质选材为玻片、硅片、陶瓷、尼龙膜、塑料、多聚物、橡胶及金属中的一种或它们的任意组合。
4.一种应用如权利要求1至3任一项所述的MiRNA生物芯片进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤1)在固相基质表面点上MiRNA探针；2)样品RNA的标记；3)标记好的样品RNA与点载在固相基质上的MiRNA探针杂交；4)洗涤后进行显色，再通过扫描检测信号点；5)数据分析。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤1)所述的MiRNA探针可通过接触式点样或喷墨式点样被点载到固相基质上。
6.如权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于，步骤1)所述的MiRNA探针均重复点样三次或三次以上。
7.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤2)和步骤3)所述的样品RNA是样品总RNA或样品MiRNA。
8.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤2)可采用荧光标记或生物素标记。
全文摘要
本发明公开了一种MiRNA生物芯片，包括固相基质及点载在基质上的MiRNA探针。本发明还公开了应用本发明的MiRNA生物芯片进行检测的方法，它包括如下步骤在固相基质表面点上MiRNA探针；样品RNA的标记；标记好的样品RNA与点载在固相基质上的MiRNA探针杂交；洗涤后进行显色，再通过扫描检测信号点；数据分析。本发明的MiRNA生物芯片及其检测方法对肿瘤、糖尿病、冠心病等各疾病的诊断与治疗具有重要意义，且为新药筛选、分子生物学等领域提供高效的新技术手段。
文档编号C12Q1/68GK1948505SQ20051003048
公开日2007年4月18日 申请日期2005年10月13日 优先权日2005年10月13日
发明者肖华胜, 韩泽广, 黄健, 华友佳 申请人:上海生物芯片有限公司, 上海人类基因组研究中心