专利名称：脂肪细胞分化相关蛋白基因与2型糖尿病的相关性的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域。更具体地涉及人脂肪细胞分化相关蛋白基因(Adipose Differentiation-Related Protein，ADRP)的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)及其与2型糖尿病的相关性。本发明还涉及检测这些SNP的方法和试剂盒。
背景技术：
糖尿病是一组以糖代谢异常为特征的由不同病理生理改变组成的综合征，不同患者之间具有较大的异质性，而其主要的两种病理生理改变为胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗。
2型糖尿病是一种复杂多基因遗传病(O’Rahilly S，Wainscoat JS，Turner RC.Type 2(non-insulin-dependent)diabetes mellitus Newgenetics for old nightmares.Diabetologia，1988，31407-14；Yukio Horikawa，Naohisa Oda，Nancy J，et al.Genetic variation in gene encoding calpain-10is associated with type 2diabetesmellitus，Nature genetics，2000，26163-175)，遗传背景有一个主效基因加上多个微效基因或由若干微效基因共同起作用，环境因素对表现型有明显影响。人类基因组测序工作草图的完成，为采用定位克隆的方法研究2型糖尿病致病基因创造了良好的条件。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是染色体上的一种遗传标记，指在基因组内某核苷酸位置上单个或多个核苷酸的替代、插入或缺失而形成的分子多态。SNP数量多、密度大、复盖整个基因组，平均500个碱基对就有一个SNP，较微卫星遗传标记更稳定，易于自动化操作，是研究复杂多基因疾病的十分有效的遗传学工具。相当一部分的SNP能改变基因表达水平或功能，本身可能就是致病位点。
虽然已开展了一些糖尿病相关基因及多态性的研究，但在本发明之前没有证实ADRP基因多态性与糖尿病相关性的报道，更没有与2型糖尿病相关性的报道。
鉴于糖尿病严重影响人们身体健康的疾病，为了尽早诊断和治疗2型糖尿病，本领域迫切需要寻找2型糖尿病易感基因，并开发检测2型糖尿病的方法、试剂盒，或相关的治疗药物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种诊断(尤其是早期诊断或辅助诊断)2型糖尿病的方法及检测试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了一种对个体的2型糖尿病易感性进行诊断的方法，它包括步骤检测该个体的ADRP基因、转录本和/或蛋白，并与正常的ADRP基因、转录本和/或蛋白相比较，存在差异就表明该个体患2型糖尿病的可能性高于正常人群。
在另一优选例中，检测的是ADRP的基因或转录本，并与正常ADRP核苷酸序列比较差异。
在另一优选例中，所述的差异是选自下组的单核苷酸多态性697位A→G；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
在本发明的第二方面，提供了一种检测样品是否存在ADRP基因的单核苷酸多态性的方法，包括步骤(a)用ADRP基因特异性引物扩增样品的ADRP基因，得到扩增产物；和(b)检测扩增产物中是否存在选自下组的单核苷酸多态性697位A→G；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
在另一优选例中，所述的单核苷酸多态性选自下组697位A→G。
在本发明的第三方面，提供了一种辅助性检测2型糖尿病的试剂盒，它包括特异性扩增ADRP基因或转录本的引物和说明书。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有选自下组的试剂(a)与突变部位结合的探针；(b)识别突变位点的限制性内切酶。
在另一优选例中，所述的突变是选自下组的单核苷酸多态性697位A→G；
其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
在另一优选例中，所述的试剂盒中的引物是序列如SEQ ID NO2和3所示的引物。
在本发明的第四方面，提供了一种ADRP基因和蛋白的用途，它被用于制备辅助性检测2型糖尿病的试剂(如特异性引物)。
图1显示了PCR产物电泳图谱。
图2显示了2型糖尿病家系(118号)ADRP基因第8外显子测序结果经CHROMAS软件识别后的图像。
图3显示了2型糖尿病家系(118号)ADRP基因第8外显子的SNP分型。
图4显示了2型糖尿病家系(25号)测序结果经CHROMAS软件识别后的图像图5显示了2型糖尿病家系(25号)ADRP基因SNP分型。
具体实施例方式
本发明人经过多年研究，首次发现和证明了ADRP基因与2型糖尿病密切相关，而且发现了它的新功能ADRP的改变将导致2型糖尿病，其中关联研究结果显示，在ADRP的SEQ ID NO1所示序列的第697位的SNP(A/G)在病例和对照组中的分布存在显著性差异(P＜0.05)，该SNP多态可导致错义突变。在此基础上完成了本发明。
具体而言，本发明人使用PCR-测序方法，对ADRP基因的启动子、外显子以及临近的内含子分别在正常人群、2型糖尿病人群进行测序，确定该基因是否与中国华东地区汉族2型糖尿病人相关。结果表明，所测ADRP基因片段总长度5003个碱基，有23个SNP，其中高频、低频分别是5个、18个。启动子的一个SNP(P/-407)在2型糖尿病人群、正常人群的基因型有显著差异(X2＝6.65，P＜0.05)；两个错义突变Ser251Pro、Thr396Ala分别与两个2型糖尿病家系共传递。这些结果提示，ADRP与华东地区汉族人2型糖尿病相关。
如本文所用，术语“ADRP”和“脂肪细胞分化相关蛋白”可互换使用，都指脂肪细胞分化相关蛋白的蛋白分子或核酸分子。
ADRP基因的详细序列可参见登录号为Hs.3416的核苷酸序列(可参见网址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，全长基因是11814bp。包含了上游5’-非翻译区域的序列示于SEQ ID NO1，共12184bp。
基于本发明的新发现，ADRP蛋白或多肽有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)辅助性检测与ADRP相关的疾病(如2型糖尿病)，或筛选促进ADRP蛋白功能的物质，如抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人ADRP蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能刺激人ADRP蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对人ADRP DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人ADRP基因产物或片段。较佳地，指那些能与人ADRP基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人ADRP蛋白的分子，也包括那些并不影响人ADRP蛋白功能的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人ADRP基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人ADRP蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人ADRP蛋白功能的抗体以及不影响人ADRP蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人ADRP基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人ADRP基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人ADRP蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人ADRP蛋白。一种优选的抗ADRP抗体是不识别正常ADRP但识别突变ADRP的抗体，或者识别正常ADRP但不识别突变ADRP的抗体。利用该抗体对正常和异常ADRP蛋白的特异性差异，可以方便地进行蛋白质水平的2型糖尿病易感性检测。
利用本发明ADRP蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与ADRP蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明ADRP蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、静脉内、或皮下给药。
本发明还提供了一种组合物(如药物组合物)，它含有安全有效量(如0.001-99.99wt％)的本发明ADRP蛋白(或其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的ADRP蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明还涉及定量和定位检测人ADRP蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。
一种检测检测样品中是否存在ADRP蛋白的方法是利用ADRP蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与ADRP蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在ADRP蛋白。
ADRP蛋白的多聚核苷酸可用于ADRP蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，ADRP蛋白的多聚核苷酸可用于检测ADRP蛋白的表达与否或在疾病状态下ADRP蛋白的异常表达。如ADRP DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断ADRP蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用ADRP蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测ADRP蛋白的转录产物。
检测ADRP基因的突变也可用于诊断2型糖尿病。检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。ADRP蛋白突变的形式包括与正常野生型ADRP DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。一类优选的突变是SNP。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的主要优点在于首次用实验证实了ADRP的改变与2型糖尿病的密切相关性，进而提供了辅助性诊断2型糖尿病(或易感性)的方法和试剂盒。本发明可以为临床诊断(尤其是早期诊断)2型糖尿病提供极为有价值的辅助性参考指标，从而有利于实现2型糖尿病的早诊断、早预防、早得益。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1一、方法1.外周血DNA的抽提去除血浆后浓缩血500ul加500ulPBS吹打混匀后10,000rpm离心1分钟或8000rpm离心3分钟，去除破碎的红细胞；加800ul 0.025M KCl低渗液，充分混合，37℃温浴20分钟，10,000离心1分钟，弃上清，重复2～3次，除去红细胞至沉淀发白，加500ul TE，4ul 10mg/ml蛋白酶K，25ul 20％SDS，用力振荡，65℃温浴30分钟，加500ul饱和酚，37℃振荡10分钟，12,000rpm离心10分钟，取上清，加1ml氯仿，12,000rpm离心10分钟，取上清，加入1/10体积的3M醋酸钠及2体积的无水乙醇，混合后于-20℃沉淀过夜；12,000rpm离心10分钟，去上清，控干，加500ul 75％乙醇洗涤，12,000rpm离心5分钟，去上清，室温干燥，加50ulTE溶解，经琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪上读出每个标本的DNA含量，-20℃保存，取一部分DNA并标化终浓度至1.5ng/ul。
2.引物设计引物设计采用的软件采用的是网页界面的Primer3(http//www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)。引物设计主要是针对基因的启动子区(Exon1上游1.5-2kb范围)和外显子进行的，引物参数设定为片断长度为300-500bp，引物最佳长度为21bp，最佳变性温度为62℃，引物浓度为0.3μM。设计的引物也作为测序引物，因此上下游引物包括的序列尽可能地避免多聚体(重复数N应小于或等于8)；引物离外显子起始或终止端至少50bp。本实施例中所设计的ADRP基因PCR引物见表1。
表1 引物序列表
3.DNA的体外扩增为了节省样本DNA以及减少PCR条件优化的麻烦，本实施例采用了多重半巢式PCR的方法。
第一次PCR(Long-PCR)是对DNA模板进行预扩增1)参阅引物资料，了解Long片段(一般为1-1.5kb)的长度以及其上下游引物的Tm值，找到较为相近但不重迭的5-6个Long片段组成一个体系。2)为了避免引物之间形成二聚体，采用QiaGen公司的热启动Taq酶，反应体系(10μl)如下10×PCR缓冲液1μl，引物(20μM)0.1μl×2×5，dNTP(10mM)0.3μl，MgCl25mM)0.6μl，HotstarTaq 0.06μl，ddH2O 6.04μl，DNA模板(1.5-3ng/μl)1μl.采用Touch-down的PCR反应程序95℃15分钟，94℃40秒，63℃1分钟-0.5℃/循环，72℃1分钟20秒，10个循环；94℃40秒，58℃40分钟，72℃1分钟20秒，30个循环；72℃8分钟；4℃终止反应。
第二次PCR(Nest--PCR)以第一次PCR产物为扩增模板，只用一对引物1)在第一次PCR产物中加入30μlddH2O，振荡均匀。2)用普通的Taq酶，反应体系(25μl)为10×缓冲液2.5μl，引物(20μM)0.375μl×2，dNTP混合物(10mM)0.5μl，MgCl2(25mM)3μl，Taq 0.2μl，ddH2O 17.05μl，DNA模板(第一次PCR产物)1μl.采用Touch-down的PCR反应程序95℃2分钟；94℃30秒，63℃1分钟-0.5℃/循环，72℃40秒，10个循环；94℃30秒，58℃40分钟，72℃40秒，30个循环；72℃3分钟；4℃终止反应。
4.PCR产物电泳PCR结束后，每行抽取3个样本，吸取3μl加入2μl 2×上样缓冲液排枪上样，在1.5％的琼脂糖胶中120V电压20min。凝胶摄像仪拍摄，打印(结果见图1)。
5.PCR产物纯化纯化反应步骤1)在纯化用的过滤板面右侧贴上胶带，然后在上面写上样品名称.
2)加入150μl Resin树脂(购自安法玛西亚公司)，及PCR产物(25-50μl均可)，盖好粘纸，震荡后，静置10分钟.
3)去粘纸，2200转离心2分钟，去废液.
4)加入150μl 80％异丙醇.
5)2200转离心2分钟，去废液.
6)加入150μl 80％异丙醇.
7)2200转离心2分钟，去废液.
8)不加异丙醇，2200转3分钟以便彻底去净残留的异丙醇.
9)真空抽干8分钟(从压力指针指示近0时开始计)10)加去离子水20μl，震荡后静置溶解10分钟.
11)换上96孔板，标记好样品名称，标记位置与过滤板上的标记对应，2200转离心5分钟.
12)取3μl纯化产物与3μl上样缓冲液混和，1.5％琼脂糖电泳电压100伏。
6.对PCR片段进行测序测序反应操作步骤1)-20℃冰箱中取出PCR纯化产物、MIX、0.8uM引物(没有则用10uM或50uM的母液现配)2)取96孔反应板，标上模板名(即PCR纯化产物名)、日期，用连续加样器逐一加入引物2ul，然后用12孔排枪加入模板2ul，最后用连续加样器逐一加入mix 2ul于离心机上甩一下，达1300转/分左右即停。
3)PCR扩增(9700型反应仪，购自PE biosystem公司)。反应条件如下96℃10秒；96℃10秒，50℃5秒，60℃4分钟，共35个循环；60℃4分钟。
4)扩增结束后，用连续加样器加入70％乙醇(加入量与反应体系之比为9∶1)即50ul左右于室温进行沉淀，时间15分钟以上，不得超过24小时。
5)4000转/分，4℃离心30分钟。
6)轻轻倒去上清液，将96孔板倒置离心，达800转/分即停。
7)每孔加入2-3ul的上样缓冲液，2000转/分1min。
8)90℃变性2分钟，立即置冰上，待上样。
7.SNP位点的搜寻将Sequence Analysis3.3软件(ABI公司)分析产生的图形文件传至带有Phredphrap，Polyphred和Consed软件(University of Washington)的UNIX主机上。先创建四个子目录chromat_dir，edit_dir，poly_dir和phd_dir，然后将每个样本的测序图形文件移至chromat_dir目录下，在edit_dir下先后运行phredphrap和polyphred。Polyphred会将软件怀疑的SNP位点标上提示信号如各种颜色，不同颜色代表不同的可信程度，最终的确认需打开图形用肉眼来评定。
按以下标准判断一个位点是否为SNP位点1)显示杂合的碱基的两侧序列是可辨别的单峰，背景比较低；2)将杂合个体与纯合个体测序图进行比较，在杂合个体的图中，碱基峰有明显的下降趋势。对于有插入或缺失的片断，有很特征的测序图——在杂合个体里，测序峰形会从插入或缺失位置开始变得很乱。通过对比两种不同纯合子的序列可确定插入或缺失的是什么碱基。
二、结果所测ADFP基因片段总长5003个碱基，共发现23个SNP，SNP分型的结果表明，高频和低频SNP分别为5个和18个。对高频SNP位点进行病人、正常人对照研究的结果表明，高频SNP全部分布在启动子区，它们的基因分型见表(2)，其中P/-407这一SNP位点在2型糖尿病人群与正常人群的基因型有显著差异(X2＝6.65，P＜0.05)。
表2.ADRP基因SNP分型结果 另外，还发现两个错义突变分别与两个2型糖尿病家系共传递。ADFP基因第8号外显子有一个错义突变(Thr397Ala)，在118号家系的8个人中，4个糖尿病人全部都是A/G；另有1个年龄为45岁的糖耐量减低的人是A/G，一个年龄是29岁的正常人也是A/G。该家系所测的两个正常人是A/A(图2、3)。
ADFP基因第6号外显子的一个错义突变(Ser252Pro)，在本发明研究的25号2型糖尿病家系的4个人中三个病人全部是C/T，一个正常人是T/T(图4、5)。值得注意的是这两个多态性仅在这两个家系中发现，在所筛查的200名散发糖尿病个体和200名正常人中均未发现这两个多态性，表明这两个多态性为这两个家系所特有的突变，而非SNP。
ADFP蛋白经BLAST软件处理后，发现在不同物种之间有很大的相似性。虽然在突变Ser252Pro处，不同物种之间不太保守，但是本发明研究发现的Thr397Ala局部区域，在进化过程中是相当的保守，在明确已知的、能在NCBI查到的物种，在此位点的遗传密码 均编码苏氨酸。这表明该突变区域碱基编码的氨基酸所构成的结构域对亲脂素(adipophilin)的空间结构、生理功能的发挥起非常大的作用。
整个ADFP蛋白在牛与人之间有82％相同，下面蛋白序列是这两个突变所编码氨基酸的附近区域 整个ADFP蛋白在Sus scrofa与人之间有82％相同，下面的蛋白序列是这两个突变所编码氨基酸的附近区域 整个ADFP蛋白在小鼠与人之间有76％相同，下面的蛋白序列是这两个突变所编码氨基酸的附近区域
虽然整个ADFP蛋白在Xenopus laevis与人之间只有55％相同，但这两个突变所编码氨基酸的附近区域蛋白序列仍相当保守 三.讨论近年来，肥胖、脂毒性在2型糖尿病发病中的作用受到高度重视。脂肪分化相关蛋白(Adipose Differentiation-Related Protein，ADFP)基因广泛表达于肝脏、胰岛、骨胳肌、肾脏、肺、小肠等组织。ADFP基因表达的蛋白质——亲脂素(adipophilin)是形成细胞内脂质小滴囊泡的主要成分，也是巨噬细胞、脂肪细胞内脂质沉积的标志(Heid HW，Schnolzer M，Keenan TW.Adipocytedifferentiation-related protein is secreted into milk as a constituent of milk lipidglobule membrane，Biochem J，1996，320(Pt3)1025-30；Buechler C，Ritter M，Duong CO et al.Adipophilin is a sensitive marker for lipid loading in human bloodmonocytes.，Biochim Biophys Acta，2001，1532(1-2)97-104.)。
先前的研究已通过全基因组扫描把华东地区汉族人2型糖尿病相关基因定位在9号染色体的与D9s171连琐的区域。本发明研究选择位于D9s171附近区域的ADRP基因为候选基因，通过SNP检测与基因分型，分析ADRP与2型糖尿病的相关性。
ADFP广泛表达于许多组织肝脏、胰岛、骨胳肌、肾脏、肺、肠、淋巴等。ADFP是脂肪细胞分化时最早的一个标志(早于脂肪酸结合蛋白、脂蛋白脂酶)，在前脂肪细胞分化的一天以内，其mRNA可升高约100倍(Biochem J 1996Dec 15；320(Pt3)1025-30Adipocyte differentiation-related protein is secreted intomilk as a constituent of milk lipid globule membrane.Heid HW，Schnolzer M，Keenan TW)。ADFP基因编码的蛋白质——adipophilin是形成细胞内脂质囊泡的主要成分，也是巨噬细胞、脂肪细胞内脂质沉积的标志。正常生理表达量的adipophilin与自由脂肪酸、胆固醇、胆固醇酯水平无关。LDL诱导单核细胞2小时，可引起ADFPmRNA明显升高，adipophilin可促进脂肪酸的吸收，最终导致细胞浆内自由脂肪酸增多。体内某些脂肪酸是PPARγ的配体(7.Buechler C，Ritter M，Duong CO et al.Adipophihn is a sensitive marker for lipid loading inhuman blood monocytes.Biochim Biophys Acta.2001 May 31；1532(1-2)97-104)，肥胖时这些脂肪酸发生了改变，引起PPARγ信号传导的异常，而PPARγ、PPARα、PPARδ也可促进ADFP的高表达(Buechler C，Ritter M，Duong CO etal.Adipophilin is a sensitive marker for lipid loading in human blood monocytesBiochim Biophys Acta.2001 May 31；1532(1-2)97-104；Gupta RA，Brockman JA，Sarraf P，et al.Target genes of peroxisome proliferator-activated receptor gamma incolorectal cancer cells.J Biol Chem.2001 Aug 10；276(32)29681-7)。自由脂肪酸增多也可抑制抵抗素基因(resistin)、促进leptin基因的表达，从而造成了胰岛素抵抗(Juan CC，Au LC，Fang VS，Kang SF，Ko YH，Kuo SF，Hsu YP，Kwok CF，HoLT.Suppressed Gene Expression of Adipocyte Resistin in an Insulin-Resistant RatModel Probably bv Elevated Free Fatty Acids.Biochem Biophys Res Commun 2001Dec 21；289(5)1328-1333)。另外阻止PKC的活性，将导致ADFP的高表达和细胞内脂滴增多、变大，使用药物使ADFP基因表达下降时，将使脂滴融解、消失(Chen JS，Greenberg AS，Tseng YZ，Wang SM.Possible involvement of proteinkinase C in the induction of adipose differentiation-related protein by Sterol ester inRAW 264.7 macrophages.J Cell Biochem 2001；83(2)187-99)。
作为细胞内脂质小滴结合蛋白的Adipophilin，与Peri基因(Perilipin)密切相关。细胞内的脂质小滴或被adipophilin或被Perilipin所包裹，也就是说它们之间存在相互抑制的关系。实验研究表明Perilipin能调节甘油三脂的水解，Peri-/-与Peri+/+鼠相比，血浆中Leptin浓度明显升高、糖耐量异常、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、脂肪水解作用增强，体内脂肪减少可达30％左右。Peri-/-鼠的一系列病理生理反应是否与Adipophilin相关尚有待于进一步证实。
本发明研究所发现的ADFP的两个突变，虽然在118家系中有一个正常人也是杂合子，这可能是由于她年龄较小而未表现为糖尿病，可通过跟踪随访来进一步作研究成果。两个错义突变Ser252Pro和Thr397Ala都导致带羟基的极性氨基酸变为非极性氨基酸，苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)为带羟基的极性氨基酸，丙氨酸(Ala)和脯氨酸(Pro)是非极性氨基酸。以往的研究提示，带羟基的氨基酸与磷酸化有紧密的联系，而磷酸化与细胞的分化有关。本发明的试验结果提示，ADFP基因的两个突变可能分别是两个2型糖尿病家系的致病位点。ADFP作为脂肪细胞分化的早期指标，且与脂肪酸的代谢密切相关，因此，ADFP与糖尿病存在一定相关性。
实施例22型糖尿病易感性检测试剂盒制备一试剂盒，它含有名称序列(5’→3’) 编号 浓度正向引物CCTCAACTGGCTGGTAGGTCC SEQ ID NO2 干粉 20D反向引物TCACACCAGAGCAGACACCAGTSEQ ID NO3 干粉 20DPCR反应液 含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液抽取待检测对象的血液3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将2型糖尿病检测试剂盒中的PCR引物稀释到1μmol/μl，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI-PRISMTM377DNA测序仪进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。
结果，在SEQ ID NO1中第697位为G的检测对象中，其2型糖尿病易感性高于正常人群。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海市内分泌代谢病研究所<120>脂肪细胞分化相关蛋白基因与2型糖尿病的相关性<130>050056<160>23<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>12814<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1ttttttcttt tctttttttt tttttagaca gggtctcagt cactcaggct ggggtgcagt60ggtacagtgg cgcgatctcg actcattgca gcctcgacca cctgggctca aaagattctt 120tcacctcagc cacccacccg cctgccccca accccgctaa acagccggga ctagctggga 180ctacaggcgc gcgccaccac gctgggctgc tttctttgta ttttgagaga gacggggttt 240cgccatgttg gccaggctgg tgattcgctc gcctcggcct cccaaagtgc taggattaca 300ggcgtgagcc accgcgccca gccgccacaa aacttttaaa agttattact tcgctaaaaa 360taacagcgta gaagccattg tgcagcgcca cgcgatctcg gctcactgca gcctcgacct 420cccaggctca agcgatcctc ccatcttagc ctcgcaggta gctggggcca caggcgcacg 480acaccacgct gggctatttt ttaaaataaa ataaaaatct tcgccaggct ggtctcgaac 540tcctaggctc gacagatcct ctcgcctcag catcccaaag tgttgtgatt acaggcgtga 600gccaccgctt ccatttttag agttctattc tgaggactaa cgccgttcaa caagttggtg 660tgaatttgtt tgcatttttc aaaaccccaa agccggcctg ggcgccatcc ccatttgccc 720cgggcctctc aggaccccga ccacaggcag gaccccgacc acaggcagcg ccccgactcc 780aggcagcgcc ccgactccag gcagggctac ctccaactcc cagcctcccc aggccgggcc 840cccgcccggc tcccgacagg ctcctctccc cgtggcgggg cccctcgccc aggcagcaca 900ccctctcaac ccgaccgggc ccccaccact ctaggagggc cggcgttggg ggagggcgcc 960gggacgtgcc cgagggtgac actcgggctt gggacagggc gtgctgccgc gggtcacgtg 1020ctgcggaggc ttggggaggg gcggcgaggc ggggtttata gcccgggcgc ccgcgggccc 1080cacgctttga ccgggtcgtg gcagccggag tcgtcttcgg gacgcgcctg ctcttcgcct 1140ttcgctgcag tccgtcggtg agtgcgcgcc cagtgggtgc cccagcgaac cggtcccggg 1200cccccagcgg cgcccagttg gggtgggggg ctccccgggg ccttgggacc gctgctctgc 1260tccccgcggg gctcaaaggt ggacgggacg cgggggtgat ggtccgagac cccccgctcg 1320cctcgcggct tccaggtcct ggctgggtag gggcggtctg ctgaacccgc gctttcgacc 1380cttgcctttg tgcgttgagg cttctttcct gccaacagat ttagggcgat tgctatcgaa 1440tgtcccttgg cctgcttggg tggttgtggg aaaacaatat ttgtcgaagg gacattatcg 1500aaagggaaac gcgttagaaa accgcatttt ttttttgacg gagtctcgct ctgtcgccca 1560ggctggagtg cagtgacgcc atctaggctc actgcaacct ccgcctcccg ggttcaagcg 1620attctcctgc ctcagcctcc agagcagctg ggataacagg cgcccgccac cacgcccggc 1680taatttttgt atttttagaa gagacggggt ttcaccacgt tggtcaggct ggtcttgaac 1740tcctgacatc aagcagtcca cccccctcgg cctcccaaag tgctgggatt acaggcgtga 1800gccaccgcgt ccggcttggc tagcattttt gttaacagat actcggagaa acaagagaag 1860tatgtcaaca actttacttc tccctcctga gtattgcaag tttacacata agctctgaaa 1920
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1.一种对个体的2型糖尿病易感性进行诊断的方法，其特征在于，它包括步骤检测该个体的ADRP基因、转录本和/或蛋白，并与正常的ADRP基因、转录本和/或蛋白相比较，存在差异就表明该个体患2型糖尿病的可能性高于正常人群。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，检测的是ADRP的基因或转录本，并与正常ADRP核苷酸序列比较差异。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的差异是选自下组的单核苷酸多态性697位A→G；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
4.一种检测样品是否存在ADRP基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括步骤(a)用ADRP基因特异性引物扩增样品的ADRP基因，得到扩增产物；和(b)检测扩增产物中是否存在选自下组的单核苷酸多态性697位A→G；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的单核苷酸多态性选自下组697位A→G。
6.一种辅助性检测2型糖尿病的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增ADRP基因或转录本的引物和说明书。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，它还含有选自下组的试剂(a)与突变部位结合的探针；(b)识别突变位点的限制性内切酶。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变是选自下组的单核苷酸多态性697位A→G；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
9如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物是序列如SEQ IDNO2和3所示的引物。
10.一种ADRP基因和蛋白的用途，其特征在于，用于制备辅助性检测2型糖尿病的试剂。
全文摘要
本发明公开了一种检测2型糖尿病易感性的方法，它包括检测个体的脂肪细胞分化相关蛋白基因ADRP、转录本和/或蛋白与正常相比是否存在变异，存在变异就表明该个体患2型糖尿病的可能性大于正常人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK1948504SQ20051003042
公开日2007年4月18日 申请日期2005年10月12日 优先权日2005年10月12日
发明者罗敏 申请人:上海市内分泌代谢病研究所