专利名称：一种羧肽酶b的制备方法及其组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶学、含有酶的组合物及分离或纯化方法技术领域，具体涉及一种羧肽酶B的制备方法及其组合物。
背景技术：
羧肽酶B(carboxypeptidase B，简称CPB，EC3.4.17.2)是一种含锌的胰外肽酶，特异性水解肽链C末端的碱性氨基酸精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸。羧肽酶B含307个氨基酸残基，分子量35KDa。猪胰脏中存在的羧肽酶B是由前羧肽酶原B(preprocarboxypeptidase B)产生的。前羧肽酶原B的N末端包含108个氨基酸的片断(其中13个氨基酸为信号肽序列、95个氨基酸残基组成活性肽部分)与C末端的羧肽酶B相连，前羧肽酶原B在转运到内质网的过程中，信号肽被剪切得到不具有活性的羧肽酶原B(procarboxypeptidase B)从细胞中分泌出来，然后通过胰蛋白酶酶解为具有活性的羧肽酶B和活性肽部分。
羧肽酶B广泛用于蛋白质及肽类C末端氨基酸测序，或用于蛋白质或多肽的C末端碱性氨基酸残基的修饰。在医学上用于诊断胰腺炎。目前在基因工程领域获得了越来越广泛的应用，特别在重组人胰岛素的生产过程中，羧肽酶B为不可或缺的双酶之一，其比活性的高低及稳定性是影响胰岛素原活化收率的一个重要参数〖周颖、杨桦、肖尚志、乔德水，羧肽酶B的稳定性考察，中国生化药物杂志，2002，23(4)185-186〗。
现有的从动物胰脏提取羧肽酶B的生产方法是动物胰脏匀浆激活、分级盐析、透析、离子交换层析，再盐析、透析，最后加盐冻存，其中盐析和透析周期长，效率低；而且离子交换层析通常经过三步，回收率大为降低。文献报道了采用匀浆、硫酸铵盐析的方法进行初步提取，然后采用疏水层析、离子交换层析的方法进行纯化，显著提高了羧肽酶B的活力及得率〖王伟刚、曹雪梅、温传彬、戴素霞、杨桦、孔毅，从猪胰脏中提取及纯化羧肽酶B工艺改进，武汉工业学院学报，2002，(2)P16-17、21〗。但是该方法由于是在匀浆后进行盐析操作，匀浆液中存在的脂类不利于后续的抽提操作，羧肽酶B的得率较低，而且盐析后活性羧肽酶B存在于清液中不利于长期保存，必须立即进行后续单元操作。
现有技术中羧肽酶B在离子交换层析后，加盐浓缩冻存，其稳定性差，保存时间仅为2月。
发明内容
为了克服羧肽酶B制备方法的现有技术中存在的缺陷，发明人进行了广泛而深入的研究。发明人比较了多种羧肽酶B的抽提方法及其纯化工艺，通过使用丙酮破碎胰脏、制备丙酮粉的方法成功解决了上述技术缺陷，发明人对丙酮抽提方法进行了广泛研究。
为了克服现有技术中羧肽酶B制剂不稳定的缺陷，发明人进行了广泛研究。
基于上述研究，本发明所要解决的技术问题之一是提供一种羧肽酶B的制备方法，以克服现有技术中存在的羧肽酶B得率低的技术缺陷。
本发明所要解决的技术问题之二是提供一种稳定的羧肽酶B组合物以克服现有技术中羧肽酶B稳定性差的技术缺陷。
为解决上述羧肽酶B制备方法中存在的技术问题，发明人采取的技术方案是用丙酮抽提胰脏羧肽酶B，制备包含羧肽酶B的丙酮粉。然后采用疏水层析、离子交换层析纯化羧肽酶B，本发明的技术路线如图1。
其中，丙酮粉的制备方法是将胰脏用1～5倍量丙酮处理2～3次，制成丙酮粉。胰脏是新鲜的胰脏或者冻胰脏，胰脏用机械方法粉碎。优选地，选用冻胰脏用机械方法粉碎后，加1～5倍量预冷的丙酮处理2～3次。更优选地，冻胰脏机械粉碎后自溶16～24hr，加1～5倍量预冷的丙酮处理2～3次。每次用丙酮处理后收集滤渣，收集滤渣的方法在本领域是已知的，例如离心收集滤渣或者过滤收集滤渣。最后收集的滤渣干燥后即得丙酮粉。滤渣干燥的方法在本领域是已知的，如自然风干等。
优选地，制备包含羧肽酶B的丙酮粉的方法是将冻胰脏机械粉碎，用1～5倍量的预冷丙酮处理2～3次，收集最后滤渣后用1～5倍量丙酮/乙醚混合液(体积比1∶1)处理，收集滤渣干燥后获得丙酮粉。更优选地，上述滤渣再用1～5倍量乙醚处理，收集滤渣干燥获得丙酮粉。
上述所说的“1～5倍量”的含义是每g胰脏1～5ml丙酮或其它溶液，在下文中如没有特别说明，凡提到“倍量”均为该含义。
在本发明羧肽酶B的制备方法中，丙酮粉加水搅拌后，用Tris-HCl缓冲液或者氢氧化钠调节pH至7.0-8.0，搅拌抽提1～4hr，抽提液过滤或离心，每升清液中加入180～220g硫酸铵盐析。该盐析技术在本领域是公知的。盐析液过滤或离心，清液经疏水层析和离子交换层析获得纯化的羧肽酶B。疏水层析介质可以选用本领域常用的苯基、C8或C4基琼脂糖凝胶，如Butyl Sepharose 4Fast Flow、Octyl Sepharose 4 Fast Flow和Phenyl Sepharose 6 Fast Flow等(GE Healthcare，Amersham Biosciences)或者FractogelEMD Phenyl(北京金欧亚科技发展有限公司)，按照厂家提供的说明书自己装柱，或者选用预装柱如HiLoadTMPhenyl Sepharose HP Columns或HiPrepTM或HiTrapTM等，疏水层析的操作按照厂家提供的说明书进行。疏水介质的平衡缓冲液为含有1.5M硫酸铵的20-50mmol/LTris-HCl、pH7.0-8.5，优选地pH7.0-8.0，最优选地pH8.0。洗脱缓冲液为20-50mmol/LTris-HCl、pH7.0-8.5，优选地pH7.0-8.0，最优选地pH8.0。操作流速10cm-18cm/hr，优选地操作流速12-16cm/hr。紫外检测A280nm吸收值。峰值洗脱液进一步用离子交换层析纯化。离子交换介质选用本领域常用的阴离子交换介质，如DEAE Sepharose Fast Flow、Q Sepharose FastFlow(GE Healthcare，Amersham Biosciences)或者FractogelEMD TMAE、FractogelEMD DEAE(北京金欧亚科技发展有限公司)等，按照厂家提供的说明书或者本领域公知的技术自己装柱或者选用厂家预装柱如HiLoadTMQSepharose等。离子交换介质的平衡缓冲液为20-50mMTris-HCl，pH7.0-8.5，优选地pH7.0-8.0，特别优选地pH7.5；洗脱缓冲液为20-50mMTris-HCl，pH7.0-8.5，优选地pH7.0-8.0，特别优选地pH7.5，氯化钠线性梯度0-0.1M/(5-10柱体积)，操作流速16cm-26cm/hr，优选地18cm-24cm/hr。
为了解决上述羧肽酶B不稳定的技术问题，发明人所采取的技术方案是在纯化的羧肽酶B中加入甘露醇，冷冻干燥获得稳定的羧肽酶B组合物。
本发明提供的稳定的羧肽酶B组合物包括羧肽酶B，还含有3-5％(重量体积比，g/100ml)的甘露醇。
本发明的稳定的羧肽酶B组合物的制备方法，通过制备丙酮粉、硫酸铵盐析、疏水层析、离子交换层析后的纯化羧肽酶B溶液中加入3-5％(重量体积比，g/100ml)的甘露醇，混匀，冷冻干燥即得。优选地离子交换层析后的纯化羧肽酶B溶液经过浓缩，然后再加入3-5％(重量体积比，g/100ml)的甘露醇，混匀，冷冻干燥即得。
本发明通过制备丙酮粉抽提羧肽酶B具有显著的技术效果。丙酮可以有效破碎细胞膜，加速目标产物的释放，而且丙酮可以脱去胰脏组织中的脂肪，便于后续的抽提。制备的丙酮粉具有蛋白活性，可以长时间保存，便于控制。同时该丙酮粉还可以用于提取其它胰酶。
本发明制备羧肽酶B的方法，羧肽酶B的得率达60U/g胰脏以上，得率提高了20％以上，羧肽酶B的比活性大于200U/mg，SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)纯度与羧肽酶B对照品(SIGMA)在同一位置有单一条带。另外本发明的制备羧肽酶B的方法大大缩短了生产周期，降低了生产成本，而且单元操作简便，易于控制。应当说明的是在上下文中“得率”一词的含义理解为每单位原料(动物胰脏)经过本发明的方法纯化后获得的羧肽酶B的活性(U)。
本发明的羧肽酶B组合物，其羧肽酶B的稳定性大大提高，活性稳定性保持两年以上，而现有技术中羧肽酶B加盐冻存仅为2月。
附图1系制备羧肽酶B的工艺路线。
附图2系羧肽酶B疏水层析洗脱曲线。
附图3系羧肽酶B离子交换层析洗脱曲线，——为A280nm，——为羧肽酶B活性曲线。
附图4系羧肽酶B的稳定性曲线。
以下结合具体实施方式
详细说明本发明，但是所有具体实施方式
均应理解为说明性的，仅为阐明本发明的内容，不以任何方式限制本发明的范围。
具体实施例方式
实施例一 丙酮粉的制备选用猪冻胰脏1kg，刨切成厚约2mm左右的薄片，室温自溶16-24小时。自溶后，加预冷丙酮处理两遍，每遍加3倍量丙酮(V/W)，搅拌，离心收集滤渣，滤渣自然风干即为包含羧肽酶B的丙酮粉。
实施例二 丙酮粉的制备选用新鲜猪胰脏1kg，用绞肉机绞碎，加入预冷的丙酮处理三遍，每遍用5倍量丙酮(v/w)，不断搅拌，离心收集滤渣，滤渣自然风干后即为含有羧肽酶B的丙酮粉。
实施例三 丙酮粉的制备选用猪冻胰脏1kg，刨切成厚约2mm左右的薄片，室温自溶16-24小时。自溶后，加预冷丙酮处理两遍，每遍加3倍量丙酮(V/W)，搅拌，离心收集滤渣，再用2倍量丙酮∶乙醚(1∶1)混合液处理，不断搅拌，离心收集滤渣，滤渣自然风干即为包含羧肽酶B的丙酮粉。
实施例四 丙酮粉的制备选用猪冻胰脏1kg，如实施例三一样操作，经丙酮乙醚混合液处理后的滤渣，再用2倍量乙醚搅拌抽滤一遍，离心收集滤渣，摊平，自然晾干即得丙酮粉。
实施例五 羧肽酶B的纯化取实施例一的丙酮粉加十倍量水，搅拌半小时后，用1mol/L氢氧化钠调pH至8.0，继续搅拌抽提1.5小时。抽提液用一层纱布过滤后，清液量体积，按1.5mol/L加入硫酸铵，放置1.5小时。盐析液过滤后上疏水层析柱，疏水层析介质用平衡缓冲液平衡，穿透峰弃去，待A280nm下至基线后，用洗脱缓冲液洗脱，检测A280nm吸光度值，收集洗脱峰。疏水层析条件如下层析柱11×20cm(介质床层高度)疏水介质Octyl Sepharose 4 Fast Flow流速12cm/hr平衡缓冲液20mmol/LTris-HCl，pH8.0，含1.5mol/L硫酸铵洗脱缓冲液20mmol/LTris-HCl，pH8.0洗脱曲线见附图2。收集大洗脱峰(第一洗脱峰)洗脱液，即为含有羧肽酶B的洗脱液。疏水层析目的洗脱液上预先用平衡缓冲液平衡的阴离子交换层析柱，上样完毕用平衡缓冲液平衡，穿透峰弃去，待A280nm下至基线后，开始梯度洗脱，收集含有羧肽酶B的洗脱峰。离子交换层析条件如下层析柱8×20cm(介质床层高度)离子交换介质DEAE Sepharose Fast Flow流速18cm/hr平衡缓冲液20mmol/LTris-HCl，pH8.0洗脱缓冲液20mmol/LTris-HCl，pH8.0线性梯度0～0.1MNaCl/5倍柱体积洗脱曲线如附图3，第三个洗脱峰即为羧肽酶B洗脱峰。
羧肽酶B的纯度检测采用SDS-PAGE法〖张龙翔，张庭芳等SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量，生化实验方法和技术，北京高等教育出版社，1989年版100-106〗，与对照品羧肽酶B(SIGMA)在同一位置，均为单一条带。
羧肽酶B的浓度测定采用双缩脲法〖张龙翔，张庭芳等双缩脲法，生化实验方法和技术，北京高等教育出版社，1989年版136-138〗。
羧肽酶B的活力测定采用紫外吸收法，参照Wolff法〖J.E.Folk，Gladner，KarlA.Piez，et alCarboxypeptidases B.J.Biol.Chem.，Vol.235，No.3，August 1960〗测定。底物为HIPPURYL-L-ARG。测定浓度为10-3mol/L，缓冲液为0.025MTris-HCl，pH7.5(含0.1MNaCl)，反应温度为25℃。反应体系2.9ml加入酶液100μl后，立即摇匀校正零点并记时。在254nm测其吸收度增值，每隔30s读数一次，5min内吸收度的增值应呈线性，否则酶液应稀释后再测。
结果羧肽酶B的纯度为单一条带，比活大于200U/mg，羧肽酶B的收率65U/g胰脏。
实施例六 羧肽酶B的纯化取实施例三的丙酮粉，如实施例五操作，疏水层析和离子交换层析pH控制为7.5，疏水层析线性流速16cm/hr，离子交换层析线性流速24cm/hr。结果羧肽酶B的SDS-PAGE纯度呈单一条带，羧肽酶B的比活大于200U/mg，羧肽酶B的收率64U/g胰脏。
实施例七 羧肽酶B的纯化取实施例四的丙酮粉，如实施例五操作，所有缓冲液的浓度为50mmol/L。结果羧肽酶B的SDS-PAGE纯度呈单一条带，羧肽酶B的比活大于200U/mg，羧肽酶B的收率60U/g胰脏以上。
实施例八 羧肽酶B组合物实施例五的纯化羧肽酶B，超滤浓缩后加入3％(重量体积比，g/100ml)的甘露醇，混匀，冷冻干燥即得羧肽酶B组合物。
实施例九 羧肽酶B组合物实施例六和七的纯化羧肽酶B，超滤浓缩后加入5％(重量体积比，g/100ml)的甘露醇，混匀，冷冻干燥即得羧肽酶B组合物。
实施例十 羧肽酶B的稳定性实施例八和九的羧肽酶B组合物，-20℃保存，定期取样，用SDS-PAGE测定其纯度、用双缩脲法测定其浓度，用紫外吸收法测定其活性，结果活性保持两年，附图4。
权利要求
1.一种羧肽酶B的制备方法，包括盐析、疏水层析和阴离子交换层析步骤，其特征在于还包括用丙酮抽提胰脏制备丙酮粉的步骤，即将胰脏用1～5倍量丙酮处理2～3次，制成丙酮粉。
2.根据权利要求1的羧肽酶B的制备方法，其特征在于将冻胰脏机械粉碎后自溶16～24hr，加1～5倍量预冷的丙酮处理2～3次，收集滤渣，再用1～5倍量丙酮/乙醚混合液(体积比1∶1)处理，收集滤渣干燥后获得丙酮粉。
3.根据权利要求2的羧肽酶B的制备方法，其特征在于用丙酮/乙醚混合液处理后再用1～5倍量乙醚处理，收集滤渣干燥获得丙酮粉。
4.根据权利要求1-3任一所述的羧肽酶B的制备方法，其特征在于(a)丙酮粉加水搅拌，调节pH至7.0-8.0，抽提1-4hr；(b)清液经疏水层析，条件为疏水层析介质是苯基、C8或C4基琼脂糖凝胶，平衡缓冲液是20-50mmol/LTris-HCl、pH7.0-8.0、含1.5M硫酸铵，洗脱缓冲液是20-50mmol/LTris-HCl、pH7.0-8.0，流速12-16cm/hr，检测A280nm收集大吸收峰；和(c)用阴离子交换层析纯化，条件是介质为DEAE或者Q阴离子交换介质，平衡缓冲液是20-50mmol/LTris-HCl、pH7.0-8.0，洗脱缓冲液是20-50mmol/LTris-HCl、pH7.0-8.0，NaCl线性梯度0-0.1M/(5-10倍柱体积)、流速16cm-26cm/hr检测A280nm收集羧肽酶B吸收峰。
5.根据权利要求4的羧肽酶B的制备方法，其特征在于疏水层析介质为OctylSepharose 4 Fast Flow，缓冲液pH8.0；阴离子交换层析介质为DEAE SepharoseFast Flow，缓冲液pH7.5，线性流速18-24cm/hr。
6.稳定的羧肽酶B组合物，包括羧肽酶B，其特征在于还包括3-5％(重量体积比，g/100ml)的甘露醇。
7.根据权利要求6所述的羧肽酶B组合物的制造方法，其特征在于根据权利要求4纯化羧肽酶B，收集含有羧肽酶B的洗脱液，然后加入3-5％(重量体积比，g/100ml)的甘露醇，冷冻干燥即得稳定的羧肽酶B组合物。
8.根据权利要求6所述的羧肽酶B组合物的制造方法，其特征在于根据权利要求5纯化羧肽酶B，收集含有羧肽酶B的洗脱液，然后加入3-5％(重量体积比，g/100ml)的甘露醇，冷冻干燥即得稳定的羧肽酶B组合物。
9.根据权利要求7所述的羧肽酶B组合物的制造方法，其特征在于含有羧肽酶B的洗脱液经过超滤浓缩，然后加入3-5％(重量体积比，g/100ml)的甘露醇，冷冻干燥即得。
10.根据权利要求8所述的羧肽酶B组合物的制造方法，其特征在于含有羧肽酶B的洗脱液经过超滤浓缩，然后加入3-5％(重量体积比，g/100ml)的甘露醇，冷冻干燥即得。
全文摘要
本发明一种羧肽酶B的制备方法及其组合物涉及酶学、含有酶的组合物及分离或纯化方法技术领域。本发明所要解决的技术问题是提供一种羧肽酶B的制备方法及其组合物以解决现有技术中羧肽酶B制备方法得率低及羧肽酶B不稳定的缺陷。公开了一种制备羧肽酶B的方法，包括盐析、疏水层析和阴离子交换层析的步骤，其特征在于用1～5倍量丙酮处理2～3次，制成丙酮粉；并公开了一种含有3－5％(重量体积比，g/100ml)甘露醇的羧肽酶B组合物。该发明羧肽酶B的得率达60U/g胰脏以上，收率提高了20％以上，羧肽酶B的比活性大于200U/mg，羧肽酶B稳定性2年。
文档编号C12N9/48GK1948471SQ20051003039
公开日2007年4月18日 申请日期2005年10月11日 优先权日2005年10月11日
发明者李显林, 杨炜, 王伟刚, 曹雪梅, 温传彬 申请人:江苏万邦生化医药股份有限公司, 上海复星医药(集团)股份有限公司