一种促进组织工程骨血管化的microRNA及其应用

一种促进组织工程骨血管化的 microRNA 及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种促进组织工程骨血管化的microRNA 及其应用。
【背景技术】
[0002] 骨创伤与骨肿瘤导致的大面积骨缺损高发，迫使骨科的医生及相关学科的工作者 一直努力寻求合适、有效的移植物加以修复。组织工程骨以其良好的生物安全性、可塑性以 及不受供体来源限制等多发面的优势越来越成为研宄的热点。组织工程骨构建主要是种子 细胞与支架材料复合的过程。但是，目前组织工程骨的临床应用却面临着诸多的难题，其 中，所面临的最大的障碍是移植骨在短期内无法获得充足血供而导致大部分种子细胞会因 为缺乏营养支持而死亡。因此，促进组织工程骨的血管化能力是目前亟待解决的问题。
[0003] 研宄证实：对支架材料采用促血管生长因子（VEGF)等细胞因子修饰的方法可以 有效的促进移植区血管的生长。但是，单纯使用VEGF诱导会因无法形成成熟稳定的新生血 管而发生血管渗漏。因此，有必要采用一种混合多种发挥不同功能的生长因子的修饰方案， 即既包括促进血管生成同时也含有稳定血管结构的生长因子，这些生长因子除VEGF外还 应包括：血管生成素（ANG-1)、肝细胞生长因子（HGF)、胎盘生长因子（PGF)、血小板衍生生 长因子-BB(H)GF-BB)以及转化生长因子（TGF-0)等。有学者采用一种可控的缓释系统可 将以上生长因子都释放至移植物中从而同时产生诱导作用，但该缓释系统阻碍了在移植区 血管生成中发挥主要作用的宿主来源的血管内皮细胞向移植物的迀移，因此并未产生理想 的促进血管化的作用。通过蛋白质修饰的手段促进干细胞的定向分化与组织工程骨的构建 大多会因为生长因子的浓度过高或过低而不能达到理想的修复效果，相比较而言，通过基 因如RNA修饰的方法能够通过调控基因表达而更加精细的调节生长因子的分泌，从而达到 更为理想的修复效果。
[0004]MicroRNA(microRNA)与siRNA同为小片断非编码RNA，它们都做为转录后调控 因子广泛存在于真核生物中，在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作 用。自发现以来越来越多的引起研宄人员的关注。microRNA与siRNA同可作为干扰性的 RNA(RNAi)通过调节和关闭基因的表达进而调控细胞的各种高级生命活动。RNAi的发现不 仅提升了人们对RNA分子的认识，还大大推进基因功能的研宄，更为各种类型的传染病和 癌症提供了一种新的手段。近年来，有关RNAi研宄成果令人眼花缭乱：人们利用RNAi途径 来人为调节特定基因的表达以达到治疗遗传疾病甚至癌症的目的，而且已经有不少的成功 信息公布。
[0005] 近期研宄发现，microRNA对血管的发育也起着关键的调控作用。由于一个 microRNA可以调控数以万计的靶基因，因此，一个microRNA便可以通过与多条与血管形成 相关的信号通路作用从而同时调控VEGF、ANG-1、HGF、H)GF-BB等多个生长因子的表达。目 前已知资料证明：对骨组织发育起重要影响作用的mir26a在多条血管相关的信号通路也 具有正向调节作用，可以同时促进VEGF、ANG-1与HGF的表达，从而促进移植骨的血管化能 力。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于提供一种促进组织工程骨血管化的microRNA及其应用。
[0007] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0008] 一种促进组织工程骨血管化的microRNA，所述microRNA为miR_26a，序列如SEQ. ID.NO. 1 所示。
[0009] miR-26a在制备促进组织工程骨血管化的药物中的应用。
[0010] 所述的药物为诱导促血管生长因子VEGF表达的药物。
[0011] 所述的药物为诱导促血管生长因子ANG-1表达的药物。
[0012] 所述的药物为诱导VEGF和ANG-1同时表达的药物。
[0013] 所述的药物为增加血管官腔面积的药物。
[0014] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0015] 本发明公开了一种促进组织工程骨血管化的microRNA及其应用，该microRNA为 miR-26a，序列如SEQ.ID.NO. 1所示。本发明利用小鼠颅骨缺损再生模型，在新生骨中发现 了miR_26a的优势表达，经过体外将miR_26amimics及inhibitor转入细胞实现miR_26a 的表达上升及下降之后，在三个成骨相关的细胞模型中进行miR-26a对血管生成相关的生 长因子调节作用的体外观察，利用体内原位骨缺损与异位骨再生模型进行了miR-26a促血 管化作用的进一步体内验证。证实本发明的促进组织工程骨血管化的miR-26a具有以下优 势：
[0016] 1、本发明公开的miR_26a，克服了蛋白质性的生长因子半衰期短，价格昂贵，以及 难以保持生物活性以发挥持续有效地作用这一缺点。
[0017] 2、本发明公开的miR_26a，其转染方式生物安全性高，克服了以往通过病毒做为载 体促进某基因表达的缺陷，因为病毒被认为会引起人体内的免疫系统的反应而对人体造成 伤害。
[0018] 3、本发明公开的miR-26a，是通过内源性的调控从而引起一系列的基因表达的变 化，这种内源性调节能够最大程度的模拟机体自身血管成长的微环境，克服了以往通过机 械的外源性的干涉如通过VEGF基因转染或人工合成的siRNA干涉所引起的形成血管不稳 定，血管渗漏的现象。
【附图说明】
[0019] 图1是新生骨组织提取总RNA后观察到miR-26a的表达结果图；
[0020] 图2是miR-26a的表达对促血管生长因子VEGF表达量影响结果图；
[0021] 图3是miR-26a的表达对促血管生长因子ANG-1表达量影响结果图；
[0022] 图4是miR-26a的表达对促血管生长因子VEGF蛋白水平表达电泳图；
[0023] 图5是miR-26a的表达对促血管生长因子ANG-1蛋白水平表达电泳图；
[0024] 图6是在体外管腔形成实验miR_26a促进血管的生长显微镜照片；
[0025] 图7是在体内异位成成血管模型中miR_26a促进血管生长的切片染色照
[0026]片。
【具体实施方式】
[0027] microRNA(microRNA)是一类真核生物内源性的小分子单链RNA，通常为18~25bp 长，能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，从而对基因 进行转录后的表达调控，是RNA干涉中一种重要的分子工具。近几年来，在动物细胞和植物 组织中，上百种miRNA被陆续发现，这些小分子调控RNA是从60~200bp的具有发夹状结 构的前体中被切割出来而成熟的。
[0028] 在动物细胞中，microRNA基因的转录初产物（pri-miRMA)很快被核糖核酸酶 IIlDrosha(RNaselllDrosha)加工成为microRNA前体（pre-miRNA)，然后由细胞核转运至细 胞质中，经另一种RNaseIIIDicer识别剪切为成熟microRNA。这些成熟的microRNA其他蛋 白质一起组成RISC复合体（RNA-inducedsilencingcomplex)，与革EmRNA特异性的碱基配 对识别，从而引起靶mRNA的降解或者翻译抑制。
[0029] miRNAmimic是化学修饰的小分子RNA片段模拟细胞中内源性成熟miRNA，可以增 强内源性miRNA的表达从而促进其调控作用，化学合成的方法合成miRNAinhibitors，可 以特异的革G向和敲除单个的microRNA分子，从而削弱内源microRNA的表达，是microRNA 功能研宄重要手段。
[0030] microRNA做为转录后调节因子，其作用机制的发挥是通过与一组蛋白反应结合形 成RNA-蛋白复合物，被称为miRNA诱导沉默复合物。在miRNA诱导沉默复合物中，一条 成熟的单链miRNA保留在这一复合体中，它能识别位于靶mRNA上3'端非编码区的结合位 点。加工成熟后miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体降解mRNA或阻碍其翻 译，具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能。miRNA以及RNA-蛋白 质复合物在动物机体中广泛表达，具有组织特异性和时序性，决定着组织和细胞的功能特 异的调节过程中起重要作用。
[0031] MAPK/ERK信号通路在血管方向分化中其关键调节作用的，其作用机制主要通过 MAPKs的三级酶促级联反应，即上游激活蛋白一MAPK激酶的激酶（MAPKKK) -MAPK激酶 (MAP-KK) -MAPK。在ERKs的传递途径中Ras作为上游激活蛋白，Raf作为MAPKKK，MAPK/ ERK激酶（MEK)作为MAPKK，ERK即MAPK，即Ras-Raf-MEK-ERK途径，酸化激活的ERK1/2 由 胞质转位到核内，进而调节多种成血管相关的生长因子（VEGF，FGF，H)GF)的表达。PTEN做 为该通路的抑制因子通过抑制ERK的激活为抑制血管分化。PTEN被证明为miR-26a的靶向 蛋白，因此，做为对成血管信号通路中的信号蛋白具有调节作用的miR-26a，在血管方向的 分化也具有重要的调节作用。
[0032] 本发明提供一种促进组织工程骨血管化的microRNA及其应用，所述microRNA为 miR_26a，序列为 5'uucaaguaauccaggauaggcu3'（如SEQ.ID.NO. 1 所示）。本发明利用小鼠 卢页骨缺损再生模型，在新生骨中发现了miR_26a的优势表达，经过体外将miR_26amimics 及inhibitor转入细胞实现miR-26a的表达上升及下降之后，在三个成骨相关的细胞模型 中进行miR-26a对血管生成相关的生长因子调节作用的体外观察，利用体内原位骨缺损与 异位骨再生模型进行了miR-26a促血管化作用的进一步体内验证。具体步骤如下：
[0033] 1)构建小鼠下肢缺血再灌注模型，不做任何处理，3个月后将新生组织取材并 提取总RNA，利用qRT-PCR对与成血管关系密切的microRNA的表达进行对比分析，发现 miR-26a在新生血管中呈明显的优势表达；
[0034] 2)通过小干扰RNA转染技术，将miR_26amimics与inhibitor