非小细胞肺癌标记物,其检测方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种非小细胞肺癌标记物及其应用，尤其涉及使 用包括至少两种选自四种在人血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体作 为非小细胞肺癌标记物，进一步地，本发明还提供了用于检测所述非小细胞肺癌标记物的 探针组合、试剂盒和生物芯片以及所述非小细胞肺癌标记物的应用，具体地，通过检测受试 者血清中所述标记物的表达水平和变化，达到在体外辅助诊断非小细胞肺癌，预测并发症 发生及癌症复发几率，以及非小细胞肺癌的预后等效果。
【背景技术】
[0002] 在全球范围内，肺癌是发病率和死亡率都最高的癌症。中国的肺癌发病率高于全 球平均水平。
[0003] 根据统计数据，2009年，在中国肿瘤登记地区，肺癌的粗发病率为54. 75/10万(男 性为73. 12/10万并且女性为36. 08/10万；城镇人口中为57. 96/10万并且农村人口中为 42. 80/10万)。中国人口（CASR)和世界人口（WASR)的发病年龄标准化率分别为24. 98/10 万和34. 07/10万。在中国和城镇地区，这是最常见的癌症，在农村地区为第二常见的癌症。 肺癌粗死亡率为46. 07/10万（男性为62. 47/10万并且女性为29. 39/10万；城镇人口中为 48. 76/10万并且农村人口中为36. 03/10万)。CASR和WASR的死亡率分别为20. 09/10万 和27. 68/10万。在男性和女性中，城镇地区和农村地区，肺癌均为癌症死亡的首要原因。 对于肺癌的发病率和死亡率，男性高于女性，城市地区高于农村地区。年龄特异性发病率 和死亡率表明，在50岁之前，发病率和死亡率相对较低，随后显著增加，并在80-84年龄组 达到峰值（Chen,W.，Zheng,R.，Zhang,S.，Zou，X.，Zhao,P.andHe,J. (2013)，Lungcancer incidenceandmortalityinChina, 2009.ThoracicCancer, 4:102 - 108. )〇
[0004] 其中，非小细胞肺癌为最常见的肺癌病理类型，约占肺癌总数的85%。而针对肺癌 来说，准确的早期诊断是取得良好治疗效果的关键。
[0005] 但是，现有的肺癌诊断技术仍不理想。非小细胞肺癌的传统诊断方法，包括影像 学、支气管镜、肺组织活检等，由于这些技术各自的局限性，在实际应用中通常还需多项技 术合并使用，反复检测。
[0006] 肺癌的影像分析诊断方法，包括超声、胸部X线、胸部CT、PET显像等。超声为常规 无创伤性检查，但仅对周围型肺部肿块的诊断效果最好。一些发病率低、早期胸部X线、CT 表现和临床表现均缺乏特征性的病例，如细支气管肺泡癌（BAC，NSCLC的一种)，其被误诊或 漏诊的概率相当高。为提高诊断准确率，还需将纤维支气管镜检查与CT引导下活体组织检 查相结合使用。CT检查的敏感度、特异度、准确度都较低，其应用的基于结节体积的判读体 系存在局限，常导致误诊。PET技术存在固有缺陷，包括无法检测肿瘤体积及其对胸壁、纵膈 及其他临近组织的浸润程度，故常与成熟的CT技术联用。PET/CT联用，方可提高敏感度、特 异度、准确度。纤维支气管镜肺活检被认为是一种安全简便的检测肺疾病的方法，但是其对 不同病因确诊率不一，对部分肺疾病也难以提供有价值的诊断信息。为弥补影像分析技术 的不足，还常联用穿刺活检技术。但穿刺活检的诊断准确率也有限，且受病变类型和部位影 响很大。
[0007] 现在，越来越多的疾病标记物已经被发现并应用于临床疾病的普查、诊断和疗效 的监控，但是它们的临床应用效果还存在着明显不足。例如，肿瘤标记物甲胎蛋白，乳酸脱 氢酶，癌胚抗原等已被广泛应用于临床，但是这些疾病标记物还远远不能满足对癌症早期 诊断的需要，其主要原因有两个方面：（1)上述疾病标记物的灵敏度和特异性相对较低，它 们的检测结果还不能作为疾病确诊的指标；（2)疾病的早期诊断率应与治疗的效果呈现正 相关，而上述任何一种疾病标记物还难以满足疾病的早期诊断的这种要求。以癌症为例，由 于存在着肿瘤分化类别特异性过强、肿瘤整体敏感性较低、送检标本难以反复采取、标本保 存要求条件高等缺陷，同时价格昂贵，因此在现有条件下难以广泛推广应用现有的肿瘤标 记物。
[0008] 目前，临床常用的检测肺癌的5种血清肿瘤标志物包括NSE、pm-GRP、CYFRA21-1、 P53抗体和CEA，但即使优化联合使用数种标志物，检测的敏感性、特异性和有效性都有限。
[0009] 微小核糖核酸（microRNA，简写作miRNA)，是一类长约19至23个核苷酸的非编码 单链小核糖核酸分子。它们在进化上高度保守，广泛存在于动植物细胞中。近五年来在人 类、小鼠、大鼠等多种生物物种中鉴别出数百种微小核糖核酸分子。
[0010] 微小核糖核酸通过识别靶mRNA的3'端非翻译序列，与之不完全互补，从而抑制靶 mRNA的翻译，是mRNA强有力的调节因子，并在基因表达调控领域中起重要作用。
[0011] 微小核糖核酸与动物的许多正常生理活动密切相关，与许多疾病的发生及发展 存在密切联系。疾病发生时，总有一些微小核糖核酸表达量是上调的，一些是下调的。最 近研究发现，慢性淋巴细胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中几种微小核糖核酸的表达水 平均有不同程度的下调（LawrieCH,GalS,DunlopHMetal.Detectionofelevated levelsoftumor-associatedmicroRNAsinserumofpatientswithdiffuselarge B-celllymphoma.BrJHaematol2008; 141:672 - 675);分析比较人肺癌、乳腺癌组织中 微小核糖核酸表达时，发现有若干组织特定的微小核糖核酸的表达水平相对于正常组织 发生了变化（GarofaloM，QuintavalleC，DiLevaGetal.MicroRNAsignaturesof TRAILresistanceinhumannon-smallcelllungcancer. 0ncogene2008)〇 也有石开究 证明微小核糖核酸影响了心肌肥厚、心衰、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生和发展并且 与II型糖尿病等代谢性疾病有密切关联（TryndyakVP，RossSA，BelandFA，Pogribny IP.Down-regulationofthemicroRNAsmiR-34a,miR-127,andmiR_200binrat liverduringhepatocarcinogenesisinducedbyamethyl-deficientdiet.Mol Carcinog. 20080ct21)。
[0012] 这些结果提示微小核糖核酸表达与疾病发生和发展之间存在必然联系。微小核糖 核酸完全可以作为一类新的疾病标志物，相比于传统的病理切片或单一使用的生化指标等 手段，能更加准确地辅助诊断疾病，判断疾病的发展阶段，预测并发症发生和恶性疾病复发 的几率，以及疾病的预后，并评价药效和疗效。
[0013] 微小核糖核酸在作为疾病标志物方面的优势，使其成为近年研究的热点，相关技 术及产品也相继涌现。
[0014] 2011年，RosettaGenomics推出了miRview衣:ilung诊断服务，该诊断技术通过 检测受试者肺部组织样本，对受试者所患肺癌进行分型，以辅助制定治疗方案。
[0015] 在专利号为200980148847. 1的在先申请中，公开了微小核糖核酸在血清/血浆 中稳定存在，且可作为生物标记物，协助诊断包括非小细胞肺癌在内的疾病，并公开了以26 种微小核糖核酸中任意一种或多种的组合作为非小细胞肺癌辅助诊断方法的申请。但是该 申请需要使用的标记物的种类多，相应的探针库比较大，并且准确率还不够理想。因此，在 该申请的基础上，发明人继续研究并形成了本申请的技术方案。与在先申请相比，本申请中 的标记物种类大大减少，相应的探针库得到极大简化，同时还能实现高诊断准确率。
【发明内容】
[0016]为克服上述缺陷，本申请人将研究目光投向较易获得，甚至常规体检中就可以收 集到的血液。由于血液会循环至全身所有组织，并向细胞输送营养并清除废物，因此血液能 够反映出整个机