r>[0057] 所述核糖核酸酶保护分析方法包括如下步骤：（1)进行反义RNA探针的合成，同位 素标记与纯化；（2)收集血清/血浆样本并提取RNA; (3)将提取后的RNA溶解在杂交缓冲 液中并加入反义RNA探针进行杂交反应；（4)加入RNase消化液进行反应；（5)进行电泳与 放射自显影；（6)分析结果。
[0058] 所述Solexa测序技术方法方法包括如下步骤：（1)收集血清/血浆样本；（2)通 过Trizol试剂提取血清/血浆总RNA; (3)进行PAGE电泳回收17-27ntRNA分子；（4)将 adaptorprime酶联在小RNA分子的3'与5'端；（5)进行RT-PCR反应后并进行测序；（6) 数据分析与处理。
[0059] 所述生物芯片方法包括如下步骤：（1)将全部五百多种人微小核糖核酸成熟体库 点阵并制备生物芯片；（2)收集血清/血浆样本；（3)提取血清/血浆总RNA; (4)通过柱分 离来分离微小核糖核酸；（5)利用T4RNA连接酶进行微小核糖核酸荧光标记；（6)与生物芯 片进行杂交反应；（7)数据检测与分析。
[0060] 本发明通过上述的反转录PCR，实时定量PCR,Northern印记杂交方法，核糖核酸 酶保护分析方法，Solexa测序技术和生物芯片等方法分析在非小细胞肺癌发生中血清/血 浆微小核糖核酸的变化趋势及变化量，以及它们与非小细胞肺癌的相关性。
[0061] 本发明也提供一种预测、诊断和/或评价非小细胞肺癌的方法，该方法包括检测 上述标记物，优选地，该方法包括采用上述检测方法检测上述标记物。
[0062] 本发明提供了上述非小细胞肺癌标记物在制备预测、诊断和/或评价非小细胞肺 癌的试剂或工具中的用途。
[0063] 本发明还提供了一种用于检测非小细胞肺癌标记物的微小核糖核酸探针组合，也 即预测、诊断和/或评价非小细胞肺癌的小核糖核酸探针组合，所述探针组合包括以下核 苷酸序列所示的探针中的两种或多种，如2、3、4种；优选地所述探针组合为SEQIDN0. 3和 5￡〇10勵.4的组合、5￡〇10勵.1与5￡〇10勵.2中的至少一种和5￡〇10勵.3和5￡〇10 N0. 4中的至少一种的组合。
[0064]表 1
【主权项】
1. 一种非小细胞肺癌标记物，所述标记物包括以下在人体血清/血浆中稳定存在且可 检测的微小核糖核酸成熟体中的两种或多种，如2、3、4种：miR-7、miR-25、miR-193a-3p， miR-483_5p。
2. 根据权利要求1所述的非小细胞肺癌标记物，其中，所述标记物为miR-193a-3p和 miR-483-5p的组合或miR-7与miR-25中的至少一种和miR-193a-3p和miR-483-5p中的至 少一种的组合。
3. -种根据权利要求1或2所述的标记物的检测方法，其特征在于，所述检测方法选 自反转录聚合酶链式反应方法（RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链式反应方法（Real-time PCR)、微滴式数字 PCR 方法（Droplet Digital PCR)、Northern 印迹杂交方法（Northern blotting)、核糖核酸酶保护分析方法（RNase protection assay)、Solexa测序技术 (Solexa sequencing technology)、生物芯片方法和新一代测序方法（Next Generation Sequencing)中的一种或几种； 优选地，所述检测方法为RT-PCR方法，例如包括以下步骤的RT-PCR方法： 1) 提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受 试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品； 2) 用微小核糖核酸设计引物进行PCR反应； 3) 进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳； 4. EB染色后在紫外灯下观察结果； 或者优选地，所述检测方法为Real-time PCR方法，例如包括以下步骤的Real-time PCR方法： 1) 提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受 试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品； 2) 用微小核糖核酸设计引物； 3) 加入荧光探针进行PCR反应； 4) 检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变化； 或者优选地，所述检测方法为Droplet Digital PCR方法，例如包括如下步骤的 Droplet Digital PCR 方法： 1) 提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受 试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品； 2) 对样品进行微滴化处理； 3) 用微小核糖核酸设计引物； 4) 加入荧光探针进行PCR反应； 5) 检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变化； 或者优选地，所述检测方法为RT-qPCR方法，例如包括如下步骤的RT-qPCR方法： 1) 提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受 试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品； 2) 对样品进行预扩增； 优选地，所述预扩增包括以下步骤： a)配制含除cDNA和引物以外试剂的预扩增PCR体系母液，份数依逆转录得到的cDNA 的份数来定； b) 取母液混合物放入PCR反应管中，加入对应的引物(包含正向引物、反向引物）及逆 转的cDNA，组成20ill的反应体系，混合均匀； c) 将20ill的混合物进行PCR预扩增； 优选地，所述扩增条件为95°ClOmin，一个循环；95°C15s，60°Clmin，12个循环； 3)qRT-PCR反应，并对待测的miRNA进行定量； 优选地，所述RT-qPCR方法中，使用ACT法处理数据，其中每个miRNA相对于标准内参 的表达量用方程2_ACT表示，ACT=CT样品-CT内参。
4. 根据权利要求1或2所述的标记物在制备预测、诊断和/或评价非小细胞肺癌的试 剂或工具中的用途。
5. -种用于检测非小细胞肺癌标记物的微小核糖核酸探针组合，所述探针组合包括以 下核苷酸序列所示的探针中的两种或多种，如2、3、4种；
6. 根据权利要求5所述的探针组合，其中所述探针组合为SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4 的组合、SEQIDNO. 1与SEQIDNO. 2中的至少一种和SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4中的 至少一种的组合。
7. -种用于检测非小细胞肺癌标记物的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括检测根据 权利要求1或2所述的标记物的工具。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述工具包括根据权利要求5或6所述 的探针组合；优选地，所述工具还包括聚合酶、脱氧核糖核苷酸。
9. 一种用于检测非小细胞肺癌标记物的生物芯片，其特征在于，所述生物芯片包括检 测根据权利要求1或2所述的标记物的元件。
10. 根据权利要求9所述的生物芯片，其中所述元件包括根据权利要求5或6所述的探 针组合。
【专利摘要】本发明提供一种非小细胞肺癌标记物及其应用。本发明所提供的非小细胞肺癌标记物包括在人体血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体中的两种或多种，如2、3、4种：miR-7、miR-25、miR-193a-3p，miR-483-5p。本发明还提供了用于检测非小细胞肺癌标记物的探针组合、试剂盒和生物芯片。此外，本发明还提供了一种检测肺癌病人血清中的微小核糖核酸的方法，通过肺癌病人血清中的微小核糖核酸的变化，在体外诊断非小细胞肺癌、预测非小细胞肺癌发病过程，判断并发症的发生，非小细胞肺癌复发的几率，及非小细胞肺癌的预后，并分析药效和疗效。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104694534
【申请号】CN201310666508
【发明人】张辰宇, 曾科, 张春妮, 陈熹, 王成
【申请人】江苏命码生物科技有限公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2013年12月10日