催化酯化和酯交换的Sn-1,3选择性固定化脂肪酶及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品和酶工程领域。更具体而言，本发明涉及针对兼具酯化、酯交换催 化功能的Sn-1，3选择性脂肪酶的固定化方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 脂肪酶（lipase，EC3. 1. 1. 3)全称为甘油三酰酯水解酶，它能够特异性地在油水 界面上发挥催化活性，在食品、造纸、皮革、洗涤剂、制药等工业上有着巨大的应用。不同菌 种来源的脂肪酶除了催化油脂水解以外，还可以具有催化酯化、酯交换、醇解、消旋体拆分 等功能。然而，天然脂肪酶稳定性差、反应后难以纯化、不能重复利用，这不仅降低了酶的 使用效率，提高了生产成本，而且难以实现连续化操作，限制了其在工业上的应用。通过固 定化技术将酶赋形于具有一定机械强度的载体之上，成为解决上述生产瓶颈的一种有效途 径。
[0003] 固定化酶技术是将游离的酶通过物理或者化学手段将其束缚或限制于一定区域 内，使其仍然能进行特有的催化反应并能回收重复使用的一种技术。由于上述优点，使得很 多科研工作者展开了对固定化酶的细致研究。在1967年，固定化酶首次被应用在拆分氨基 酸工业中。近年来随着有机化学、蛋白质化学、材料科学等的发展，固定化酶技术取得了长 足的进步。
[0004] 在油脂领域里应用最广的固定化脂肪酶分别为：高酯交换能力Sn-1，3专一性强 的固定化脂肪酶；以及用于制备脂肪酸酯的高酯化活力的固定化脂肪酶。通常选择固定 化具备高酯交换活力及Sn-1，3位特异性的脂肪酶，其可选自（但不限于）：疏棉状嗜热 丝抱菌（Thermomyceslanuginose)、米黑根毛霉（Rhizomucormiehei)、米黑毛霉（Mucor miehei)、假单胞菌（Pseudomonassp.)/根霉（Rhizopussp.)、黑曲霉（Aspergillus niguer)及伯克霍尔德氏（Burkholderiasp.)。而对于短链脂肪酸酯合成方面的应用，贝lj选 择诸如（但不限于）：南极假丝酵母B(CandidaAntarcticaB)/南极假丝酵母A(Candida AntarcticaA)、皱裙假丝酵母（Candidarugosa)等。
[0005]CarlaTecelSo等人（"Productionofhumanmilkfatsubstitutesenriched inomega-3polyunsaturatedfattyacidsusingimmobilizedcommerciallipasesand Candidaparapsilosis1ipase/acyltransferasey,,JournalofMolecularCatalysis B:EnZymatic，65(2010) 122-127)研究了以富含棕榈酸的甘三酯和油酸为反应底物，以 LipozymeTLIM(由诺维信（Novozyme)股份公司出品的一种固定化脂肪酶）、LipozymeRM IM、Novozyme435(这三种酶均为诺维信（Novozyme)股份公司出品的固定化脂肪酶）为催化 剂制备0P0(1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯）。研究发现：在2位插入率方面，反应第一 批时Novozyme435表现出较差的专一性，在Sn-2位上插入了较多的油酸（33. 2%摩尔比）， 证明其在酸解的时候没有专一性。并且，研究中还发现在反应一批之后，除了LipozymeRM IM反应10批能仍保持较好活力之外，另外两种酶的剩余酶活随着反应次数的增加都下降 得很快，LipozymeTLM在反应10批后剩余的活力仅为20%左右。
[0006]IgorNascentesdosSantosCorrea等人（"EnzymaticBiodieselSynthesis UsingaByproductObtainedfromPalmOilRefining"，EnzymeResearch, 2011,文章 ID:814507)研究了 以棕榈油脂肪酸脱臭馈出物（PFAD,palmoilfattyaciddistillate) 和短链醇为反应底物，以LipozymeTLM、Lip〇ZymeRM頂为催化剂来制备脂肪酸的单 烷基酯。研究结果发现：以甲醇为酰基供体时，LipozymeRMIM催化生成甲酯的转化率 为52.3%，1^口(《71116 11]催化生成甲酯的转化率为28.8%，证明了1^口〇271116 11]和 LipozymeRMIM不适合催化酯化反应。
[0007]Hernandez-MartInE等（"Differentenzymerequirementsforthe synthesisiofbiodieselNovozyme435andLipozymeTLIM，',BioresourceTechnology, 99(2008)277-286)揭示了以甘三酯为底物、10%W/W的酶添加量反应24h，LipozymeTL頂 反应一次以后第二次仅剩10%的酶活。这说明LipozymeTL頂在重复使用性上存在很大 局限。
[0008]MohamedM.Soumanou等(Improvementinlipase-catalyzedsynthesisof fattyacidmethylestersfromsunfloweroil,enzymeandMicrobialTechnology, 33 (2003) 97-103)揭示了以葵花籽油为底物，分批添加甲醇，反应24h，LipozymeTL頂经 过8批反应后活力仅剩下不到30%。该研究结果进一步验证了Herndndez-MartinE等人的 观点。
[0009]目前很多固定化脂肪酶的方法都是以高分子树脂为载体，通过一定的技术手段将 脂肪酶负载于树脂之上。例如，专利公告号为EP0140542B1的专利中描述了一种关于将米 黑根毛霉产脂肪酶固定于大孔弱碱性阴离子交换树脂上，并将其用于酯交换或者酸解反 应。谢志东等（"聚丙烯酸甲酯类大孔树脂对猪胰脂肪酶的固定化研究"，离子交换与吸附， 1995,11 (1)，24~29)以自己合成的大孔丙烯酸甲酯-二乙烯苯交联共聚物为载体对猪胰 脂肪酶进行了固定化，并对其水解活力进行了考察。
[0010] 虽然现有技术中对脂肪酶的固定化有一定的研究，但现在面临的最大挑战是：到 目前为止还没有一种固定化酶可同时催化酯交换及酯化反应，并且还具有较强的专一性， 这就限制了固定化酶在油脂加工业，如生物柴油、功能性油脂、精细化工品中的应用。
[0011] 因此，本领域中迫切需要开发出可同时催化酯交换及酯化反应、且还具有较强的 专一性的固定化酶及其制备方法。
【发明内容】
[0012] 本发明的主要目的就在于提供可同时催化酯交换及酯化反应、且还具有较强的专 一性（如Sn-1选择性）的固定化酶及其制备方法。本发明的另一目的在于提供本发明的 固定化酶在催化酯交换、酯化、酸解和/或醇解反应中的应用，以及采用本发明的固定化酶 催化这些反应的方法。本发明中还提供了包含本发明固定化脂肪酶的试剂盒或产品。此 外，本发明的另一目的还在于提供碱性离子交换树脂载体在制备本发明固定化脂肪酶中的 应用。
[0013] 在本发明的第一方面中，提供了一种固定化脂肪酶，其包含：
[0014] (a)载体，其中所述载体的功能基团是与C8_15的烷烃末端连接的伯胺基，所述功能 基团含量为〇? 5~6mmol/g，孔径分布为12~80nm;
[0015] (b)固定于所述载体的脂肪酶。
[0016] 在一些实例中，所述载体的功能基团含量为1~5mmol/g，孔径分布为15~60nm, 优选的，所述载体的粒径分布为〇. 1~〇. 4mm，优选为0. 15~0. 3mm，比表面积为100~ 600m2/g，优选为 150 ~500m2/g。
[0017] 在一些实例中，所述载体是碱性离子交换树脂载体，优选弱碱性离子交换树脂载 体。
[0018] 在本发明的一些实例中，所述载体的骨架为聚丙烯酸酯型或苯乙烯型骨架。
[0019] 在另一些实例中，所述载体为弱碱性丙烯酸离子交换树脂或弱碱性聚苯乙烯离子 交换树脂。
[0020] 在另一些实例中，所述载体由选自下组的材料制成：丙烯酸酯的交联聚合物；交 联聚甲基丙烯酸甲酯；甲基丙烯酸酯、顺丁烯二酸二甲酯、乙酸烯丙酯、丙烯腈或甲基乙烯 基甲酮与苯乙烯或二乙烯苯的共聚物；丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯与双甲基丙烯酸乙二醇酯 的交联共聚物；或苯乙烯与二乙烯苯的共聚物。
[0021] 在另一些实例中，所述载体为丙烯酸甲酯-二乙烯苯共聚物或苯乙烯与二乙烯苯 的共聚物。
[0022] 在一些实例中，所述碱性离子交换树脂是弱碱性丙烯酸离子交换树脂，优选的，所 述弱碱性丙烯酸离子交换树脂采用以下方法制备：（i)制备丙烯酸类化合物-二乙烯苯的 共聚物；（ii)溶胀所述共聚物，并对其进行胺化。
[0023] 在另一些实例中，所述碱性离子交换树脂是由丙烯酸甲酯（或丙烯酸羟乙酯、丙 烯酸环氧丙酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯，甲基丙烯酸环氧丙酯）与二乙烯苯以 20:1~1:1的质量比（优选15:1~10:1)，在致孔剂（例如甲苯和液蜡的混合物、或汽油、 正庚烷、乙酸丁酯、1，2_二氯乙烷）与引发剂（）过氧化苯甲酰、偶氮二异丁氰、或过硫酸 钾）存在的情况下聚合，其中的共聚物与致孔剂的比例为3:1~1:3 (优选3:2~3:4)，引发 剂为上述体系的〇. 1%(质量比）。上述单体的聚合温度范围为60~100°C，优选65~85°C。 所得共聚物与溶胀剂（N，N-二甲基甲酰胺、硝基苯、二氯甲烷、二氯乙烷、二硫化碳、二氧六 环或其混合物）以1:1~1:15的体积比（优选1:2~1:10)进行溶胀，溶胀条件可为：室 温下，共聚物在溶胀剂中浸泡，溶胀4~24小时，优选6~16小时。将共聚物与1，8_辛二 胺以共聚物中甲酯键与1，8-辛二胺的摩尔比以1:1~1:10(优选1:2~1:5)的比例，在 100~150°C(优选120~140°C)下胺化，胺化反应时间为4~24小时（优选8~12小 时）。
[0024] 在一些实例中，所述碱性离子交换树脂是弱碱性聚苯乙烯离子交换树脂，优选的， 所述弱碱性聚苯乙烯离子交换树脂采用下述方法制备：（i'）制备聚苯乙烯微球；（ii'）溶 胀所述微球，并对其进行氯酰化；（iii'）溶胀所述氯酰化树脂微球，并对其进行胺化。
[0025] 在一些实例中，所述碱性离子交换树脂是由苯乙烯、二乙烯苯和致孔剂（如，甲苯 和液蜡的混合物、或汽油、正庚烷、乙酸丁酯、1，2-二氯乙烷，优选甲苯和液蜡2:1体积比的 混合物）在引发剂（如过氧化苯甲酰、偶氮二异丁氰、过硫酸钾，优选过氧化苯甲酰）的存 在下制备聚苯乙烯微球。其中，苯乙烯与二乙烯苯的质量比为5:1~1:2,优选3:1~1:1 ; 苯乙烯和二乙烯苯与致孔剂的质量比为1:1~1:6,优选1:1. 5~1:4。上述单体的聚合温 度范围为60~95°C，优选80~90°C。聚合时间范围为4~10小时，优选6~8小时。所 得聚苯乙烯的微球在1:1~1:15体积比，优选1:2~1:10的溶胀剂（优选但不限于二氯 甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、硝基苯、二氯甲烷、二氯乙烷、二硫化碳、二氧六环或其混合物） 中溶胀。溶胀条件为：室温下，共聚物在溶剂中浸泡，溶胀4~24小时，优选6~16小时。 上述微球中的亚苄基与9-氯壬酰氯的摩尔比为1:0. 1~1:2,优选1:0. 2~1:1，9_氯壬 酰氯与催化剂（无水氯化锌、无水氯化锡，优选无水氯化铝）的摩尔比为1:0. 1~1:2,优 选1:0.2~1:1，在30~751：(优选35~50°〇下进行氯酰化，反应时间2~1211，优 选3~8h。将所得的氯酰化树脂微球在1:1~1:15体积比（优选1:2~1:10)的溶胀剂 (N，N-二甲基甲酰胺、硝基苯、二氯甲烷、二氯乙烷、二硫化碳、二氧六环或其混合物）存在 下溶胀4~10小时，优选6~8小时。与