体的生理、病理状况，其检测结果对人体健康具有指导意义。
[0017] 通过上述对血清/血浆微小核糖核酸与非小细胞肺癌的相关性的研究，发明人提 出了以血清/血浆中稳定存在的特定微小核糖核酸作为非小细胞肺癌检测标记物，建立一 种体外检测血清/血浆中稳定存在的特定微小核糖核酸的方法，通过检测特定微小核糖核 酸的特异性变化来进行非小细胞肺癌的早期诊断，疾病鉴定和病程监控，复发及预后、并发 症发生的预测，同时可以进一步进行药效判定，用药指南，个体化治疗，中药有效成份筛选， 种群分类等研究。
[0018] 因此，本发明的目的是提供一种在人体血清/血浆中稳定存在的，可用于检测非 小细胞肺癌的标记物。
[0019] 本发明的另一个目的是提供一种用于检测非小细胞肺癌标记物的探针组合。
[0020] 本发明的又一个目的是提供一种检测上述非小细胞肺癌标记物的方法。
[0021] 本发明的另一个目的是提供上述非小细胞肺癌标记物的用途，包括制备相应的试 剂盒和生物芯片。
[0022] 本发明的再一个目的是提供使用上述标记物预测、诊断和/或评价非小细胞肺癌 的方法。
[0023] 本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。
[0024] -方面，本发明提供一种非小细胞肺癌标记物，所述标记物包括以下在人体血清/ 血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体（MaturemicroRNA)中的两种或多种，如 2、3、4 种：miR-7、miR-25、miR-193a-3p，miR-483-5p，优选地所述标记物为miR-193a-3p和 mir-483-5p的组合、miR-7 与miR-25 中的至少一种和miR-193a_3p和mir-483_5p中的至 少一种的组合。
[0025] 另一方面，本发明提供了一种上述标记物的检测方法，所述检测方法选自反转 录聚合酶链式反应方法（RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链式反应方法（Real-timePCR)、 微滴式数字PCR方法（DropletDigitalPCR)、Northern印迹杂交方法（Northern blotting)、核糖核酸酶保护分析方法（RNaseprotectionassay)、Solexa测序技术 (Solexasequencingtechnology)、生物芯片方法和新一代测序方法（NextGeneration Sequencing)中的一种或几种。
[0026] 优选地，所述检测方法为RT-PCR方法，例如包括以下步骤的RT-PCR方法：
[0027] 1)提取受试者的血清/血楽总RNA,通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收 集受试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；
[0028] 2)用微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；
[0029] 3 )进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
[0030] 4)EB染色后在紫外灯下观察结果；
[0031] 或者优选地，所述检测方法为Real-timePCR方法，例如包括以下步骤的 Real-timePCR方法：
[0032] 1)提取受试者的血清/血楽总RNA,通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收 集受试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；
[0033] 2)用微小核糖核酸设计引物；
[0034] 3)加入突光探针进行PCR反应；
[0035] 4)检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变 化。
[0036] 或者优选地，所述检测方法为DropletDigitalPCR方法,例如包括如下步骤的 DropletDigitalPCR方法：
[0037] 1)提取受试者的血清/血楽总RNA,通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收 集受试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；
[0038] 2)对样品进行微滴化处理；
[0039] 3)用微小核糖核酸设计引物；
[0040] 4)加入突光探针进行PCR反应；
[0041] 5)检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变 化。
[0042] 或者优选地，所述检测方法为RT-qPCR方法，例如包括如下步骤的RT-qPCR方法：
[0043] 1)提取受试者的血清/血楽总RNA,通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收 集受试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；
[0044] 2)对样品进行预扩增；
[0045] 优选地，所述预扩增包括以下步骤：
[0046] a)配制含除cDNA和引物以外试剂的预扩增PCR体系母液，份数依逆转录得到的 cDNA的份数来定；
[0047] b)取母液混合物放入PCR反应管中，加入对应的引物(包含正向引物、反向引物） 及逆转的cDNA，组成20ill的反应体系，混合均匀。
[0048] c)将20ill的混合物进行PCR预扩增；
[0049] 优选地，所述扩增条件为95°ClOmin，一个循环；95°C15s，60°Clmin，12个循环；
[0050] 3)qRT-PCR反应，并对待测的miRNA进行定量；
[0051] 优选地，所述RT-qPCR方法中，使用ACT法处理数据，其中每个miRNA相对于标准 内参的表达量用方程2_ACT表示，ACT=CT样品-CT内参。
[0052] 具体来说，本发明提供的检测受试者血清/血浆中的上述标记物的方法，可以进 一步评价人体非小细胞肺癌的状态。所述检测人体血清/血浆中稳定存在且可检测的上述 标记物的方法包括：反转录聚合酶链式反应方法（RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链式反应 方法（Real-timePCR)、微滴式数字PCR方法（DropletDigitalPCR)、Northern印迹杂交 方法（Northernblotting)、核糖核酸酶保护分析方法（RNaseprotectionassay)、Solexa 测序技术（Solexasequencingtechnology)、生物芯片方法和新一代测序方法（Next GenerationSequencing)中的一种或几种。
[0053] 所述RT-PCR方法包括以下步骤：（1)收集血清/血浆样本，具体地，使用Trizol 试剂提取血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试者的血清/ 血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；（2)用微小核糖核 酸设计引物进行PCR反应；（3)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；（4)EB染色后在紫外灯下 观察结果。
[0054] 所述Real-timePCR方法包括以下步骤：（1)收集血清/血楽样本，具体地，使用 例如Trizol试剂提取受试者的血清/血楽总RNA,通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或 者以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；（2)用微小核糖核酸设计引 物；（3)加入荧光探针例如EVAGREEN进行PCR反应；（4)分析处理数据并比较结果，具体 地，检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变化。
[0055] 所述DropletDigitalPCR方法包括如下步骤：（1)收集血清/血楽样本，具体地， 使用例如Trizol试剂提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样 品；或者以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；（2)对样品进行微滴 化处理；（3)用微小核糖核酸设计引物；（4)加入荧光探针例如EVAGREEN进行PCR反应； (5)分析处理数据并比较结果，具体地，检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆 中微小核糖核酸的量的变化。
[0056] 所述Northern印记杂交方法包括以下步骤：（1)收集血清/血楽样本；（2)通过 Trizol试剂提取血清/血浆总RNA; (3)进行变性PAGE电泳和膜转移实验；（4)制备同位 素标记微小核糖核酸探针；（5)进行膜杂交反应；（6)同位素信号检测，如磷屏扫描检测结 果。