与鸡多趾性状相关的snp分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，具体地说，涉及与鸡多趾性状相关的SNP分子标记及 其应用。
【背景技术】
[0002] 北京油鸡和丝羽乌骨鸡，以外形独特、肉蛋鲜美而著称，是我国珍贵的优良地方品 种。在自然群体中，北京油鸡和丝羽乌骨鸡部分个体存在多趾性状，但其多趾性状并没有在 群体中固定。近年来，由于自然环境的复杂多变，使得各种人畜共患病疾病爆发的频率越来 越高，不但造成人类的伤亡，同时重创了家禽养殖业，在这种大环境下，各地方政府纷纷立 法取消活禽交易。但屠宰后的北京油鸡和丝羽乌骨鸡很难从外观上同其他黄鸡和黑鸡区分 开来，造成了养禽生产者和加工者很大的经济损失。因此，研宄北京油鸡和丝羽乌骨鸡的多 趾性状产生的机理并通过育种手段将多趾性状在北京油鸡和丝羽乌骨鸡群体中固定下来， 作为北京油鸡和丝羽乌骨鸡优质鸡种鸡和为商品鸡提供屠体标识，从根本上保护育种单位 的知识产权和消费者利益，这具有非常重大的经济意义和社会意义。
[0003] 根据BondCJ等（1920)研宄发现，鸡只多趾性状受不完全显性的常染色体控制， 传统育种方法很难固定鸡群中多趾性状。随着分子生物学技术和鸡基因组研宄的飞快发 展，育种更准确、进展更快的分子育种已经登上了历史的舞台，从分子生物学角度研宄多趾 性状产生的机理，并研宄候选基因和分子遗传标记，运用标记辅助选择的方法可以快速、高 效的达到育种的目的。
[0004] 多趾/指（polydactyly)是脊椎动物常见的一种肢体异常，鸡的多趾表型与人、鼠 的多趾表型类似。鸡的正常趾表型为每侧的趾数为4,鸡的多趾的表型分为两种：一种是趾 数目的增加；另一种是趾数目为4,但趾关节数目的增加，这是多趾性状表型的一种特殊形 态（Warren，1944)。有研宄发现在动物四肢的发育形成过程中，Shh基因的表达异常与多趾 的发生有直接的关系（Riddleetal.，1993 ;Tickle，2003)。位于Shh基因上游Mb距离的 LMBR1基因的内含子区域是可以特异性的调节Shh基因在四趾中的表达水平的高低。在人 类、小鼠、猫的发育过程中LMBR1基因内含子5中单核苷酸的突变与Shh基因的异常表达和 多趾性状表型的发生有显著的关联（Hilletal.，2003;Masuyaetal.，2007)。
[0005] SNP(singlenucleotidepolymophism)，即单核昔酸多态性，是由于单个核昔 酸改变而导致核苷酸序列多态。目前已有很多成熟的技术检测SNP，如单链构象多态性 (PCR-SSCP)、DNA测序、限制性酶切片段多态性（PCR-RFLP)、等位基因特异寡聚核苷酸杂 交、DNA芯片及TaqMan等。PCR-SSCP方法最为常用，但存在问题有：检测步骤较多；耗时较 长（12-20小时）；易出现杂带，增加错判几率，结果的可信度较低。DNA测序、等位基因特异 寡聚核苷酸杂交、DNA芯片和TaqMan方法虽然准确度都比较高，但检测费用搞，运用到实际 育种比较困难。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与鸡多趾性状相关的 SNP分子标记及其应用。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种与鸡多趾性状相关的SNP分子标记， 所述分子标记来自LMBR1基因，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示，第246bp处为突变位点， 碱基为A或C。
[0008]该位点同时为LMBR1 基因（GenBankAccessionNumberNC_006089)的第 5 内含子 的第4645位。
[0009] 进一步地，当所述突变位点的碱基为A时表现出多趾性状。
[0010] 本发明还提供了用于扩增所述SNP分子标记的引物对，所述引物对中，正向引物U 如SEQIDNo. 2所示、反向引物D如SEQIDNo. 3所示。
[0011] 本发明还提供了用于检测所述SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒含有正向引物 U如SEQIDNo. 2所示、反向引物D如SEQIDNo. 3所示。
[0012] 本发明还提供了一种检测鸡多趾性状基因型的方法，所述方法为：
[0013] 以待测鸡只的基因组DNA为模板，利用权利要求3所述的引物对，通过PCR反应进 行扩增，用限制性内切酶BsrDI酶切所得的PCR扩增产物，电泳检测所得到的酶切产物，若 电泳显示为两条条带，则待测鸡只的基因型为CC型；若电泳显示为一条条带，则待测鸡只 的基因型为AA型；若电泳显示为三条条带，则待测鸡只的基因型为AC型。
[0014] 进一步地，若电泳显示为两条条带，序列长度分别为144bp、245bp，则待测鸡只的 基因型为CC型，是野生型纯合体；若电泳显示为一条条带，序列长度为389bp，则待测鸡只 的基因型为AA型，是突变型纯合体；若电泳显示为三条条带，序列长度分别为144bp、245bp 及389bp，则待测鸡只的基因型为AC型，是杂合体。
[0015] 本发明还提供了一种检测鸡多趾性状基因型的试剂盒，所述试剂盒含有前述引物 对和限制性核酸内切酶BsrDI。所述试剂盒还可包括进行PCR-RFLP所需的其它试剂，这些 试剂均可从商业途径得到。
[0016] 本发明还提供了所述SNP分子标记在确定北京油鸡和丝羽乌骨鸡多趾性状中的 应用。
[0017] 本发明还提供了前述检测鸡多趾性状基因型的方法在确定北京油鸡和丝羽乌骨 鸡多趾性状中的应用。
[0018] 进一步地，当基因型为CC型的个体趾性状表现为4趾，基因型为AA型和AC型的 个体趾性状表现为多趾。
[0019] 本发明的有益效果在于：
[0020] 本发明所提供的检测北京油鸡和丝羽乌骨鸡多趾性状基因型的方法或试剂盒，可 确定待测鸡只的LMBR1基因（GenBankAccessionNumberNC_006089)的第5内含子的第 4645位脱氧核苷酸是野生型C还是突变型A，从而确定北京油鸡和丝羽乌骨鸡多趾性状： 野生型纯合体CC表现为四趾性状；突变型纯合体AA、杂合体AC表现为多趾性状。
[0021] 利用本发明提供的SNP分子标记、检测方法或试剂盒，检测北京油鸡和丝羽乌骨 鸡是否携带多趾性状突变等位基因，可以确定北京油鸡和丝羽乌骨鸡鸡只多趾性状。在实 际生产和育种中，可以根据需要选择保留或剔除多趾性状，剔除效果完全、准确。将多趾性 状作为北京油鸡和丝羽乌骨鸡优质鸡种鸡和为商品鸡提供屠体标识，从根本上保护育种单 位的知识产权和消费者利益，获得可观的经济效益。本发明为北京油鸡和丝羽乌骨鸡育 种工作中针对多趾性状开展标记辅助选择，提供了一个分子标记检测方法，使用该方法和 遗传标记对北京油鸡和丝羽乌骨鸡进行标记辅助选择，可大大降低分子育种花费，并可准 确、完全剔除或保留实际生产中北京油鸡和丝羽乌骨鸡部分鸡只表现为非多趾性状问题， 为加速改善北京油鸡和丝羽乌骨鸡多趾性状的分子育种奠定了基础。本发明提供的方法 或试剂盒操作简单，只需将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，可确定待测鸡只的LMBR1基因 (GenBankAccessionNumberNC_006089)的第5内含子的第4645位脱氧核昔酸是野生型C 还是突变型A。准确度高，没有杂带；耗时短，4-6小时；费用低廉；可实现自动化检测。为 北京油鸡和丝羽乌骨鸡的育种工作提供便利，将在北京油鸡和丝羽乌骨鸡的育种中发挥巨 大作用。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明实施例1中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。.
[0023] 图2为本发明实施例1中BsrDI的酶切序列图。
[0024] 图3为本发明实施例1中酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0026] 下列实施例中所用方法如无特殊说明均为常规方法。所用原料都可从商业途径获 得。引物合成及测序工作均由华大基因完成。
[0027] 实施例1
[0028] 实施例1、检测北京油鸡和丝羽乌骨鸡多趾性状突变等位基因的方法的建立
[0029] 一、C4645A多态性位点的确定
[0030] 1、PCR扩增
[0031] 选择北京油鸡纯系为实验材料。根据GenBa