317F、和K321N的变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白。用于治疗溶酶体胆积症的方法还可 W包括向所需对象给予具有氨基酸变异F316A、L317F、和K321A的变体重组0 -葡萄糖脑 巧脂酶蛋白。用于治疗溶酶体胆积症的方法还可W包括向所需对象给予具有氨基酸变异 F316A、L317F、和K321V的变体重组0 -葡萄糖脑巧脂酶蛋白。用于治疗溶酶体胆积症的方 法还可W包括向所需对象给予具有氨基酸变异化45^F316A、和L317F的变体重组e-葡 萄糖脑巧脂酶蛋白。用于治疗溶酶体胆积症的方法还可W包括向所需对象给予具有氨基酸 变异H14化和K321N的变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白。用于治疗溶酶体胆积症的方法 还可W包括向所需对象给予具有氨基酸变异H14化和K321A的变体重组0 -葡萄糖脑巧脂 酶蛋白。用于治疗溶酶体胆积症的方法还可W包括向所需对象给予具有氨基酸变异H145L 和K321V的变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白。用于治疗溶酶体胆积症的方法还可W包括 治疗戈谢病的方法。治疗方法可W通过静脉输注、肌肉注射或通过本领域技术人员公知的 其它给药途径施用。
[0090] 适宜的化合物可W具有变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白，其特征在于具有下述 氨基酸序列中的任意一个：SEQ ID N0:2、沈Q ID N0:3、沈Q ID N0:4、沈Q ID N0:5、沈Q IDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、WQIDN0:11、WQID NO: 12、沈Q ID NO: 13、沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15、或沈Q ID NO: 16。适宜的化合物可W 具有变体重组P-葡萄糖脑巧脂酶蛋白，其特征在于具有下述氨基酸序列中的任意一个： 沈Q ID NO:2、沈Q ID NO:3、沈Q ID NO:4、沈Q ID NO:5、沈Q ID NO:6、沈Q ID NO:7、沈Q ID N0:8、沈Q ID N0:9、沈Q ID NO: 10、沈Q ID NO: 11、沈Q ID NO: 12、沈Q ID NO: 13、沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15、或沈Q ID NO: 16。
[0091] 适宜的变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白还可W是其特征在于与野生型重组 0 -葡萄糖脑巧脂酶蛋白相比能够增加表达。与野生型重组0 -葡萄糖脑巧脂酶蛋白相比， 变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白的表达还可W增加至少约10%。与野生型重组0-葡萄 糖脑巧脂酶蛋白相比，变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白的表达还可W增加至少约25%。 与野生型重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白相比，变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白的表达还 可W增加至少约50%。与野生型重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白相比，变体重组0-葡萄糖 脑巧脂酶蛋白的表达还可W增加至少约80 %。变体重组0 -葡萄糖脑巧脂酶蛋白还能够在 哺乳动物细胞、转基因动物或在酵母细胞中表达。变体重组P-葡萄糖脑巧脂酶蛋白还能 够在人中表达。变体重组P-葡萄糖脑巧脂酶蛋白还能够由插入基因表达。 阳OW] 实施例13
[0093] 恨据此前所述的方法在细胞培养基中表达变体重组GlcCerase蛋白和野生型 GlcCerase,W评估运些变体GlcCerase酶与野生型GlcCerase相比的相对表达。对转染 后约48小时的条件培养基中的酶活性进行检测的结果显示（图1)，在瞬时转染实验中多 种不同的变体GlcCerase酶的表达优于野生型GlcCerase。GlcCerase-F316A/L317A的表 达优于野生型GlcCerase(约282% )、GlcCerase-K321N的表达优于野生型GlcCerase(约 272 % )、GlcCerase-HH化的表达优于野生型GlcCerase(约 157 % )、GlcCerase-F316A/ L317A/K321N的表达优于野生型GlcCefase(约 272% )、GlcCerase-H14化/K321N的表达优 于野生型GlcCerase(约317 % )。GlcCerase-K321A的表达与野生型GlcCerase相当，而 GlcCerase-K321V的表达水平低于野生型（约61% )(数据未列出）。
[0094] 本发明还提供了包括变体重组0 -葡萄糖脑巧脂酶蛋白的化合物的制备方法，该 蛋白的特征在于具有下述氨基酸序列中的任意一个：SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQID N0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、 沈QIDNO: 11、沈QIDNO: 12、沈QIDNO: 13、沈QIDNO: 14、沈QIDNO: 15、或沈QID N0:16。本发明还提供了编码变体重组e-葡萄糖脑巧脂酶蛋白的核酸的制备方法，该蛋白 的特征在于具有下述氨基酸序列中的任意一个：SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、 沈Q ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、沈Q ID NO: 11、沈Q ID NO: 12、沈Q ID NO: 13、沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15、或沈Q ID NO: 16。 阳0巧]实施例14
[0096] 野生型和经修饰的GlcCerase酶的质粒构建
[0097] 使用编码具有特定氨基酸替换的GlcCerase片段的寡核巧酸引物（列于表3)或 合成DNA微基因（> 4(K)bp)产生表达野生型和经修饰的GlcCerase酶的DNA质粒。所 有引物和合成DNA微基因均购自Integrate曲NATechnologies?(Coralville，IA)。利用 PCR产生GlcCerasecDNA,然后连接至哺乳动物表达载体来构建野生型人GlcCerase(称为 P皿101)。简言之，在两个相同的50y1反应中通过化USion-HF高保真DNA聚合酶? (肥B?) 和200yMdNTP,使用引物A&B和人GlcCerasecDNA克隆（Origene?)模板DNA扩增具有其天 然Kozak序列和终止密码子的完整的野生型人GlcCerasecDNA。构建的引物A含有5'BglI1 和内在的EcoRI限制性位点，其在后紧邻Kozak序列，而引物B含有3'化el和NotI限制 性位点其在终止密码子之后，W使得能够将PCR产物克隆进表达载体。PCR反应物是混合 的，将合成的~1.6千碱基化b)的PCR产物从1 % (w/v)的琼脂糖制备凝胶中分离、切除， 并使用QIAGEN'S?凝胶提取试剂盒对其进行分离。随后使用限制性核酸内切酶BglII和 NotI在37°C下将PCR产物消化过夜并使用QIAGEN?pCR纯化试剂盒根据生产厂商的说明对 其进行再次纯化。使用BamHI和NotI对哺乳动物表达载体祀F6/V5-HisA?进行消化，使用 Antarctic憐酸酶"去憐酸化并使用QIAGENTMpCR纯化试剂盒进行分离。使用T4DNA连接酶 (肥B?)根据生产厂商的说明将BglII-NotI消化PCR产物（2y1)连接至BamHI-NotbEFS/ V5-HisA?载体（1y1)。使用1y1连接反应物转化化学-感受态大肠杆菌细胞并将其接种 至含100yg/ml氨节西林的Luria-Benani(LB)琼脂平板上，在37°C下解育过夜，W形成分 离的细菌菌落，该菌落经含有0-内酷胺酶基因的质粒DNA转化，被赋予了氨节西林抗性。 挑取单独的氨节西林抗性细菌菌落，在4mlLB肉汤培养基中（含100yg/ml氨节西林）在 37°C下扩大培养过夜，次日使用Minipr^?(QIAGEN?)根据生产厂商的说明分离质粒DNA。 通过分别使用EcoRI&Nhel和BamHI的两种不同的限制性消化反应检查分离的质粒DNA。选 出来自克隆4的正确质粒DNA(称为抑DlOL4)，并将其用于按照上文所述的方法再次转化 感受态大肠杆菌细胞W达到质粒DNA的高水平复制。然后挑取来自LB琼脂-氨节西林平 板的集落，使其在37°C下在200mlLB肉汤中生长过夜，并使用MaXipr^TM(Promega?)分离 质粒抑DlOL4。通过DNA测序确证质粒抑DlOL4 (编码野生型人GlcCerasecDNA)，将其用 于构建其他GlcCerase酶和用于瞬时转染实验。 阳09引在引物1中加入Bgin限制性酶切位点，W使得BglIl-消化GlcCerasePCR产物 与祀F6/V5-HisA?载体的兼容BamHI位点的连接消除在多重克隆位点内的BamHI限制性位 点，在后文中将运个经过修饰的表达载体称为祀F6'。除去祀F6/V5-HisA?内的该BamHI位 点是必要的，运样可W使用GlcCerasecDNA内唯一的BamHI位点插入具有特定核巧酸替换 的DNA片段W产生经修饰的GlcCerase酶。
[0099]为产生GlcCerase-F316A/L317F(称为抑D105)，在5' BsrGI天然翼侧和3' BamHI限制性位点之间通过整合DNA的技术?合成含有运些氨基酸替换的GlcCerase微基因。通 过BsrGI和BamHI限制性消化从pIDTSMART?质粒中释放该合成的经修饰的GlcCeraseDNA片段（~0. 5化），随后使用1 %琼脂糖制备凝胶对其进行分离并在框架内将其连接至 P皿101. 4,P皿101. 4事先已使用BsrGI和BamHI消化和去憐酸化。使用1微升该连接反应 物转化感受态大肠杆菌细胞，依照上文中针对P皿101的描述处理所述样品。从各克隆中分 离微量制备DNA，通过使用EcoRI和甜al的限制性消化对其进行检测。选择克隆5 (称为 P皿105. 5)，通过DNA测序对其进行确证，并将其用于进一步的表征。
[0100] 为产生GlcCerase-K321N(称为抑D109)，通过重叠PCR引入氨基酸替换。简言之， 通过使用引物A&D和抑DlOL4作为模板DNA在PCR反应1中产生N-末端片段（~1.化b)， 而使用引物B&C和抑DlOl. 4模板在PCR反应2中产生C-末端片段（~0. 5kb)。然后在 PCR反应3中通过加入1yIPCR反应物A&B和引物1&2合成完整的K321NGlcCerasecDNA。 如前所述从1 %的琼脂糖制备凝胶中分离合成的PCR产物3 (~1. 6化）并使用EcoRI和 NotI限制性核酸内切酶消化。将PCR产物3再次纯化并连接至EcoRI/Notl-消化和去憐 酸化的祀F6'载体，其过程如上文所述。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和 甜al的限制性消化对其进行检测。选择克隆3 (称为抑D109. 3)，通过DNA测序对其进行确 证，并将其用于进一步的表征。 阳1〇U为产生GlcCerase-HH化（称为抑Dl10)，通过重叠PCR引入氨基酸替换。通过使 用引物A&F和抑DlOL4作为模板DNA在PCR反应4中产生N-末端片段（~0. 55化），而 使用引物B&E和抑DlOL4模板在PCR反应5中产生C-末端片段（~化b)。在PCR反应6 中通过加入1yIPCR反应物4&5和引物A&B产生完整的化45LGlcCerasecDNA。如前所述从 1 %的琼脂糖制备凝胶中分离合成的PCR产物6 (~1. 6化）并使用EcoRI和NotI限制性核 酸内切酶消化。将PCR产物6再次纯化并连接至EcoRI/Notl-消化和去憐酸化的祀F6'载 体，其过程如上文所述。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和甜al的限制性消 化对其进行检测。选择克隆2 (称为抑Dl10. 2)，通过DNA测序对其进行确证，并将其用于进 一步的表征。 阳10引为产生01此6^36-化45尸（称为抑0111)，通过重叠口0?引入氨基酸替换。通过使 用引物A&H和抑DlOL4作为模板DNA在PCR反应7中产生N-末端片段（~0. 55化），而 使用引物B&G和抑DlOL4模板在PCR反应8中产生C-末端片段（~化b)。在PCR反应9 中通过加入1yIPCR反应物7&8和引物A&B产生完整的化45LGlcCerasecDNA。如前所述从 1 %的琼脂糖制备凝胶中分离合成的PCR产物9 (~1. 6化）并使用EcoRI和NotI限制性核 酸内切酶消化。将PCR产物9再次纯化并连接至EcoRI/Notl-消化和去憐酸化的祀F6'载 体，其过程如上文所述。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和甜al的限制性消 化对其进行检测。选择克隆1 (称为抑Dl11. 1)，通过DNA测序对其进行确证，并将其用于进 一步的表征。 阳103] 为产生GlcCerase-F316A/L317F/K321N(称为抑D112)，通过重叠PCR将氨基酸替 换引入抑D105. 5。通过使用引物A&D和抑D105. 5模板DNA在PCR反应10中产生N-末端 片段（~1.化b)，而使用引物B&C和抑D105. 5模板在PCR反应11中产生C-末端片段（~ 0. 5化）。在PCR反应12中通过加入1yIPCR反应物10&11和引物A&B产生完整的F316A/ L317F/K321NGlcCerasecDNA。如前所述从1 %的琼脂糖制备凝胶中分离合成的PCR产物 12 (~1. 6化）并使用Ec