)质粒（命名为祀T-28a(+)-l-l)，可用于进行下一步试验。
[0045] 实施例3 :脂肪酶L-I在大肠杆菌化21 0E3)中的高效表达
[0046] 3. 1大肠杆菌化21 〇)E3)感受态细胞制备
[0047] 曰、将大肠杆菌化21 〇)E3)接入5mLLB液体培养基中，37°C过夜摇培，250巧m;
[004引 b、按1 %体积比的接种率将过夜摇培后的大肠杆菌化21触扣菌液接种到LB摇瓶 中，37°C摇培化（> 300巧m)，得到原培养物；
[0049] C、将摇瓶在冰水中迅速冷却至0°C，将原培养物分装至冰预冷的离屯、管巧0血)， 冰置数分钟；
[0050] d、4°C，4000rpm离屯、IOmin回收细胞，将残留液空干（迅速）；
[0051] e、冰预冷的IOmL0.IM的CaClz重悬细胞，4°C，4000巧m离屯、IOmin回收细胞；
[0052] f、10血0.IM的CaClz重悬细胞，冰浴比W上；
[0053] g、4°C，4000巧m离屯、IOmin回收细胞；
[0054]h、每50血原培养物得到的回收细胞用2血含15 %甘油的化Cl冰重悬，分装于 1. 5血离屯、管，200UL每管。-80°C保藏。由此得到大肠杆菌化21触3)感受态细胞。
[00巧]3. 2转化
[0056] 取实施例2中得到的祀T-28a(+)-l-l质粒0. 5~IyL与50化BL21 〇)E3)感受 态细胞混合，冰浴30min，于42°C水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500yLLB液体培养基， 37°C20化pm培养比。培养物离屯、后涂布50yL/mL的卡那霉素LB平板，培养2化后挑选单 菌。由此得到含有祀T-28a(+)-l-l的大肠杆菌化21 0E3)。
[0057]实施例4 :脂肪酶的表达和纯化 [005引 4.1蛋白诱导表达
[0059] 含有祀T-28a(+)-l-l的大肠杆菌化21值E3)在LB培养基中培养至0D600为0. 5 左右，加IPTG至浓度0. 2mM，22°C培养16个小时。300血菌液4000巧m，4°C离屯、lOmin，收 集菌体，用20血巧OmM,pH7. 2)PBS缓冲液重悬菌体，超声400w，超4s，停6s，破碎IOmin分 钟，离屯、，收集上清。上清于-80°C冷冻过夜，冷冻干燥制备成脂肪酶L-I粗酶粉。
[0060] 4. 2脂肪酶的纯化
[0061] 用儀离子亲和层析柱对步骤4.1中收集的上清进行了纯化得纯化的脂肪酶 (图5)，纯化的蛋白大小约35kD，符合理论预期。具体实施方案如下：使用5mM的咪挫 洗脱5个柱体积，20~IOOmM咪挫洗脱30个柱体积，最后使用100~1000 mM咪挫洗脱5个 柱体积，收集中间3. 5mL。用脱盐柱Se地adexG25对上述脂肪酶进行脱盐，具体操作方法参 照GE公司的操作手册进行。
[0062] 4. 3脂肪酶酶活测定
[006引脂肪酶活力测定采用对硝基苯酪醋，具体方法如下：①配制IOmM的对硝基 苯酪醋；②在1血反应体系中加入220 y L his-肥1 buffer (50mM，pH 8.0) ,IOyL乙醇， 20^1脂肪酶心1酶液化26111旨/1110;@于35°(：下，3~5111111后，410皿测定吸光度。
[0064] 酶活单位定义：lmin内水解对硝基苯酪醋，释放1 Jimol对硝基苯酪所需的酶量定 义为一个酶活单位。
[006引实施例5 :脂肪酶的酶学性质
[0066] 5. 1水解不同长度的对硝基苯酪醋
[0067] 按照4. 3的测定条件，比较脂肪酶作用不同酷基长度的对硝基苯酪醋，结果如 图1，可见脂肪酶L-I不能作用C16,说明对长链对硝基苯酪醋特异性差；而对于中等长度的 对硝基苯酪醋的作用效果较好，最佳的底物是C6,即对硝基苯酪己酸醋。
[0068] 5. 2最适抑和抑稳定性
[0069] 配制不同的缓冲溶液，运些缓冲溶液具有不同的抑，如表2所示，其浓度均为 SOmM：
[0070] 表2不同缓冲体系的抑
[0071]
[0072] 将4. 3中测定条件（W对硝基苯酪己酸醋作为底物）所述的缓冲液灯ris-HCl buffer)按照表2中的缓冲溶液替换，测定不同PH的缓冲溶液对脂肪酶的酶活力的影 响，结果说明脂肪酶L-I酶活在中性至弱碱性范围内最高，最适抑为8. 0,W化is-HCl为 佳；抑高于8. 0、小于7. 0酶活性都会急剧下降（图2A)。
[0073] 脂肪酶L-I先置于不同PH的缓冲液中处理地，按4. 3中测定条件（W对硝基苯酪 己酸醋作为底物）测定脂肪酶L-I酶活，脂肪酶L-I酶活在抑为8. 5缓冲液中稳定性最高 (图2B)。5. 3最适溫度和溫度稳走性
[0074] 使用P册.0,Tris-HCl作为缓冲溶液，将4. 3中的反应混合液（W对硝基苯酪己酸 醋作为底物）置于不同的溫度下处理30min，然后加入脂肪酶kl，测定酶活，脂肪酶L-I最 适反应溫度在40°C左右，高于45°C酶活缓慢降低，60°C酶活基本为40°C的60% (图3A)。
[0075] 将酶于不同溫度（25~70°C)预处理比，于40°C下，P册.0，Tris-HCl的缓冲溶液 中，按4. 3测定方法（W对硝基苯酪己酸醋作为底物）测定脂肪酶L-I的酶活，结果说明脂 肪酶在20°C的稳定性最好，随着溫度升高，稳定性急剧降低，40°C处理比后酶活基本为 0 (图 3B)。
[0076] 5. 4金属离子抑制
[OOW]W50mMpH7. 0的化is-HCl为溶剂配制不同金属离子溶液，每种金属离子浓度均 为2mM，将脂肪酶L-I酶液在各种金属离子溶液中37°C下处理Ih;W不加金属离子的50mM、 pH7. 0的化is-肥1溶液为对照（control。测定酶活，结果见表3,可见仅有Li2\M护对酶 活有促进作用，对Ca2+的耐受性也相对较好，其它金属离子对脂肪酶L-I均表现出抑制作 用。
[007引表3金属离子对脂肪酶L-I酶活力的影响
[0081] 5. 5有机溶剂和馨合剂对脂肪酶活性的影响
[0082] 将纯化后得到脂肪酶L-I加入到表4中的几种有机溶剂中处理比（对照为蒸馈 水，其他溶液的浓度为体积分数），按照4. 3的测定方法（W对硝基苯酪己酸醋作为底物） 测定剩余酶活。结果如表4所示，说明脂肪酶对短链醇、控类和Tween-20有较好的耐受 性，10%TritonX-IOO能提高酶活至119. 48 + 25. 39%，而对SDS耐受性不高，具体为脂肪 酶L-I对甲醇、乙醇、异丙醇、叔下醇、异下醇、正戊醇、正己醇、TritonX-100、甲苯、1，4-二 氧六环、环己烧、正庚烧、正辛烧、正癸烧、Tween-20和丙酬有较好的耐受性，且其能够提高 脂肪酶L-I酶活。
[0083] 表4有机溶剂和馨合剂对脂肪酶L-I活性的影响
[0087] 实施例6:脂肪酶L-I在合成乙酸肉桂醋中的应用
[0088] 本法采用有机相中的转醋反应来合成乙酸肉桂醋。
[0089] 乙酸肉桂醋是一种重要的香料，酶法合成乙酸肉桂醋受到酷基供体、反应有机溶 剂种类、底物比例、反应溫度等等诸多条件的影响。本发明优化了上述参数，实现了乙酸肉 桂醋的合成。在优化的条件下，在5mL1，4-二氧六环的反应介质中，加入终浓度为300mM的 乙酸乙締醋作为酷基供体和50mM肉桂醇，再加入50mg脂肪酶L-I粗酶粉，于25°C，500巧m 条件下，反应9化后使肉桂醇转化成乙酸肉桂醋，转化率达到48. 3% (图4)。
[0090] 具体分析条件为：反应后的液体取出3血，12000巧m离屯、Imin除去脂肪酶 粗酶粉，加入0.ImM的十二烧作为内标物，混合均匀后，加入无水硫酸钢除去水分，取出 100-1000yL用于GCMS检测。色谱柱RXI-5MS，进样口溫度220°C，进样方式：分流，柱流 量：1. 20血/min,离子源溫度200°C，接口溫度280°C。柱箱溫度50°C，恒溫保持Imin,W 12°C/min的速率上升到150°C，再W20°C/min的速率上升到300°C，恒溫保持Imin。图4 中3个峰分别为内标物十二烧、底物肉桂醇和产物乙酸肉桂醋，出峰时间分别为8. 385min、 9. 799min、11. 022min。
【主权项】
1. 一种脂肪酶L-1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。2. -种编码权利要求1所述的脂肪酶L-1的脂肪酶基因1-1。3. 根据权利要求2所述的脂肪酶基因1-1，其特征在于，所述的脂肪酶基因1-1的核苷 酸序列如SEQIDNO. 1所示。4. 权利要求1所述的脂肪酶L-1在制备乙酸肉桂酯中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用为：取脂肪酶L-1于反应介质 中，再加入肉桂醇和酰基供体，进行反应，制备得到乙酸肉桂酯。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的反应介质为1，4-二氧六环、四氢呋 喃、叔丁醇、异丙醇、二氯甲烷、甲苯、环己烷、正己烷、正庚烷和异辛烷中的一种。7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的酰基供体为乙酸乙烯酯、乙酸异丙 烯酯、乙酸酐、乙酸、乙酸仲丁酯和乙酸乙酯中的一种。8. 权利要求1所述的脂肪酶L-1在耐受短链醇、经类、丙酮、Tween-20或TritonX-100 环境下进行催化的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的短链醇为甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁 醇、异丁醇、正戊醇或正己醇；所述的烃类为甲苯、1，4-二氧六环、环己烷、正庚烷、正辛烷 或正癸烷。
【专利摘要】本发明公开了一种脂肪酶L-1及其编码基因和应用。本发明从放线菌(Streptomyces？sp.)SCSIO？13580中克隆得到脂肪酶基因l-1，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，全长为1005bp，其编码的脂肪酶L-1的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示，共包含334个氨基酸；通过克隆脂肪酶基因l-1并将其连接表达载体pET-28a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组表达的脂肪酶L-1。脂肪酶L-1作为催化剂催化肉桂醇和酰基供体进行反应，制备得到乙酸肉桂酯，获得的乙酸肉桂酯产率可达48.3％。脂肪酶L-1具有稳定性高、催化效率高的优点，可用于生物医药、化妆品和精细化工等领域。
【IPC分类】C12P7/62, C12N9/20, C12N15/55
【公开号】CN105296446
【申请号】CN201510760314
【发明人】胡云峰, 王召贺, 张云, 孙爱君
【申请人】中国科学院南海海洋研究所
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月9日