涉及编码上述WT1辅助肽的多核苷酸（下文亦称WT1多核苷酸）。 本发明的多核苷酸可以是DNA或RNA。本发明的多核苷酸的碱基序列可根据上述WT1辅助肽 的氨基酸序列来确定。可通过例如DNA或RNA合成方法、PCR方法等制备多核苷酸。
[0058]本发明的多核苷酸包括在严格条件下与编码本发明的肽的多核苷酸的互补序列 杂交并编码活性与本发明的肽的活性相当的肽的多核苷酸。至于术语"在严格条件下杂 交"，本文使用的杂交可按照例如以下文献所述常规方法进行:Molecular Cloning，第2版， Sambrook J.,Frisch E. F.,Maniatis T.，Cold Spring Harbor Laboratory press等。同 样，"严格条件"包括例如以下条件，其中在含有6 X SSC (10 X SSC是含有1.5 M NaCl和 0.15 Μ梓檬酸三钠的溶液)和50%甲酰胺的溶液中于45°C形成杂合体，然后用2 X SSC于50 。〇洗涤（Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y. (1989)，6.3.1_6.3.6)等。
[0059]又一方面，本发明涉及包含上述多核苷酸的表达载体(下文亦称WT1表达载体）。可 根据将表达载体导入其中的宿主的类型、导入目的等，适当选择表达载体的类型、除上述多 核苷酸序列以外所包含的其它序列等。表达载体的实例包括质粒、噬菌体载体、病毒载体 等。在宿主是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞的情况下，载体的实例包括质粒载体，例如 pUCl 18、pUCl 19、pBR322和pCR3;以及噬菌体载体，例如λΖΑΡΙΙ和Agt 11。在宿主是酵母细胞 的情况下，载体的实例包括pYES2、pYEUra3等。在宿主是昆虫细胞的情况下，载体的实例为 pAcSGHisNT-A等。在宿主是动物细胞的情况下，载体的实例包括质粒载体，例如pKCR、 pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV和pRc/CMV;病毒载体，例如反转录病毒载体、腺病毒载体和 腺相关病毒载体。载体可任选含有以下因子:例如表达诱导型启动子、编码信号序列的基 因、选择用标记基因和终止子。同样，可将与硫氧还蛋白、His标签、GST (谷胱甘肽S-转移 酶)等一起表达成融合蛋白的序列加入载体中以易于分离和纯化。在这种情况下，可使用具 有在宿主细胞中起作用的合适的启动子（lac、tac、trc、trp、CMV、SV40早期启动子等）的GST 融合蛋白质载体(PGEX4T等）、具有例如Myc和His等标签序列的载体(pCDNA3.1/MyC-His等） 以及表达具有硫氧还蛋白和His标签等的融合蛋白的载体(pET32a)。
[0060] 当将本发明的表达载体给予受试者以体内产生WT1辅助肽时，由所述肽诱导的WT1 特异性辅助性T细胞产生各种细胞因子(例如11^-2、11^-4、几-5、11^-6或干扰素（0^)等），并 促进B细胞和其它T细胞的增殖、分化和成熟。因此，可特别使用本发明的WT1表达载体破坏 具有MHC I类分子并高表达WT1的肿瘤细胞。
[0061] 另一方面，本发明涉及抗上述WT1辅助肽或编码所述肽的多核苷酸的抗体(下文亦 称WT1抗体）。本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。已知制备这类抗体的方法，而 且本发明的抗体也可按照以下这类常规方法制备（Current protocols in Molecular Biology，Ausubel等（主编），1987，John Wiley and Sons (出版），第11.12_11.13节， Antibodies ； A Laboratory Manual, Lane , H. D.等（主编），Cold Spring Harber Laboratory Press (出版），New York，1989)〇
[0062] 本发明涉及用于治疗或预防癌症的药物组合物，其包含上述WT1辅助肽、WT1多核 苷酸或WT1表达载体。WT1基因在例如以下肿瘤和癌中高表达:造血器官肿瘤，例如白血病、 骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤；以及实体癌，例如胃癌、肠癌、肺癌、乳 腺癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌，因此，可使用 本发明的药物组合物治疗或预防表达WT1基因的癌症。当将本发明的药物组合物给予具有 MHC II类分子的受试者时，由药物组合物中包含的WT1辅助肽诱导的WT1特异性辅助性T细 胞产生各种细胞因子(例如11-2、11^-4、11^-5、11^-6或干扰素（正《等），并促进8细胞和其它丁 细胞亚群的增殖、分化和成熟。因此，可使用本发明的肽特异性破坏具有MHC I类分子和高 表达WT1的肿瘤细胞。
[0063] 除上述WT1辅助肽、WT1多核苷酸或WT1表达载体作为有效组分以外，本发明的药物 组合物可包含例如载体、赋形剂等。本发明的药物组合物中包含的WT1辅助肽诱导WT1特异 性辅助性T细胞，因此本发明的药物组合物可包含合适的佐剂，或者可与合适的佐剂一起给 予以提高诱导效率。优选的佐剂的实例包括但不限于弗氏完全或不完全佐剂、氢氧化铝等。 同样，本发明的药物组合物还可包含除上述WT1辅助肽以外的已知癌抗原肽，例如诱导WT1 特异性CTL的WTli26肽，作为有效组分(Oka等，"Cancer immunotherapy targeting Wilms' tumor gene WT1 product (革巴向维尔姆斯瘤基因 WT1产物的癌症免疫疗法)"，Journal of Immunology, 164:1873-1880，2000;以及Oka等，"Human cytotoxic T-lymphocyte responses specific for peptides of the wild-type Wilms' tumor gene (WT1) product (对野生型维尔姆斯瘤基因（WT1)产物的肽有特异性的人细胞毒性T-淋巴细胞应 答）"，Immunogenetics, 51: 99-107， 2000)。
[0064] 此外，本发明的药物组合物可与已知的癌抗原肽组合给予。例如可将已知的癌抗 原肽(例如WT1126肽)在给予本发明的药物组合物之前或之后给予。本发明的药物组合物具 有通过诱导WT1特异性辅助性T细胞激活B细胞或其它T细胞的特征，因此，可进一步提高由 给予已知的癌抗原肽所诱导的CTL的活性，并显著提高治疗效果。
[0065] 可根据疾病类型、受试者状况和靶向部位等条件适当选择给予本发明的药物组合 物的方法。给予方法的实例包括但不限于皮内给予、皮下给予、肌内给予、静脉内给予、经鼻 给予、口服给予等。同样，给予方法可以是淋巴细胞疗法或DC (树突细胞)疗法。可根据疾病 类型、受试者状况和靶向部位等条件适当选择本发明的药物组合物所包含的肽的量、药物 组合物的形式和给药频率等。总的来说，每个剂量所给予的肽的量为0.0001 mg-1000 mg， 优选0.001 mg-10,000 mg。
[0066] 另一方面，本发明涉及用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将有效量的上 述药物组合物给予具有上述MHC II类分子的受试者。待治疗或预防的癌症可以是任何癌 症，只要其表达WT1基因即可，包括例如造血器官肿瘤，例如白血病、骨髓增生异常综合征、 多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤；以及实体癌例如胃癌、肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞癌、肝癌、 皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌。
[0067] 另一方面，本发明涉及上述WT1辅助肽、WT1多核苷酸或WT1表达载体用于治疗或预 防癌症中的用途。
[0068] 又一方面，本发明涉及WT1辅助肽在制备用于治疗或预防癌症的药物组合物中的 用途。
[0069] 又一方面，本发明涉及WT1多核苷酸或WT1表达载体在制备含有上述WT1多核苷酸 或WT1表达载体的药物组合物中的用途。
[0070] 另一方面，本发明涉及包含上述WT1辅助肽、WT1多核苷酸或WT1表达载体的细胞。 可通过例如使用上述表达载体转化大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和动物细胞等宿主 细胞来制备本发明的细胞。用表达载体转化宿主细胞可采用各种适当选择的方法进行。可 通过培养转化细胞、回收和纯化所产生的WT1辅助肽，来制备本发明的肽。
[0071] 又一方面，本发明涉及抗原呈递细胞(例如树突细胞、B-淋巴细胞、巨噬细胞等）， 其通过上述MHC II类分子展示上述WT1辅助肽。本发明的抗原呈递细胞由上述WT1辅助肽诱 导。使用本发明的抗原呈递细胞有效地诱导WT1特异性辅助性T细胞。
[0072] 又一方面，本发明涉及用于诱导通过MHC II类分子展示WT1辅助肽的抗原呈递细 胞的方法，所述方法包括在WT1辅助肽存在下培养不成熟的抗原呈递细胞，并从不成熟的抗 原呈递细胞中诱导通过上述MHC II类分子展示WT1辅助肽的抗原呈递细胞。在本说明书中， 不成熟的抗原呈递细胞是指在成熟时变成树突细胞、B-淋巴细胞和巨噬细胞等抗原呈递细 胞的细胞。从中得到不成熟的抗原呈递细胞的受试者可以是任何受试者，只要他们具有上 述MHC II类分子即可。因为在例如外周血单核细胞等中含有不成熟的抗原呈递细胞，因此 可在上述WT1辅助肽存在下培养这类细胞。
[0073] 另一方面，本发明涉及用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将通过上述MHC II类分子展示WT1辅助肽的抗原呈递细胞给予具有与上述MHC II类分子相同的分子的受试 者。可根据疾病类型、受试者状况和靶向部位等条件适当选择抗原呈递细胞的给予方法。所 述方法的实例包括但不限于静脉内给予、皮内给予、皮下给予、肌内给予、经鼻给予、口服给 予等。
[0074] 又一方面，本发明涉及通过诱导通过上述MHC II类分子展示WT1辅助肽的抗原呈 递细胞而预防或治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 使样品与编码WT1蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)的核苷酸序列或具有其部分 序列的核酸或上述WT1辅助肽反应； (b) 得到抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞通过上述MHC II类分子展示样品中所包含 的WT1辅助肽;和 (c) 将抗原呈递细胞给予具有与上述MHC II类分子相同的分子的受试者。
[0075]上述方法中的样品可以是任何样品，只要其具有含有淋巴细胞或树突细胞的可能 性即可，包括例如得自受试者的样品（例如血液）、细胞培养液等。上述方法中的反应可采用 常规技术进行，优选采用电穿孔。抗原呈递细胞的获得可采用本领域技术人员已知的方法 进行。本领域技术人员可适当确定各个步骤中样品细胞的培养条件。抗原呈递细胞的给予 方法可如上所述。
[0076]再一方面，本发明涉及由上述WT1辅助肽诱导的WT1特异性辅助性T细胞。当识别 WT1辅助肽与MHC II类分子的复合物时，本发明的辅助性T细胞被诱导、增殖和激活。活化的 WT1特异性辅助性T细胞产生细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6或干扰素（IFN)，并促进B 细胞和其它T细胞亚群的增殖、分化和成熟。因此，可使用本发明的辅助性T细胞特异性破坏 具有MHC I类分子和高表达WT1的肿瘤细胞。
[0077]另一方面，本发明涉及用于诱导WT1特异性辅助性T细胞的方法，所述方法包括在 WT1辅助肽存在下培养外周血单核细胞，并从外周血单核细胞诱导WT1特异性辅助性T细胞。 提供外周血单核细胞的受试者可以是任何受试者，只要他们具有上述MHC II类分子即可。 通过在WT1辅助肽存在下培养外周血单核细胞，从外周血单核细胞中的辅助性T细胞的前体 细胞诱导WT1特异性辅助性T细胞。可通过将由本发明获得的WT1特异性辅助性T细胞给予具 有上述MHC II类分子的受试者，来治疗或预防受试者的造血器官肿瘤和实体癌。就此而论， 本说明书中的外周血单核细胞包括不成熟的抗原呈递细胞，其是抗原呈递细胞的前体细胞 (例如树突细胞、B-淋巴细胞、巨噬细胞等的前体细胞）。因为例如在外周血单核细胞中含有 不成熟的抗原呈递细胞，因此可在上述WT1辅助肽存在下培养这类细胞。
[0078]又一方面，本发明涉及用于诱导WT1特异性辅助性T细胞的试剂盒，其包括上述WT1 辅助肽作为必需成分。优选将试剂盒用于上述诱导WT1特异性辅助性T细胞的方法中。除上 述WT1辅助肽以外，本发明的试剂盒可包括例如外周血单核细胞的获取工具、佐剂、反应容 器等。一般而言，试剂盒中附有使用说明书。可使用本发明的试剂盒有效地诱导WT1特异性 辅助性T细胞。
[0079] 又一方面，本发明涉及用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将WT1特异性辅 助性T细胞给予具有上述MHC II类分子的受试者。WT1特异性辅助性T细胞的给予方