β－酪蛋白A的制作方法

专利名称：β－酪蛋白A的制作方法
技术领域：
本发明涉及β-酪蛋白A2用于降低某些疾病危险因素例如胆固醇、脂质和甘油三酯水平，以及LDL∶HDL比率的用途。具体地讲，本发明涉及与这些危险因素水平升高有关的疾病或病症的预防或治疗。本发明还涉及一种含有β-酪蛋白A2的饮食添加剂。
背景技术：
今天，在西方国家，心血管疾病广泛分布并且非常普遍。找寻预防和治疗此种疾病的方法，以及找寻与此疾病相关的危险因素，是当前的一项挑战。
高胆固醇血症被认为是心血管疾病的一个高危险因素，包括动脉硬化、动脉粥样硬化以及黄色瘤病。高胆固醇血症受饮食、遗传、环境、生活方式、其他疾病以及压力的影响，可导致在较早年纪心脏病和中风发作。
高胆固醇血症是一种循环总胆固醇、(低密度脂蛋白)LDL-胆固醇以及(极低密度脂蛋白)VLDL-胆固醇水平升高的状态。特别是，高水平的LDL和VLDL与冠状动脉硬化正性相关，而高水平的HDL为负性危险因素。LDL氧化的作用已经在文献中获得了非常多的关注。已经充分证实，经修饰的LDL，或者更具体地讲为氧化的LDL，有着增强的结合内皮细胞和平滑肌细胞壁的能力，这样通过动脉腔内的持续氧化促成了进一步的损伤。
此外，氧化的LDL已知可以发动动脉硬化过程中所直接涉及的一系列生理反应。这些反应包括刺激为巨嗜细胞化学引诱剂的炎性反应介质(例如白细胞介素-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子α以及巨嗜细胞集落刺激因子)的分泌，巨嗜细胞可在内皮下间隙中识别氧化的LDL，活性吞噬LDL，并随后转化为泡沫细胞。这些泡沫细胞然后可聚积形成脂纹。这样的脂纹是进展的动脉粥样硬化的最初可识别的特征病变。
高脂血症也会使人易患冠心病，以及癌症和肥胖。高脂血症是在早期诊断这些威胁生命的疾病中一个非常有用的高危险因素。
高脂血症是一种血液脂质参数升高的状态。循环血液中的脂类部分为总胆固醇、LDL、VLDL以及甘油三酯。下文给出了依照美国心脏学会指南的这些脂类的安全水平。在这些脂类水平异常时，需要通过饮食调整和药物来积极治疗以降低死亡风险。
总胆固醇(TC)＞240mg/dLLDL-胆固醇 ＞160mg/dL-Apo(B)动脉粥样硬化因素HDL-胆固醇 ＜35mg/dL Lp(a)动脉粥样硬化因素甘油三酯 ＞150mg/dL和高胆固醇血症一样，高脂血症也产生自饮食、遗传、生活方式、环境、家族病或压力。该状态可能为遗传而来，或者可能继发于其他疾病，例如系统性红斑狼疮(SLE)、甲状腺功能低下、肾病综合征、Cushing’s综合征、糖尿病、肥胖、酒精中毒、皮质类固醇治疗或者雌激素治疗。
高胆固醇血症和高脂血症也是动脉粥样硬化的主要病因。在美国，动脉粥样硬化比其他任何单一病症造成的死亡都多。包括冠心病的动脉粥样硬化性心脏病是死亡的最常见的单一病因，占到所有死亡的三分之一。动脉粥样硬化对脑部供血的影响(导致中风)是死亡的第三最常见病因(位于癌症之后)。动脉粥样硬化还可通过减少其他主要动脉中的血流而导致许多严重疾病，例如肾脏、小腿以及肠道的疾病。
动脉粥样硬化是一种继发于动脉壁狭窄的心血管病症。这种狭窄是由于动脉内层中形成斑块(凸起的斑)或斑纹所致。这些斑块由氧化的LDL、单核细胞、巨嗜细胞、泡沫细胞、损伤的肌细胞、纤维组织、血小板凝块、胆固醇所组成，有时还含有钙。这些斑块容易在血液湍流区域形成，且最常见于血流中胆固醇浓度较高的人群。斑块的数目和厚度随着年龄而增加，导致失去血管的平滑内层，并促进形成血栓(血块)。血栓碎片破裂并形成栓子并不罕见，栓子可通过血流运动并堵塞较小的血管(例如冠状动脉)，从而导致组织的缺血性损害或者缺血性心脏病。
对于缺血性心脏病，药物并不是一种令人满意的治疗，因为许多对动脉壁损害已经早已发生。曾使用抗凝药物来尽量减小继发性血块和血栓形成，不过这些药物对疾病的进展作用很小或者没有作用。使用血管扩张剂可提供缓解症状，不过没有治愈价值。
手术治疗可用于某些高风险的情况。球囊血管成形术可扩开狭窄的血管，并促进增加血供。在冠脉血管堵塞或损伤后，心肌的血供也可通过血管移植搭桥得到恢复。大的粥样斑以及钙化的动脉闭塞可通过动脉内膜切除术去除，同时全段的外周患病血管也可用编织的塑形移植管进行更换。
在某些情况下，通过调整饮食和/或使用药物可以实现降低高胆固醇血症，并因而减少疾病死亡率的风险。通过食用饮食性植物纤维以及食物的其他有效成份可以达到降低血清胆固醇的目的。不过，对于上述病症仍需要一种安全并有效的治疗。
除上述的其他危险因素以外，现在有相当多的证据表明食用奶，特别是黄牛(Bos taurus)(畜牛)的牛奶，与某些疾病有关联，例如糖尿病、动脉粥样硬化以及冠心病。
因此，对获自全世界范围牛群的牛奶中的酪蛋白成份进行了详细研究，特别是涉及不同酪蛋白与某些疾病之间的因果联系，例如糖尿病以及冠心病。注意力现已集中于牛奶中所发现的β-酪蛋白上。
已知β-酪蛋白的八种变异体，其定义为β-酪蛋白A1、A2、A3、B、C、D、E和F。全世界牛群的牛奶中最常见的变异体为β-酪蛋白A1和A2。在一级结构水平，或者氨基酸序列水平上，这些变异体之间的差异为β-酪蛋白A1在第67位上为组氨酸，而β-酪蛋白A2在第67位上为脯氨酸。其他的β-酪蛋白变体，尽管其在其他的氨基酸位点上也可不同，但也可根据在第67位上是否为组氨酸或脯氨酸来进行区分。这样，β-酪蛋白B、C和F在第67位上为组氨酸，而β-酪蛋白A3、D和E在第67位上为脯氨酸。
流行病学证据强烈提示，饮食性β-酪蛋白A1对人类健康有害。例如，WO 96/14577说明了β-酪蛋白A1对I型糖尿病的影响。流行病学证据提示，β-酪蛋白A1可刺激人类中致糖尿病活性。此外，WO 96/14577还说明了在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠模型中，通过消耗β-酪蛋白A1诱导自身免疫或I型糖尿病。该发明描述了通过将动物个体的奶或乳制品摄入限制于只含有非致糖尿病性β-酪蛋白变体的牛奶以在易感个体中降低患有I型糖尿病的风险。
WO 96/36239提倡在人类饮食中避免β-酪蛋白A1。流行病学证据确立了不同人群中消耗β-酪蛋白A1与冠心病发病率之间的关联。该发明描述了通过检测遗传物质中编码各种β-酪蛋白的DNA，以选择产奶奶牛来避免β-酪蛋白A1。
因此，β-酪蛋白A1和糖尿病之间的关联以及β-酪蛋白A1和冠心病之间的关联均得到了很好的证实。此外，近来表明，β-酪蛋白A1的有害作用现在已扩展至神经性疾病。WO 02/19832说明了通过提供不含任何“组氨酸变异体”的奶可避免诱导或恶化神经性或精神性疾病。在该文献中，组氨酸变体被定义为第67位为组氨酸的β-酪蛋白变体。β-酪蛋白A1便为此种组氨酸变体之一。
当前文献聚焦于β-酪蛋白A1对健康有害这一发现，以及因此β-酪蛋白A1应当从人类饮食中清除。大部分奶牛群生产主要含有β-酪蛋白A1和β-酪蛋白A2、以及极少的(如果有的话)其他β-酪蛋白变体的奶。因此，通过为人类食用消耗提供只含各种可能的β-酪蛋白变体中的β-酪蛋白A2的奶，便可达到清除人群饮食性摄入β-酪蛋白A1的需求。换句话说，在饮食中避免β-酪蛋白A1以及随之而来的糖尿病、冠心病以及神经性疾病风险的降低推动了对只含β-酪蛋白A2的奶(以及由奶加工的食品)的开发。
WO 01/00047揭示了一种饮食添加剂，其包含一种乳制品。该乳制品主要含有β-酪蛋白的A2变体，并且添加了一种或多种可降低人体血浆同型(半)胱氨酸水平的化合物。这样的化合物可包括有甜菜碱、维生素B12、叶酸或维生素B6。这样做的两个可能的优点为首先，在添加剂中以β-酪蛋白A2替换β-酪蛋白A1将降低糖尿病风险；其次，因为同型(半)胱氨酸水平与冠心病高度相关，并且同型(半)胱氨酸也为动脉粥样硬化的一个公认的危险因素，故而也需要降低同型(半)胱氨酸水平。因此，结合使用同型(半)胱氨酸治疗策略和糖尿病治疗策略是控制血管病变的一种组合方法。
WO 01/00047还揭示了β-酪蛋白A2的推定消化产物——β-酪啡肽-9可提供抗糖尿病免疫性。试验结果表明，以β-酪蛋白A2喂养的大鼠有着较对照动物较低的糖尿病发病率。β-酪啡肽-9被认为是一种免疫功能调节剂，并因此可能减缓糖尿病进程。
不过，应当注意到，与β-酪啡肽-9免疫调节相关的资料是建立在糖尿病NOD小鼠模型使用注射获得抗原而非肠道获取抗原的试验基础之上的。此外，尚未确定β-酪啡肽-9为β-酪蛋白A2消化产生的单一活性化合物。因此，基于β-酪啡肽-9的资料来推断并精确预测是否β-酪蛋白A2有着相同的生物活性非常困难。
在WO 01/00047中提到糖尿病和冠心病之间有着因果联系。不过，β-酪啡肽-9减缓糖尿病的属性意味着β-酪蛋白A2可能至少间接的对冠心病有预防作用的这一提示是基于一种完全微弱的关联，并被认为是所进行试验给出的一个令人惊奇的提示。
本发明人现在第一次令人惊奇的发现，食用β-酪蛋白A2可降低血清胆固醇水平，降低循环甘油三酯水平，降低LDL浓度以及因而降低LDL∶HDL比值，降低血清载脂蛋白B水平，并可预防动脉粥样硬化。
因此，本发明的一个目的是提供一种通过摄入预防或治疗各种与哺乳动物血清胆固醇水平、LDL胆固醇水平或甘油三酯水平相关之疾病有效量的含有β-酪蛋白A2的组合物来预防或治疗这些疾病的方法，或者至少提供一种有用的备选方法。
发明描述在本发明的一个方面，其提供了一种通过摄入含有β-酪蛋白的组合物来降低哺乳动物中如下任一项或多项的血清浓度的方法a)胆固醇；
b)低密度脂蛋白(LDL)胆固醇与高密度脂蛋白(HDL)胆固醇的比值；c)低密度脂蛋白(LDL)胆固醇；d)极低密度脂蛋白(VLDL)胆固醇；e)载脂蛋白B；以及f)甘油三酯其中，β-酪蛋白含有至少95％的β-酪蛋白A2。优选的，β-酪蛋白只含有β-酪蛋白A2。
本发明还提供了一种通过摄入含有β-酪蛋白的组合物来治疗与哺乳动物血清总胆固醇水平、LDL胆固醇水平、载脂蛋白B水平或甘油三酯水平相关的任何疾病或病症的方法，其中的β-酪蛋白含有至少95％的β-酪蛋白A2。
这些疾病或病症包括有高胆固醇血症、高脂血症以及动脉粥样硬化。
优选该组合物为一种食物或食品，例如奶或含有奶或由奶制成的产品。
在本发明的一项优选实施方案中，该组合物为一种饮食添加剂，优选为一种可被摄取用以优化以下任何一项或多项的营养药物，包括运动中的表现、减轻体重、增重、增强肌肉以及肌肉修复。
还优选该组合物为通过添加足以改变人体中血清胆固醇水平和/或血清甘油三酯水平的量的β-酪蛋白A2而形成。
优选β-酪蛋白A2获自畜牛牛奶，或获自牦牛、水牛、绵羊或山羊奶。
在本发明的另一方面，其提供了一种通过向人类食物或饮料中添加β-酪蛋白所形成的饮食添加剂，其中β-酪蛋白含有至少95％β-酪蛋白A2。优选的，β-酪蛋白只含有β-酪蛋白A2。
在本发明的再一方面，其提供了β-酪蛋白A2用于制造一种组合物的用途，该组合物可用于降低哺乳动物如下任何一项或多项的血清水平a)胆固醇；
b)低密度脂蛋白(LDL)胆固醇与高密度脂蛋白(HDL)胆固醇的比值；c)低密度脂蛋白(LDL)胆固醇；d)极低密度脂蛋白(VLDL)胆固醇；e)载脂蛋白B；以及f)甘油三酯。
附图的简要说明

图1显示β-酪蛋白A2、β-酪蛋白A1和乳清喂养的新西兰白兔的主动脉血管内膜和中膜的平均比值(指示动脉增厚程度)。
图2显示内膜剥除的右颈总动脉新生内膜的增厚程度(指示动脉壁损伤后动脉病变的进展程度)。A组1示例，显示没有新生内膜增厚；B组2示例，显示内膜层有损伤形成；以及C组5示例，显示严重的内膜增厚。
图3显示β-酪蛋白A2、β-酪蛋白A1和乳清喂养的新西兰白兔的血清胆固醇水平。
图4显示β-酪蛋白A2、β-酪蛋白A1和乳清喂养的新西兰白兔的LDL与HDL比值。
发明详述本文中所使用的术语“LDL”指低密度脂蛋白，“HDL”指高密度脂蛋白，“VLDL”指极低密度脂蛋白。
本文中所使用的术语“甘油三酯”指由甘油结合三个脂肪酸分子所组成的一种脂类或中性脂肪。
本文中所使用的术语“心血管病”指由血管中异常高浓度脂类所导致的、促成的、或者显示与之相关的任何循环系统血管疾病。
本文中所使用的术语“动脉硬化”指由于形成泡沫细胞以及使血管变窄的动脉纹所致动脉壁的一种退行性变化。其限制了血液循环并使个体易于发生血栓症。
本文中所使用的术语“动脉粥样硬化”指脂肪斑在内膜壁上发展并最终导致血流受阻的一种动脉病变。
本文中所使用的术语“载脂蛋白B”或“Apo B”指LDL胆固醇转运蛋白的蛋白质成份。在脂蛋白的形成中，重新合成的胆固醇自肝脏和肠道转运自外周组织。大部分的载脂蛋白B作为VLDL分泌至循环系统中。
本文中所使用的术语“高胆固醇血症”指依照美国国家胆固醇教育计划(NCEP)成人高胆固醇的检测、治疗评估的专家组报告指南所确定的循环总胆固醇、LDL-胆固醇以及VLDL胆固醇水平升高(Arch.Int.Med.(1988)148，36-39)。
本文中所使用的术语“高脂血症”是指血液中血液脂质参数升高的状态。该状态表现为异常高浓度的脂肪。循环血液中的脂质成份为总胆固醇、LDL、VLDL以及甘油三酯。
本文中所使用的术语“脂蛋白”，例如VLDL、LDL以及HDL，指血清、血浆以及淋巴液中所发现的对脂质转运非常重要的一组蛋白质。每种脂蛋白的化学组成各异，HDL有着相对脂质而言较高比例的蛋白质，而VLDL有着相对脂质而言较低比例的蛋白质。
本文中所使用的术语“黄色瘤病”是一种表现为由于脂肪沉积所导致的皮肤黄色肿胀或斑块的病症。黄色瘤的出现常伴随着血液胆固醇水平升高。
本文中所使用的术语“GRAS”指关于食物添加剂方面的“公认安全”。
本发明者第一次表明了这一令人感兴趣并十分使人惊奇的结果，即食用β-酪蛋白A2有着确实的益处，包括1.降低血清胆固醇水平，2.降低循环甘油三酯水平，以及3.降低LDL浓度和LDL∶HDL比值。
本发明者所观察到的这些作用意味着食用β-酪蛋白A2对于预防或治疗许多疾病均有益，包括
1.高胆固醇血症，2.高脂血症，以及3.动脉粥样硬化。
这一重要发现改变了当前认为β-酪蛋白A2有益只是因为β-酪蛋白A1可导致某些疾病(例如糖尿病以及冠心病)的想法。发明者的发现为β-酪蛋白A2本身便有着确实的有益作用。
与对照饮食一起随机喂养的十组新西兰白兔试验研究也支持这一发现。在处死动物后，测定其血清胆固醇水平、LDL∶HDL比值以及甘油三酯水平。
在3-8组的兔子中，试验了饮食中的β-酪蛋白A1和A2的三种浓度(5％、10％和20％)，同时添加乳清蛋白使每种饮食中含有总量20％的奶蛋白(即分别添加15％、10％和0％的乳清蛋白)。在这些饮食中也添加胆固醇(0.5％)以确保病变能够检测到。作为对照，组1的兔子喂20％乳清蛋白，同时组2的兔子喂20％乳清蛋白加0.5％胆固醇。组9和10只喂养10％β-酪蛋白A1(或A2)加10％乳清蛋白。对于特别准备的饮食，兔子平均每天只吃30.05±0.97克。
不足为奇，差不多所有兔子在经过6周的试验期后均体重减轻，平均减轻5.62％。这并不影响其总的健康状况，并且兔子均很警觉、敏感，同时也未显示有任何痛苦征象。这与较早的一项试验一致，该试验以一种含有酪蛋白的半合成饮食喂养兔子，由于该饮食不易接受，因此食物摄入和体重增加均减半，尽管兔子仍然看起来很健康。在该试验过程中，置于高水平饮食性酪蛋白(50％)的兔子未能获得体重增加。
未添加胆固醇的10％β-酪蛋白A2(组10)在t＝6周时，可较所有的其他组，包括单独乳清蛋白组(组1)和10％β-酪蛋白A1(组9)，产生显著的血清胆固醇水平降低。β-酪蛋白A1组的血清胆固醇水平要较单独乳清蛋白组高。这突出了检查特定β-酪蛋白而非混合物的作用的必需性，并且这也是第一次说明了β-酪蛋白变体对血清胆固醇水平的不同作用。
在单独喂20％β-酪蛋白A1的兔(组9)中，其平均血清胆固醇水平要高于组1动物(单独乳清蛋白组)。因此，β-酪蛋白A1可能较乳清蛋白的致动脉粥样硬化性稍高。向所有饮食中添加0.5％的胆固醇可至少增加血清胆固醇水平三倍，这远远高于与单独乳清蛋白相比的β-酪蛋白A1的作用。在添加饮食性胆固醇时，喂β-酪蛋白A1或喂β-酪蛋白A2的兔子之间，血清胆固醇水平没有显著差异。
在组10(β-酪蛋白A2)中，其血清LDL水平显著低于组9(β-酪蛋白A1)或组1(单独乳清蛋白)，所有这些组均没有添加饮食性胆固醇。组9的LDL水平要高于组1，不过并不显著。在添加饮食性胆固醇时，所有组(2-8)中的血清LDL均显著升高，且相互之间均无显著差异。除了组10并不显著低于组1外，相似情况也发生于血清HDL。
LDL与HDL的比值进一步突出了β-酪蛋白A2的抗动脉粥样硬化特性。组9(β-酪蛋白A1)和组10(β-酪蛋白A2)之间的血清LDL水平差异要较血清HDL水平高得多。因此，β-酪蛋白A2喂养动物的LDL与HDL的比值显著低于β-酪蛋白A1喂养的动物。确实，组10的LDL与HDL比值显著低于所有的其他组，包括组1(单独20％的乳清蛋白)。所有组之间的甘油三酯或同型半胱氨酸之间均无显著差异。
因此，在没有富含胆固醇的饮食时，饮食性β-酪蛋白A2可产生较β-酪蛋白A1和乳清蛋白均更低的血清胆固醇水平(总胆固醇、LDL以及HDL)。
已经发现，与20％乳清蛋白相比，β-酪蛋白A1和β-酪蛋白A2均可导致脂纹，不过β-酪蛋白A2产生的损伤没有β-酪蛋白A1广泛。确实，不添加饮食性胆固醇的10％β-酪蛋白A1可导致与添加有饮食性胆固醇的10％β-酪蛋白A2相同量的损伤。不管是否添加饮食性胆固醇，喂β-酪蛋白A2的兔子主动脉弓中的脂纹厚度均为零或者非常接近于零。相反，喂β-酪蛋白A1的兔子主动脉弓的脂纹厚度明显更高。因此，β-酪蛋白A1要较乳清蛋白和A2酪蛋白变体更具致动脉粥样硬化性。
在有0.5％的饮食性胆固醇时，只有20％β-酪蛋白A2可产生较20％乳清蛋白更小面积的为脂纹所覆盖的主动脉表面。不过，与乳清蛋白(0.03±0.015)相比，用20％和5％β-酪蛋白A2喂养的动物主动脉弓中的脂纹厚度均要明显更低，同时10％β-酪蛋白A2喂养的动物的脂纹厚度也较低(0.01±0.008)(但并不显著)。
已知，与富含胆固醇饮食结合的动脉气囊损害可在兔中导致与人类动脉粥样硬化极其相似的损伤。
不管是否有饮食性胆固醇，β-酪蛋白A1或β-酪蛋白A2喂养兔的气囊损害右侧颈动脉中，内膜与中膜比值之间均没有显著差异。不过，喂β-酪蛋白A2的组(添加或不添加胆固醇均如此)较其喂β-酪蛋白A1的对应对照动物有着更薄的新生内膜厚度。喂β-酪蛋白A2的动物通常较喂乳清蛋白的动物有着稍薄的内膜(添加或不添加饮食性胆固醇均如此)。
结合事实——未添加胆固醇的10％β-酪蛋白A2可较所有其他组(包括单独乳清蛋白组以及10％β-酪蛋白A1组)产生明显的血清胆固醇水平降低，这些结果第一次证实β-酪蛋白A2有着预防动脉粥样硬化的作用，而β-酪蛋白A1有致动脉粥样硬化性。
这些结果与提示食用β-酪蛋白A1与心血管病死亡率之间有很强关联的流行病学研究相一致。
本发明的组合物可为与一种或多种物质相混合的β-酪蛋白A2的形式，并且可为一种水溶液或悬浮液或乳剂的形式，或者可为一种固体，例如颗粒或粉末的形式。本发明的某些组合物也可以其天然存在的形式，特别是奶或缘自奶或由奶制成的产品。本发明的其他组合物可为通过添加β-酪蛋白A2而强化的物质，其中，β-酪蛋白A2自奶或由奶制成的产品纯化获得或者作为其一种成份获得，或者β-酪蛋白A2含于奶或由奶制成的产品中。
所属技术领域的技术人员清楚，本发明的组合物或食品可包括，但不仅限于，奶或乳制品、营养添加剂(例如增重制剂)、食物添加剂、冰激凌或基于糖果的其他冷冻乳制品、发酵的乳制品(例如酸奶或软干酪(quark))、奶酪(包括全脂、部分脱脂以及全部脱脂处理的奶酪)、奶乳清、通过添加乳制品强化的食品(例如汤)、已去除致敏分子的奶、糖果(例如巧克力)、含二氧化碳的乳制品(包括那些添加了磷酸盐和/或柠檬酸盐的乳制品)、可含有全脂、部分脱脂或者完全脱脂奶的婴儿制剂、液体或粉状饮料合剂、酪乳、以及酪乳粉。
本发明组合物给药的优选方式为通过口服摄入。不过，其也可适于通过其他途径给药此组合物，例如静脉使用。本发明的组合物可以任何适合用于控制胆固醇、LDL以及甘油三酯水平的剂量水平以及剂量频率摄入或者说给药。典型的，人体可每天或每周摄入一定量的该化合物。
熟练的行医执业者也很清楚，不同试验对象之间所摄入或者说给药的β-酪蛋白A2的量也将不同。
通过以下实施例对本发明进行进一步说明。不过，应当了解，本发明并不仅限于这些实施例。
实施例材料和方法六十只两种性别的新西兰白色/垂耳杂交兔(16-24周龄)获自昆士兰大学中心动物饲养所。
计划概要在时间＝0时，所有兔子的右颈动脉均经气囊去内皮化。然后将兔子随机分为10组，并喂以指定的饮食六周。在t＝0、3和6周时采集血样以分析血清组成。在t＝6周时，处死所有动物并采集组织标本。表1中显示了试验计划概要。
表1计划概要

在t＝0时进行手术；每天分发试验药片；在t＝0、3、6周时采集血样；每周称量记录体重；在t＝6周时处死动物。
手术在t＝0时，使用氯胺酮(30mg/kg)与赛拉嗪(7mg/kg)的混合物肌注麻醉所有的60只兔子，并使用氟烷(Laser Animal Health，Qld，澳大利亚)维持麻醉。切开皮肤和筋膜，钝性分离并切开茎突舌骨肌以暴露右侧颈总动脉的上部。左侧未受损伤的颈总动脉作为相应对照。使用5/0丝线(Davis&Geck，Danbury，CT，美国)暂时结扎侧支，并切开颈外动脉的一个分支——甲状腺上动脉，置入一根2 French(2F)Fogarty取栓导管(BaxterHealthcare公司，Irvine，CA，美国)(图2.2)。将导管推进10cm(至主动脉弓)，使用0.2ml盐水膨胀气囊并回撤导管以对动脉进行去内膜化。
每一动物进行此损伤步骤3次以确保完全去除内皮。在损伤后，将导管移除，用5/0丝线结扎甲状腺上动脉，并使用2/0 Dexon编织缝线(Sherwood Medical，St.Louis，MO，美国)关闭伤口。在完成该步骤时，皮下给以含50mg/ml恩氟沙星的广谱抗生素(5mg/ml Baytril，Bayer澳大利亚有限公司，Pymble，澳大利亚)。术后对兔进行监测，在完全清醒时送回饲养笼。术后三天使用约170mg扑热息痛(SmithKline BeechamInternational，Ermington，澳大利亚)管饲每只动物，并继续皮下给以抗生素。
兔饮食该试验涉及了10种饮食，表2中显示了其各种组成。基本上每种饮食都含有20％总的乳蛋白，但是酪蛋白与乳清蛋白的比例不同。组1、9和10的饮食不含有其他的添加剂，而组2、3、4、5、6、7和8的饮食补充了0.5％胆固醇。每组中有6只兔子，该饮食持续6周。
表2供给兔子6周的试验饮食组成

已经发现，兔子需要数天方可适应在颜色、气味、质地以及重量方面均与其通常的食物丸所不同的新饮食。新饮食中所喂食的食物丸为白色，而其通常的食物丸为褐色的。因此，在手术前5天，所有兔子均通过在其通常兔食物丸中混合逐渐加量(25％、50％、75％、100％)的新食物丸(至总重量200克)，以使其戒除原来的饮食而适应其各自的新饮食。在t＝0时，只提供新食物丸(200克/天)，直至接下来的六个星期(如有例外，请参见下文)，同时水随时均可饮用。已知兔子每天进食90-130克食物丸，不过，仍需要将200克食物丸填充入进料斗以使动物可以够着食物。每天均提供200克新鲜食物丸，同时每天称重测定每只动物未吃所剩余食物丸的量。
采用了数种方法以促进兔子食用新饮食。首先，将少量的大茴香子油滴入食物进料斗背面以刺激兔子食欲。其次，如果兔子仍然不食用其新饮食，或者其体重减轻接近了原始体重的10％，则以25、50或75％将其通常食物混合添加至该新饮食中。在进行这一步时，应当仔细的将白色饮食丸与通常的褐色食物丸分开，并每天称重以确定所消耗试验饮食的实际量。最后，如果仍继续有体重减轻，则每天给兔子提供200克的通常食物直至其体重增加。
称量兔重所有兔子均每周称量体重，从手术当天开始，直至处死那一周。
收集血样手术前、在饮食开始时以及t＝3和6周时，收集每只兔子的血样。将每只兔子安全可靠的裹好，并将覆盖中心耳动脉的毛刮去。将24号导管针(Becton Diskinson Pty有限公司，NSW，澳大利亚)刺入动脉并收集5ml血液至无菌管中。让血液凝结并于4500rpm离心10分钟。提取血清上清液并分析总血清胆固醇、甘油三酯、HDL、LDL以及同型半胱氨酸。
处死兔子动脉损伤后六周，将1000I.U.肝素(David Bull实验室，Mulgrace，Victoria)于1ml盐水中注射入每只兔的耳静脉中。五分钟后，以过量的戊巴比妥(325mg/ml Lethabarb，(Virbac澳大利亚Pty有限公司，Victoria))对兔进行安乐死。从颏骨至骨盆切开，并继续切至后肢和前肢。然后小心切开腹膜腔以暴露内脏器官，并将肋支架切除以暴露心脏。将左室置入一连有导管的宽号针，导管又连接到一灌注装置。清楚分离出一小段下腔静脉并切除。使用1升Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(DPBS)灌洗循环系统，然后使用1升于DPBS中的4％甲醛(Asia Pacific Speciality Chemicals有限公司，NSW，澳大利亚)以100mmHg进行动脉灌注固定。
组织收集从髂部分叉部直至主动脉弓完整暴露并切除主动脉。完整暴露并切除右侧(受损的)和左侧(对照)颈总动脉。在置入含有4％甲醛的DPBS试管中前，清除掉所有血管的脂肪和粘连的结缔组织。
组织分析腔内损伤的膜面油红O染色切除主动脉弓以进行固定和组织学切片。纵向打开剩余的主动脉(约16cm)并切成四段。将各段主动脉缝至小块的透明塑料上(腔面向上)以确保其保持平坦。然后将各段置于亲脂性染料油红O的饱和溶液中进行膜面染色，用以确定脂纹覆盖的腔面面积。
脂纹所覆盖腔面的分析使用DESK Scan II(2.31a版，Hewlett-Packard，美国)扫描每段主动脉的影像，并使用ImageJ影像软件(1.23y版，国立卫生研究院，美国)测量总损伤面积。此程序可对比损伤(亮红色染色)与动脉表面的其他区域(白色至浅粉色)的亮度。结果以损伤所覆盖表面积的百分数表示。
主动脉弓从每根主动脉上切下三段长约3-4mm的动脉，并置于DPBS中清洗两次，每次30分钟。然后于浓度增加的酒精中对动脉段进行脱水，例如在70％酒精中脱水30分钟，再于95％酒精中脱水30分钟，并最后再于100％酒精中清洗三次，每次30分钟。然后将其置于两种渗滤树脂溶液中的第一种中(Technovit 7100，Heraeus，德国)，并置于旋转器上过夜。然后将动脉段转移至第二种树脂溶液中，并再置于旋转器上过夜。然后小心地将每段动脉竖直置于包埋模中，并通过包埋模底部少量的强力胶水使其保持合适位置。将和用于渗滤的相同树脂混合物与硬化剂混合，并将其用吸管移至包埋模中直至完全覆盖所有动脉段。将塑胶置于室温进行聚合两小时，然后置于37℃烘箱中过夜。再将塑胶块轻柔的从包埋模中移出，并使用Technovit 3040(Heraeus，德国)作为胶水将其安装到Histoblock上。每个塑胶块均安全地安装在切片机(LKB Bromma，德国)上，并通过切削60-70片每片10μm的切片对塑胶块进行修整。将这些切片弃去，并将切片机设定至切5μm的切片。用镊子收集好这些切片，将之于保持室温的无菌水中伸展开。然后将之收集到载玻片上，并于60℃干燥约15分钟。再使用甲苯胺蓝染色10分钟，之后用自来水冲洗四次并进行风干。
右侧和左侧颈总动脉分别自左侧(对照)和右侧(经气囊处理)颈总动脉切出四段和五段动脉，每段约长3-4mm。在对照和试验血管中使用了不同数量的切片以避免在包埋和切片过程中将组织混淆。使用先前对于主动脉弓动脉段所述的相同方法对动脉段进行脱水、包埋、切片和染色。
内膜与中膜比值使用Mocha影像分析系统(版本1.1，Jandel Scientific，Ca，美国)对经气囊处理的颈动脉和对照颈动脉以及主动脉弓进行所有的内膜与中膜比值(I∶M)的形态测定分析。测量每一动脉的所有动脉段以确定内层和中层两者的大小(以像素计)。使用Excel(微软公司，纽约，美国)电子制表软件，计算并记录每只兔子的三段主动脉弓动脉段、四段对照颈动脉段以及五段经气囊处理的颈动脉段各段的内膜和中膜比值。
统计使用SigmaStat(Jandel Scientific，Ca，美国)统计软件包进行所有的统计分析。运用单因素多种ANOVA，使用“Kruskal-Wallis”轶检验方差分析，对来自形态测定分析的数据进行比较。使用Tukey’s异常值检验鉴别末端异常值。在所有统计分析中，低于0.05的P值认为具有显著性。使用Microsoft Excel(微软公司，纽约，美国)将信息以图形的形式显示。所有数据以平均值±平均值的标准差报道。
结果兔饮食在t＝0前数天，使兔子戒除原来的饮食而食用各自新的饮食，并且对于某些体重减轻约10％的兔子，在其饮食中可添加数天的通常食物丸。因此，必须通过每天早晨提供每只动物已知重量(200克)的新鲜食物丸，并且在第二天即将再提供200克新鲜食物丸前称量未吃部分的重量来测定每只动物每天所食新食物丸的量。如果提供的是新食物丸(白色)和通常食物丸(褐色)的混合物，则应将这两种食物丸先分开再称重。
不同兔之间每只兔所食白色食物丸的重量也不同。以组进行平均，在整个六周的试验期，每天所食用消耗的食物丸重量变化只有12克，其变化范围从每天23.2克至35.3克(平均30.48±0.97克)。在任何组之间所食用的食物丸的量之间没有显著差异。组2-8饮食所添加的0.5％胆固醇既没有影响所食用食物的量，也没有影响酪蛋白的类型和数量。因此，尽管兔子所食用食物的量相对较低(平均每天30.48克白色食物丸，平均每天10.22克褐色食物丸，总量每天40.72克)，这导致了某些体重减轻，但是每组中所食用消耗的新饮食的量却相对一致，并由此使组间可以进行比较。
称量兔重差不多所有兔子经六周均有体重减轻，只有组9(10％A1，未添加胆固醇)记录到有平均2.15±1.2％的体重增加。组10兔子(10％A2，未添加胆固醇)显示只有较轻的-0.92±0.97％的体重减轻。经过六周的试验，单独20％乳清蛋白的组1(未添加胆固醇)减轻了其原始体重的4.5±6％，而剩余的组2-8(所有均添加了胆固醇)减轻了其原始体重的7.57±4.72％。
体重减轻最多的是组6，不过，这完全是由于一只兔子(K6)的初始体重较大，为3.81kg。这只兔子平均每天食用21.58克食物丸，大约比所有兔子的平均量(30.50)少9克。K6未显示有疾病征象，并在处死时，除肝脏较小，但颜色仍正常外，所有器官均表现正常。在该组中剩余的5只兔子体重减轻低于其原始体重的5％。对于体重变化，酪蛋白的比例和类型之间未显示有明显的关联。
饮食对胆固醇的影响在第六周时，差不多所有组的胆固醇水平均与组1(单独20％乳清蛋白组)有明显差异。有趣的是，组9(A1)中胆固醇水平高于组1，不过并不显著。同时，组8(20％A2，添加了胆固醇)约为添加了胆固醇的20％乳清蛋白组(组2)的一半，尽管这也不显著。组9血清胆固醇显著低于所有添加饮食性胆固醇的组(组2-8)。组10(A2)血清胆固醇显著低于组1，并确实显著低于所有其他组，包括组9。
此结果表明，无论饮食中乳清蛋白的量以及酪蛋白的量和种类如何，饮食中添加0.5％胆固醇可导致血清胆固醇水平升高。同时，在没有饮食性胆固醇时，A2可较A1及乳清蛋白产生更低的血清胆固醇水平。
饮食对甘油三酯的影响经过六周，组5(20％A1)和组9(10％A1，未添加胆固醇)的甘油三酯水平较第0周时升高，同时组4(10％A1)和组10(10％A2，未添加胆固醇)未显示有变化。所有其他组的血清甘油三酯水平均较第0周时降低。
饮食对LDL的影响在所有添加饮食性胆固醇的组中，血清LDL水平显著高于组1(单独乳清蛋白组)或未添加饮食性胆固醇的组9(A1)和组10(A2)。组9(A1，未添加饮食性胆固醇)与组1的差异并不显著，不过组10(A2，未添加饮食性胆固醇)要显著的低。同时，组10 LDL水平要显著低于组9。所有添加饮食性胆固醇的组(组2-8)相互之间未有显著差异。
因此，血清LDL水平也遵从与血清胆固醇相同的模式，同时也显示添加饮食性胆固醇可在所有相应组中升高血清LDL水平，而在没有饮食性胆固醇时，A2酪蛋白变体可产生较A1或单独乳清蛋白更低的血清LDL水平。
饮食对HDL的影响血清HDL遵循与血清LDL相同的模式，添加饮食性胆固醇(组2-8)可导致较未添加胆固醇的组(组1、9和10)血清水平显著升高。组9与组1差异并不显著，不过要显著高于组10，而组10又反过来显著低于除组1外的所有组。未添加饮食性胆固醇的β-酪蛋白A2可较A1产生更低的血清HDL水平。
饮食对LDL与HDL的比值的影响每只兔的血清LDL水平除以同只兔的血清HDL水平便可确定LDL与HDL的比值。然后可以确定每组的平均LDL∶HDL比值。已发现，组10(单独10％β-酪蛋白A2)的LDL∶HDL比值显著低于所有其他组，包括单独的乳清蛋白组及单独的β-酪蛋白A1组。添加了饮食性胆固醇的所有组(组2-8)的LDL与HDL比值相互之间未有显著差异。对于血清LDL和HDL水平，随着β-酪蛋白A1剂量的升高，该比值有着升高的趋势，而随着β-酪蛋白A2剂量的升高，该比值有着降低的趋势。
饮食对同型半胱氨酸的影响到第六周，血清同型半胱氨酸水平只较第0周时有轻微变化，试验组间证实没有显著差异。
饮食对动脉粥样硬化的影响组1喂养20％乳清蛋白的兔子覆盖粥样斑的动脉面积为0。所有其他组均有一些动脉粥样斑，包括组10，尽管其并未显著高于组1。只有组1和组10显著低于组3，而组3也高于组2-9，不过，这组中兔子之间的变异也较大，其变化范围为2.8至18.4％。在这些计算中排除了三只兔子，因为其被认为是末端异常值。
组1胸主动脉有0％的面积覆盖有脂纹。所有其他组均存在某些损伤，包括未添加饮食性胆固醇的组9(A1)和组10(A2)。组9和组10相互之间没有显著差异。对于添加饮食性胆固醇的A1和A2组，随着酪蛋白变体浓度的升高，也有着损伤百分数降低的趋势，不过这并不显著。组3要高于所有其他组，不过也没有显著差异。在此组的六只兔子中，三只有着较高的粥样斑覆盖的动脉面积百分数，同时其他三只的值较低。
在没有饮食性胆固醇(组10)时，分离自喂养A2动物的腹主动脉有着非常低的粥样斑覆盖的动脉表面积，同时其与0％覆盖粥样斑的组1(单独乳清蛋白组)并无显著差异。组10显著低于所有其他组，包括组9(A1，未添加饮食性胆固醇)。组3(5％A1，添加了饮食性胆固醇)显著高于组2(20％乳清蛋白并添加饮食性胆固醇)。
因此，未添加饮食性胆固醇的这两种酪蛋白变体均可导致较单独乳清蛋白更广泛的脂纹，但是A2较A1有着更低的致动脉粥样硬化性。此外，在有饮食性胆固醇时，A1较A2有着更高的致动脉粥样硬化性。
内膜与中膜比值在有着单独的20％乳清蛋白时(组1)，主动脉弓没有内膜增厚。相似的，在有着未添加饮食性胆固醇的10％A2时(组10)，或者有饮食性胆固醇的5％或20％A2时(组6和组8)，平均内膜和中膜比值为0。组7(有饮食性胆固醇的10％A2)的平均内膜和中膜比值仅为0.01，其六只兔子中的四只为0％。所有的A1组(添加和未添加饮食性胆固醇)较喂A2酪蛋白的组有着更高的内膜与中膜比值，同时其内膜中膜比值与组2(添加有0.5％胆固醇的20％乳清蛋白)并无显著差异。确实，在没有饮食性胆固醇时，10％A1可导致与有着0.5％饮食性胆固醇的20％乳清蛋白(0.03)相同的内膜与中膜比值。
因此，关于主动脉弓中脂纹病变的厚度，即使在没有饮食性胆固醇时，A1酪蛋白也可导致与0.5％胆固醇所导致的相似病变。相反，A2酪蛋白在有或没有饮食性胆固醇时，均显示有较高的预防动脉粥样硬化的特性。
经过6周，在t＝0时对右侧颈动脉的气囊导管损害可于所有兔子中诱导产生增生的新生内膜增厚。内膜与中膜比值的测定显示，与组1(单独20％乳清蛋白组)相比，组2(0.5％胆固醇加20％乳清蛋白)中新生内膜增厚有着轻度的、但不显著的增加。类似的，喂5、10和20％A1加上0.5％胆固醇的组较组1有着增厚的、但无显著差异的新生内膜。喂5、10和20％A2加上0.5％胆固醇的组均较其相应的A1对照有着更薄的新生内膜，不过差异并不显著。相似的，在没有饮食性胆固醇时，在A2喂养的动物中(组10)的内膜与中膜比值要低于A1所喂养的组9。
在所有的对照血管中，均未观察到新生内膜增厚。
尽管本发明已通过实施例进行了说明，但应当了解，在不背离权利要求的范围的情况下，可以对其进行变动和改进。并且，如果特定的特征存在已知的等同物，则这些等同物就像被具体提及那样而包括在本发明的范围内。
工业实用性食用β-酪蛋白A2可有效用于降低血清胆固醇水平、循环甘油三酯水平、LDL浓度及LDL∶HDL比值，以及血清载脂蛋白B的水平。因此，本发明的方法可有效用于预防或治疗与哺乳动物血清胆固醇水平、LDL胆固醇水平以及甘油三酯水平相关的各种不同疾病。这些疾病包括高胆固醇血症、高脂血症以及动脉粥样硬化。本发明同时还提供了一种含有β-酪蛋白A2的饮食添加剂。
权利要求
1.一种降低哺乳动物中如下任何一项或多项的血清水平的方法a)胆固醇；b)低密度脂蛋白(LDL)胆固醇与高密度脂蛋白(HDL)胆固醇的比值；c)低密度脂蛋白(LDL)胆固醇；d)极低密度脂蛋白(VLDL)胆固醇；e)载脂蛋白B；以及f)甘油三酯该方法包括摄入一种含有β-酪蛋白的组合物，其中的β-酪蛋白含有至少95％的β-酪蛋白A2。
2.权利要求1所述的方法，其中，β-酪蛋白只含有β-酪蛋白A2。
3.一种用于治疗与哺乳动物血清胆固醇水平、LDL胆固醇水平、载脂蛋白B水平、或者甘油三酯水平相关的任何疾病或病症的方法，包括摄入一种含有β-酪蛋白的组合物，其中的β-酪蛋白含有至少95％的β-酪蛋白A2。
4.权利要求3所述的方法，其中的疾病或病症选自高胆固醇血症、高脂血症以及动脉粥样硬化。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，该组合物为一种食物或食品。
6.权利要求5所述的方法，其中，该食物或食品为奶或一种含有奶或由奶制成的产品。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，该组合物为一种饮食添加剂。
8.权利要求7所述的方法，其中，该饮食添加剂为一种营养药物，其可被摄取用以优化以下任何一项或多项，包括运动中的表现、减轻体重、增重、增强肌肉以及肌肉修复。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，该组合物为含有β-酪蛋白的奶，其中的β-酪蛋白含有至少95％的β-酪蛋白A2。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，β-酪蛋白只含有β-酪蛋白A2。
11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，该组合物通过添加足以改变人类血清胆固醇水平和/或血清甘油三酯水平的量的β-酪蛋白A2而得到。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，β-酪蛋白A2获自畜牛牛奶，或获自牦牛、水牛、绵羊或山羊奶。
13.β-酪蛋白A2在生产一种组合物中的用途，该组合物可用于降低哺乳动物中如下任何一项或多项的血清水平a)胆固醇；b)低密度脂蛋白(LDL)胆固醇与高密度脂蛋白(HDL)胆固醇的比值；c)低密度脂蛋白(LDL)胆固醇；d)极低密度脂蛋白(VLDL)胆固醇；e)载脂蛋白B；以及f)甘油三酯。
14.一种通过向用于人类食用消耗的食物或饮料中添加β-酪蛋白所形成的饮食添加剂，其中的β-酪蛋白含有至少95％的β-酪蛋白A2。
15.权利要求13所述的饮食添加剂，其中的β-酪蛋白只含有β-酪蛋白A2。
16.权利要求13所述的饮食添加剂，其中的β-酪蛋白A2获自畜牛牛奶，或获自牦牛、水牛、绵羊或山羊奶。
全文摘要
一种通过摄入一种含有β－酪蛋白A
文档编号A61P9/10GK1720062SQ200380104926
公开日2006年1月11日 申请日期2003年10月3日 优先权日2002年10月4日
发明者C·N·S·麦克拉克伦, J·H·坎贝尔, K·A·泰尔弗德, U·麦克拉克伦 申请人:A2有限公司