专利名称：一种利用PolyHEMA检测细胞变形能力的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测细胞变形能力的方法，尤其涉及一种利用PolyHEMA检测细胞变形能力的方法，属医药生物技术领域。
背景技术：
肿瘤的转移是一个多步骤，多因素，序贯的复杂进程，与肿瘤细胞的粘附，变形运动，迁移能力密切相关。肿瘤转移期间细胞经历了 7个重要的阶段，分别为1、肿瘤无限增殖阶段；2、肿瘤内血管生成阶段；3、肿瘤细胞侵入血管；4、肿瘤细胞脱落至血管内；5、肿瘤在血管内的转移；6、肿瘤细胞穿出血管；7、肿瘤细胞继续生长形成继发性肿瘤。其中，在肿瘤细胞脱离原位，侵入循环系统的过程中；细胞在循环系统处于失巢状态转移的过程；在继发部位，细胞穿出血管，继续生长形成继发性肿瘤的过程中，肿瘤细胞经历了多次变形， 运动，迁移过程以适应外界不良环境，是肿瘤细胞侵袭转移能力的重要表现方式。只有那些变形迁移能力强的肿瘤细胞才能够发生转移。为了研究肿瘤细胞转移性的改变，需要建立简便，快捷的鉴别肿瘤细胞的变形能力的方法，其在肿瘤学研究和控制肿瘤转移的药物研发等方面都有重要的意义。现阶段常用的检测肿瘤细胞变形运动能力的方法有AIH3T3单层细胞侵袭实验模型(MIA) ；Boyden小室侵袭实验；Transwell小室侵袭实验和细胞划痕实验等，现有实验方法对细胞的变形运动，迁移能力检测均有独特的优势和相对的不足之处。1，NIH3T3单层细胞侵袭实验(MIA)是当今检测细胞变形迁移能力常用的技术。 首先，NIH3T3细胞生长融合成为单层细胞，将待测细胞与之一起培养，计数每个视野穿透 NIH3T3细胞的癌细胞的数目，计算单位面积内癌细胞的数目，进行肿瘤细胞运动迁移能力的分析。NIH3T3单层细胞侵袭实验尚不能排除OTH3T3细胞与被检测细胞之间产生的相互影响。2,Transwell小室侵袭实验是将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以有效的检测细胞趋化、迁移和侵袭能力。Boyden小室侵袭实验也是检测细胞变形迁移能力常用的技术。Boyden侵袭小室呈桶状，底部装有聚碳酸醋微孔滤膜，滤膜表面涂有人工基底膜，侵袭小室和培养板共同构成细胞侵袭的上、下室。待测细胞种于上室，下室则是吸引细胞向下迁移的趋化液。有侵袭力的细胞首先粘附于人工基底膜表面，进而分泌基质金属蛋白酶消化降解人工基底膜，并通过迁移运动而穿过多孔滤膜，最后附着在滤膜另一面，穿过滤膜的细胞数目可反映该细胞的侵袭力，因此Boyden小室细胞培养模型具有综合判断肿瘤侵袭和转移的能力。Boyden小室侵袭实验和Transwell小室侵袭实验成本高，操作较为复杂，易受多种实验条件的影响，因此，以上三种方法在实际应用过程中受到限制，不适用于对待检细胞变形运动，迁移能力的大量筛选鉴定。
3，细胞划痕实验是操作较为简单的检测细胞运动能力的方法。是指将细胞培养在培养皿或平板上，待细胞融合后用细胞刮在中央区域画一条线，这条线内的细胞被机械力去除掉了，然后将细胞继续培养，观察细胞向无细胞的划痕区域迁移的情况，来判断细胞的迁移能力。细胞划痕实验虽然可以初步判断细胞运动迁移能力的强弱，但由于在其实验过程中，细胞未经历变形运动，因此不能对细胞的变形能力做出判断。鉴于此，建立一种能够快速有效的、且能够降低成本的检测方法十分必要。
发明内容
针对现有技术中有关细胞变形迁移能力的鉴定方法中的缺点和不足，本发明提供了一种利用PolyHEMA检测细胞变形能力的方法。本发明所述利用PolyHEMA检测细胞变形能力的方法，步骤是(1)以减量法或划痕法制备鉴定用PolyHEMA包被板；其中，所述减量法制备 polyHEMA包被板的方法是在细胞培养板内加入浓度为12mg/ml的polyHEMA乙醇溶液， 使板每孔中polyHEMA终密度为0. 5mg/cm2 2. 5mg/cm2，然后室温下晾干含polyHEMA液的细胞培养板，得到板底呈网络形状的狭隙的减量polyHEMA板(图1A-D)；所述划痕法制备 polyHEMA包被板的方法是在细胞培养板内加入浓度为12mg/ml的polyHEMA乙醇溶液，使板每孔中polyHEMA终密度为2. 5mg/cm2 8. 5mg/cm2，然后室温下晾干含polyHEMA液的细胞培养板，再用一次性注射器针头或手术刀片倾斜15-45度角，在已经制备好的polyHEMA 膜的中央划痕，使划痕宽度为10 μ m 20 μ m，得到板底有人工划痕通道的划痕polyHEMA板 (图 2A，B)；(2)将浓度为IX IO6个细胞/ml 5X IO6个细胞/ml的对数生长期的细胞悬液接种至上述灭菌后的polyHEMA板(图3A-F)中，待细胞勻均铺满polyHEMA板后，置37°C， CO2培养箱中培养12 60h ；期间显微镜下观察细胞在polyHEMA膜与细胞培养板间形成的狭隙中穿越和生长的情况，不能自由穿越polyHEMA狭隙，细胞体积变小，聚集成团，细胞增殖受到阻滞的细胞判定为变形能力弱的细胞；能穿越polyHEMA狭隙，细胞伸展，变为不规则形，细胞贴壁，开始增殖的细胞判定为变形能力强的细胞；细胞变形能力越强，表现为穿越polyHEMA狭隙的细胞越多，贴壁生长的细胞越多；(3)将浓度为IX IO6个细胞/ml 5X IO6个细胞/ml的对数生长期的细胞悬液按 100 μ L细胞悬液/孔接种至灭菌后的96孔减量或划痕polyHEMA板(图4A，B)中，混勻后置37°C，CO2培养箱中培养12 48h，期间每隔1 取每组3个复孔加入10 μ L CCK8，混勻后置37°C，CO2培养箱中继续培养90min ；用酶标仪在450nm处读取并记录数据，依据数据绘制生长曲线；生长曲线中CCK8检测0D450nm值低于刚接种polyHEMA板时0D450nm基础值 120%的，视所对应细胞为变形能力弱的细胞；生长曲线中CCK8检测0D450nm值升高超过刚接种polyHEMA板时0D450nm基础值120%的，视所对应细胞为变形能力强的细胞。上述步骤(1)中，所述细胞培养板优选是6孔细胞培养板和/或96孔细胞培养板。上述减量法制备po 1 yHEMA包被板的方法中，每孔中po 1 yHEMA终密度优选为 1. Omg/cm 2. Omg/cm 。上述划痕法制备po IyHEMA包被板的方法中，每孔中po IyHEMA终密度优选为3. 5mg/cm2 5. 5mg/cm2。本发明所述利用PolyHEMA检测细胞变形能力的方法中，利用PolyHEMA检测细胞变形能力，用显微镜检测细胞形态学的变化和细胞活性及数目的检测相结合，可以有效的区分出细胞的变形能力的强弱。与以往的检测方法相比，具有如下优点1.用polyHEMA板鉴定不会因为细胞间的相互作用影响对肿瘤细胞变形能力的鉴定，因而可以排除细胞表面分子的相互作用和细胞因子等生物性实验因素的影响，单一反映受检细胞的变形运动能力。2.价格较Boyden小室侵袭和Transwell小室便宜，制备鉴定用的polyHEMA板工艺简单，易于操作，相对经济，简便，快捷，适合大规模的细胞药物筛选实验。3.PolyHEMA作为一种阴离子聚合物，对细胞无毒性作用，细胞可以自由穿越 polyHEMA所形成的裂隙，并且可以在polyHEMA所形成的隔离膜下分裂生长。细胞穿越 polyHEMA缝隙的过程需经变形运动，可以模拟体内肿瘤细胞脱离原发部位，进出循环系统的过程。
图1检测细胞变形能力的PolyHEMA培养板的制备(减量法)其中，A 显微镜下观察减量PolyHEMA培养板，B 肉眼观察减量PolyHEMA培养板， C 显微镜下观察均勻PolyHEMA培养板，D 肉眼观察均勻PolyHEMA培养板。图2检测细胞变形能力的PolyHEMA培养板的制备(划痕法)其中，A 显微镜下观察均勻PolyHEMA培养板，B 显微镜下观察划痕PolyHEMA培养板。图3显微镜检测细胞形态结果其中，A 显微镜下观察划痕PolyHEMA培养板；B 显微镜下观察永生化肝癌细胞在划痕PolyHEMA培养板的生长(第Mh) ；C 显微镜下观察肝癌细胞Bel7402穿越划痕 PolyHEMA培养板继续增殖(第Mh) ；D 显微镜下观察肝癌细胞Bel7402穿越减量PolyHEMA 培养板继续增殖(第Mh) ；E 显微镜下观察永生化肝细胞在减量PolyHEMA培养板上的生长(第Mh) ；F 显微镜下观察肝癌细胞Bel7402穿越减量PolyHEMA培养板继续增殖(第 48h)。图4CCK8检测细胞活性结果(生长曲线)其中，A 肝癌细胞系BEL7402，肝永生化细胞L02在减量PolyHEMA培养板上的生长曲线，B 肝癌细胞系BEL7402，肝永生化细胞L02在划痕PolyHEMA培养板上的生长曲线。
具体实施例方式实施例1IPolyHEMA包被板的制备(1) · polyHEMA储备液与工作液的配制用95% 的乙醇溶解 polyHEMA (Sigma，USA)，配成 polyHEMA 终浓度为 120mg/ml 的溶液(即在20ml95%的乙醇中溶解2. 4g polyHEMA，65°C震荡混勻8小时，得polyHEMA储备液)；然后将polyHEMA储备液按体积比1 10的比例用95%的乙醇稀释，制成终浓度为12mg/ml的polyHEMA工作液，4°C保存，备用。(2).减量 polyHEMA 板的制备取12mg/ml的polyHEMA工作液均勻铺到6孔板(每孔底面积9. 6cm2)的底面上， Iml/孔；96孔polyHEMA板(每孔底面积0. 32cm2)为100 μ L/孔。使每孔polyHEMA的终密度为1. 25mg/cm2,室温下自然晾干polyHEMA工作液，得到6孔和96孔减量polyHEMA板 (图 1A-D)。(3).划痕 polyHEMA 板的制备取12mg/ml的polyHEMA工作液均勻铺到6孔板(每孔底面积9. 6cm2)的底面上， 2ml/孔；96孔polyHEMA板(每孔底面积0. 32cm2)为200 μ L/孔。使每孔polyHEMA终密度为2. 5mg/cm2,室温下自然晾干polyHEMA工作液，用一次性注射器针头(4. 5#)或手术刀片(11#)倾斜30度角，在已经制备好的polyHEMA膜的中央划痕，其宽度约18 μ m，即为6孔和96孔划痕polyHEMA板(图2A，B)。制备减量和划痕的6孔和96孔polyHEMA板，使用前将polyHEMA板置于紫外灯下进行照射，以达到细胞培养的无菌要求。1细胞穿越生长模型的建立(1).细胞培养①选生长良好的肝癌细胞BEL7402和肝永生化细胞L02，轻轻摇动培养瓶数次，悬浮起浮着在细胞表面的碎片，然后连同生长液一起倒出，用Hanks液洗一次。②从无细胞面侧加入0. 25%胰蛋白酶消化液4 5ml，翻转培养瓶，使消化液浸没细胞Imin左右。③翻转培养瓶，放置5 lOmin，为促进细胞的消化，可以加入37°C预热的消化液，或在细胞面向上时，用手掌贴着细胞面的瓶外壁，待肉眼观察细胞面出现布纹孔状为止。④倒出消化液， 沿细胞面加入适量新配制的培养液，洗下细胞，并用吸管吹打数次，使细胞分散开，按1 2 或1 3分配传代培养。⑤37°C培养，使细胞贴壁生长，形成单层细胞后再换维持液供试验用。所有实验均采用对数生长期细胞。(2).细胞计数与活力测定①消化收取对数生长期细胞，吹打使细胞尽量使之变成单细胞悬液；②取单细胞悬液，按细胞台盼蓝溶液=9 1的体积比加入0. 4%台盼蓝溶液，混勻后置室温5分钟左右；③准备好洁净的计数板及盖玻片，用玻璃滴管吸取染好并轻轻吹勻的细胞液，将滴管尖端轻轻靠在盖玻与计数板的缝隙间，镜下观察细胞存活率；④将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。静置3分钟；⑤计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。 然后按下式计算细胞数/ml = 4大格细胞总数/4X 10000 ；调整细胞浓度至4X IO6个细胞/ml。(3).细胞接种将肝癌细胞BEL7402，肝永生化细胞L02的细胞悬液分别接种至上述polyHEMA板 (6孔和96孔polyHEMA板)中，polyHEMA板的网络形状的狭隙和人工建立的划痕通道可以由细胞变形能力的大小而定。轻轻晃动培养板，待细胞铺勻后置37°C，CO2培养箱中培养 12 48h，待细胞开始增殖或者结成小团块，进行细胞变形能力的检测。2细胞穿越生长模型的建立
将细胞接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，37°C，CO2培养箱中培养 24 36h，长满后用0. 25%胰酶37°C消化成单细胞悬液后，调整细胞浓度至4 X IO6个细胞 /ml，接种至上述polyHEMA板中(6孔和96孔polyHEMA板)，37°C，CO2培养箱中继续培养 12 她。3对细胞变形能力的鉴定(1).细胞在穿越过程中细胞形态学的检测将肝癌细胞BEL7402，肝永生化细胞L02接种到上述polyHEMA板中(6孔和96 孔polyHEMA板)，待细胞铺勻后置37°C，CO2培养箱中继续培养12 48h，对细胞在上述 polyHEMA板中的生长进行拍照记录。对照观察上述polyHEMA板中的肝癌细胞BEL7402，肝永生化细胞L02在狭隙中穿越和生长的过程，用Nikon ECLIPSE Ti显微镜记录细胞穿越的形态学数据。(2).细胞在穿越过程中生物活性的检测将肝癌细胞BEL7402和永生化细胞L02接种到上述polyHEMA板中，100 μ L/孔，混勻后至37°C，CO2培养箱中持续培养48h，每隔1 取每组3个复孔加入10 μ L CCK8，混勻后至37°C，CO2培养箱中持续培养90min ；用MK3酶标仪在450nm处读取并记录数据，并根据数据绘制它们的生长曲线。(3).鉴定指标的判定①在划痕polyHEMA板中(图3A-C)，肝永生化细胞L02不能自由穿越polyHEMA 狭隙，因而细胞聚集成团，体积变小，细胞增殖受到阻滞(图3B)；而肝癌细胞BEL7402具有较强的变形能力，能有效穿越polyHEMA狭隙，并继续贴壁生长穿越polyHEMA狭隙，细胞伸展，变为不规则形，细胞开始增殖；(图3C)。在减量polyHEMA板中(图3D-F)，肝永生化细胞L02不能自由穿越polyHEMA狭隙，因而细胞形态呈现聚集成团(图3E)，而肝癌细胞 BEL7402具有较强的变形能力，能有效穿越polyHEMA形成的狭隙，并继续贴壁生长(图3D， F)。综上结果，在减量polyHEMA板(图4A)和划痕polyHEMA板(图4B)中，通过细胞的形态可以判定肝癌细胞BEL7402的变形能力强，而永生化细胞L02的变形能力弱。②细胞的生长曲线显示，在减量polyHEMA板(图4A)和划痕polyHEMA板(图4B) 中，肝癌细胞BEL7402继续贴壁生长，CCK8检测中的0D450nm值持续显著性升高，超过刚接种polyHEMA板时0D450nm基础值的120% ；而永生化细胞L02未见细胞增殖，CCK8检测中的0D450nm值升高低于刚接种polyHEMA板时0D450nm基础值的120%。通过上述细胞的生长曲线可以判定肝癌细胞BEL7402的细胞变形能力强于永生化细胞L02。
权利要求
1.一种利用PolyHEMA检测细胞变形能力的方法，步骤是(1)以减量法或划痕法制备鉴定用PolyHEMA包被板；其中，所述减量法制备polyHEMA 包被板的方法是在细胞培养板内加入浓度为12mg/ml的polyHEMA乙醇溶液，使板每孔中 polyHEMA终密度为0. 5mg/cm2 2. 5mg/cm2，然后室温下晾干含polyHEMA液的细胞培养板， 得到板底呈网络形状的狭隙的减量polyHEMA板；所述划痕法制备polyHEMA包被板的方法是在细胞培养板内加入浓度为12mg/ml的polyHEMA乙醇溶液，使板每孔中polyHEMA终密度为2. 5mg/cm2 8. 5mg/cm2，然后室温下晾干含polyHEMA液的细胞培养板，再用一次性注射器针头或手术刀片倾斜15-45度角，在已经制备好的polyHEMA膜的中央划痕，使划痕宽度为10 μ m 20 μ m，得到板底有人工划痕通道的划痕polyHEMA板；(2)将浓度为1X IO6个细胞/ml 5 X IO6个细胞/ml的对数生长期的细胞悬液接种至上述灭菌后的polyHEMA板中，待细胞勻均铺满polyHEMA板后，置37°C，CO2培养箱中培养 12 60h;期间显微镜下观察细胞在polyHEMA膜与细胞培养板间形成的狭隙中穿越和生长的情况，不能自由穿越polyHEMA狭隙，细胞体积变小，聚集成团，细胞增殖受到阻滞的细胞判定为变形能力弱的细胞；能穿越polyHEMA狭隙，细胞伸展，变为不规则形，细胞贴壁，开始增殖的细胞判定为变形能力强的细胞；细胞变形能力越强，表现为穿越polyHEMA狭隙的细胞越多，贴壁生长的细胞越多；(3)将浓度为1X IO6个细胞/ml 5X IO6个细胞/ml的对数生长期的细胞悬液按 100 μ L细胞悬液/孔接种至灭菌后的96孔减量或划痕polyHEMA板中，混勻后置37°C，CO2 培养箱中培养12 48h，期间每隔1 取每组3个复孔加入IOyL CCK8，混勻后置37°C， CO2培养箱中继续培养90min ；用酶标仪在450nm处读取并记录数据，依据数据绘制生长曲线；生长曲线中CCK8检测0D450nm值低于刚接种polyHEMA板时0D450nm基础值120%的， 视为所对应细胞为变形能力弱的细胞；生长曲线中CCK8检测0D450nm值升高超过刚接种 polyHEMA板时0D450nm基础值120%的，视为所对应细胞为变形能力强的细胞。
2.如权利要求1所述利用PolyHEMA检测细胞变形能力的方法，其特征在于所述细胞培养板是6孔细胞培养板和/或96孔细胞培养板。
3.如权利要求1所述利用PolyHEMA检测细胞变形能力的方法，其特征在于所述减量法制备polyHEMA包被板的方法中，每孔中polyHEMA终密度为1. Omg/cm2 2. Omg/cm2。
4.如权利要求1所述利用PolyHEMA检测细胞变形能力的方法，其特征在于所述划痕法制备polyHEMA包被板的方法中，每孔中polyHEMA终密度为3. 5mg/cm2 5. 5mg/cm2。
全文摘要
本发明公开了一种利用PolyHEMA检测细胞变形能力的方法，是通过polyHEMA对细胞与其基质连接处进行部分隔离，对细胞变形能力进行评估检测，通过显微镜记录细胞变形，生长的过程，利用CCK8检测等方法对细胞的变形能力进行量化分级，实现对细胞的变形能力强弱的判定，本发明方法具有相对经济，简便，快捷，易于操作等特点。
文档编号G01N21/84GK102279186SQ20111007326
公开日2011年12月14日 申请日期2011年3月25日 优先权日2011年3月25日
发明者任海全, 任霞, 唐天华, 姜国胜, 宋冠华, 张之勇, 李燕梅, 温培娥, 真钢, 袁长金 申请人:山东省医学科学院基础医学研究所