具有对表达dc-sign的细胞改善的转导效率的慢病毒载体粒子的制作方法
【专利说明】具有对表达DC-SIGN的细胞改善的转导效率的慢病毒载体 粒子
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年3月30日提交的美国专利申请号13/436,472(现为2012年 12月4日公布的美国专利号8, 323, 662);以及2012年6月29日提交的美国临时专利申请 号61/666, 103、2012年12月3日提交的美国临时专利申请号61/732, 756和2013年3月 15日提交的美国临时专利申请号61/789, 575的优先权，所有这些专利均以引用方式整体 并入本文。
[0003] 以电子方式提交的材料的援引并入
[0004] 以引用方式整体并入的是与此同时提交并标识如下的计算机可读氨基酸/核苷 酸序列表：一份246, 173字节的ASCII (文本）文件，名称为"46417A_SeqListing. txt"，创 建日期为2013年3月29日。
技术领域
[0005] 本公开涉及可用于生成改良的假型化慢病毒载体粒子的材料和方法。
【背景技术】
[0006] 树突细胞（DC)是用于引发和控制免疫反应的基本抗原呈递细胞。DC可捕获和加 工抗原，从外周迀移到淋巴器官，并以主要组织相容性复合体（MHC)限制性方式将抗原呈 递至静息T细胞。这些细胞来源于骨髓（BM)并且显示出树枝状形态和高迀移率。DC作为 特化的抗原呈递细胞（APC)这一发现已促进了在基于DC的免疫/接种策略方面的尝试，所 述策略涉及靶向用于展示特异性抗原的DC。已开发了基于重组病毒的载体，作为将编码指 定抗原的基因直接递送至宿主细胞的机理。通过诱导所需的适应性免疫反应，所表达的基 因产物提供了治疗有益效果。
[0007] 实现安全且有效的系统所面临的挑战包括设计有效靶向所需宿主细胞组的载体、 提供合适的递送系统、以及表达引起有效免疫反应的所需抗原以便其可广泛地用于指定的 受试人群。
[0008] 本文所公开的辛德毕斯病毒（Sindbis virus)和其他甲病毒的包膜糖蛋白并入病 毒粒子膜的脂质双层中。通常，病毒膜（包膜）包含由单一前体蛋白的裂解产生的两种糖 蛋白异源二聚体El和E2的三聚体的多个拷贝。从其N端至C端，前体蛋白包含E3、E2、6K 和El蛋白。小的E3糖蛋白充当E2蛋白易位到膜中的信号序列，并通过弗林蛋白酶或一些 其他Ca2+依赖性丝氨酸蛋白酶从E2裂解。6K蛋白充当El蛋白易位到膜中的信号序列，并 且随后从前体蛋白裂解。WO 2008/011636和US 2011/0064763公开了慢病毒包装系统。
【发明内容】
[0009] 本发明人已发现，表现出以下两种特性的慢病毒载体粒子具有出人意料改善的对 表达DC-SIGN的细胞的转导效率：(a)用高度甘露糖化的甲病毒糖蛋白假型化和（b)包含 Vpx蛋白。这些粒子比只具有这两种特性之一的慢病毒载体粒子明显更有效地感染表达 DC-SIGN的细胞，尤其是树突细胞。在特定的情况下，提供了包含Vpx蛋白和含有目标序列 (例如，编码抗原的多核苷酸）的慢病毒基因组的高度甘露糖化假型化慢病毒载体粒子。 [0010] 生成假型化慢病毒载体粒子的方法
[0011] 本公开的一个方面提供生成假型化慢病毒载体粒子的方法，该方法包括：(a)在 包含甘露糖苷酶抑制剂（优选甘露糖苷酶I抑制剂）的培养基中培养病毒包装细胞，该病 毒包装细胞包含：（1)含有编码外源性抗原的多核苷酸的慢病毒载体基因组，（2)编码优先 地结合表达DC-SIGN的细胞的甲病毒糖蛋白的多核苷酸，以及（3)编码SAMHDl抑制剂的多 核苷酸；以及（b)分离优先地结合表达DC-SIGN的细胞的假型化慢病毒载体粒子。
[0012] 本公开的另一个方面提供生成假型化慢病毒载体粒子的方法，该方法包括：(a) 在包含kifunensine的培养基中培养病毒包装细胞，该病毒包装细胞包含：（1)含有编码外 源性抗原的多核苷酸的慢病毒载体基因组，（2)编码优先地结合表达DC-SIGN的树突细胞 的辛德毕斯E2糖蛋白的多核苷酸，以及（3)编码保持SAMHDl抑制活性的Vpx蛋白或Vpr 蛋白的多核苷酸；以及（b)分离优先地结合表达DC-SIGN的树突细胞的假型化慢病毒载体 粒子。在一些实施方案中，E2糖蛋白与SEQ ID N0:30[SIN-Varl]具有90%同一性。在 一些实施方案中，（i)E2糖蛋白的残基160不存在或为非谷氨酸的氨基酸，（ii)E2糖蛋白 变体的残基70、76或159中的一个或多个为非碱性残基，并且（iii)E2糖蛋白变体不是与 辛德毕斯病毒E3糖蛋白的融合蛋白的一部分。在一些实施方案中，E2糖蛋白为SEQ ID NO:30[SIN-Var1]。
[0013] 在本文所述的一些或任何实施方案中，Vpx蛋白包含与SIVmac Vpx(SEQ ID N0:44)具有至少80%同一性的氨基酸序列。
[0014] 在本文所述的一些或任何实施方案中，Vpx蛋白包含与SIVmac Vpx(SEQ ID N0:44)、SIVsm Vpx(SEQ ID N0:45)、SIVrcm Vpx(SEQ ID N0:46)或 HIV-2Vpx(SEQ ID N0:47)具有至少90%同一性的氨基酸序列。
[0015] 在本文所述的一些或任何实施方案中，Vpr蛋白包含与SIVdeb Vpr(SEQ ID NO: 48)或SIVmus Vpr (SEQ ID NO: 49)具有至少90%同一性的氨基酸序列。
[0016] 在本文所述的一些或任何实施方案中，抗原为肿瘤特异性抗原或病毒特异性抗 原。在本文所述的一些或任何实施方案中，肿瘤特异性抗原选自NY-ESO-1、MAGE(例如， MAGE-A3 和 MAGE-A1)、MART-I/ 黑色素-A(Melan-A)、BAGE、RAGE、gplOO、gp75、mda-7、酪氨 酸酶、酪氨酸酶相关蛋白（例如，TRP2)、肾细胞癌抗原、5T4、SM22-a、碳酸酐酶I、碳酸酐酶 IX(也称为G250)、HIF-I a、HIF-2 a、VEGF、前列腺特异性膜抗原（PSMA)、前列腺特异性抗 原（PSA)、前列腺酸性磷酸盐、前列腺六跨膜表皮抗原（STEAP)、NKX3. 1、端粒酶、存活素、间 皮素、突变ras、bcr/abl重排、Her2/neu、突变p53、野生型p53、细胞色素 P4501B1、N-乙酰 氨基葡糖转移酶-V、人乳头瘤病毒蛋白E6、人乳头瘤病毒蛋白E7、癌胚抗原、梅克尔细胞病 毒T抗原癌蛋白和甲胎蛋白。在本文所述的一些或任何实施方案中，病毒特异性抗原为HIV 抗原、SIV抗原、腺病毒抗原、肠病毒抗原、冠状病毒抗原、杯状病毒抗原、犬瘟热病毒抗原、 埃博拉病毒抗原、黄病毒抗原、肝炎病毒抗原、疱瘆病毒抗原、感染性腹膜炎病毒抗原、流感 病毒抗原、白血病病毒抗原、马尔堡病毒（Marburg virus)抗原、正粘病毒抗原、乳头状瘤病 毒抗原、副流感病毒抗原、副粘病毒抗原、细小病毒抗原、瘟病毒抗原、微小核糖核酸病毒抗 原、脊髓灰质炎病毒抗原、痘病毒抗原、多瘤病毒抗原、狂犬病毒抗原、呼肠孤病毒抗原、逆 转录病毒抗原或轮状病毒抗原。
[0017] 在本文所述的一些或任何实施方案中，慢病毒载体基因组还包含编码第二抗原的 核苷酸序列。在本文所述的一些或任何实施方案中，第一和第二抗原作为在这两种抗原之 间包含自裂解A2肽的融合蛋白而表达。在本文所述的一些或任何实施方案中，自裂解A2 肽包含SEQ ID NO: 56或SEQ ID NO: 57的氨基酸序列。在本文所述的一些或任何实施方案 中，第一抗原为MAGE-A3并且第二抗原为NY-ESO-I。
[0018] 在本文所述的一些或任何实施方案中，kifunensine以约0. 01 μ g/ml至约Img/ ml的浓度存在于培养基中。在本文所述的一些或任何实施方案中，kifunensine以约 0. 1 μ g/ml至约1 μ g/ml的浓度存在于培养基中。在本文所述的一些或任何实施方案中， kifunensine以约0. 25 μ g/ml至约2 μ g/ml的浓度存在于培养基中。
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