i)所述E2糖蛋白变体的残基70、76或159中的一个或多个为非 碱性残基，并且（iii)所述E2糖蛋白变体不是与辛德毕斯病毒E3糖蛋白的融合蛋白的一 部分。
32. 根据权利要求30所述的方法，其中所述E2糖蛋白为SEQ ID N0:30[SIN-Varl]。
33. 根据权利要求29-32中任一项所述的方法，其中所述Vpx蛋白包含与SIVmac Vpx[SEQ ID N0:44]具有至少80%同一性的氨基酸序列。
34. 根据权利要求29-32中任一项所述的方法，其中所述Vpx蛋白包含与SI Vmac Vpx(SEQ ID NO:44)、 SIVsm Vpx(SEQ ID NO:45)、 SIVrcm Vpx(SEQ ID NO:46)或 HIV-2Vpx(SEQ ID N0:47)具有至少90%同一性的氨基酸序列。
35. 根据权利要求29-32中任一项所述的方法，其中所述Vpx蛋白包含与SlVdeb Vpr (SEQ ID NO: 48)或 SIVmus Vpr (SEQ ID NO: 49)具有至少 90% 同一性的氨基酸序列。
36. 根据权利要求29-35中任一项所述的方法，其中所述抗原为肿瘤特异性抗原或病 毒特异性抗原。
37. 根据权利要求36所述的方法，其中所述肿瘤特异性抗原选自NY-ESO-1、MAGE、 MART-1/黑色素-A、BAGE、RAGE、gplOO、gp75、mda-7、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白、肾细胞 癌抗原、5T4、SM22_a、碳酸酐酶I、碳酸酐酶IX(也称为G250)、HIF_la、HIF_2a、VEGF、前 列腺特异性膜抗原（PSMA)、前列腺特异性抗原（PSA)、前列腺酸性磷酸盐、前列腺六跨膜表 皮抗原（STEAP)、NKX3. 1、端粒酶、存活素、间皮素、突变ras、bcr/abl重排、Her2/neu、突变 P53、野生型p53、细胞色素P4501B1、N-乙酰氨基葡糖转移酶-V、人乳头瘤病毒蛋白E6、人 乳头瘤病毒蛋白E7、癌胚抗原和甲胎蛋白。
38. 根据权利要求36所述的方法，其中所述病毒特异性抗原为HIV抗原、SIV抗原、腺 病毒抗原、肠病毒抗原、冠状病毒抗原、杯状病毒抗原、犬瘟热病毒抗原、埃博拉病毒抗原、 黄病毒抗原、肝炎病毒抗原、疱瘆病毒抗原、感染性腹膜炎病毒抗原、流感病毒抗原、白血病 病毒抗原、马尔堡病毒抗原、正粘病毒抗原、乳头状瘤病毒抗原、副流感病毒抗原、副粘病毒 抗原、细小病毒抗原、瘟病毒抗原、微小核糖核酸病毒抗原、脊髓灰质炎病毒抗原、痘病毒抗 原、狂犬病毒抗原、呼肠孤病毒抗原、逆转录病毒抗原或轮状病毒抗原。
39. 根据权利要求29-38中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体基因组还包含编 码第二抗原的核苷酸序列。
40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述第一和第二抗原作为在所述两种抗原之间 包含自裂解A2肽的融合蛋白而表达。
41. 根据权利要求40所述的方法，其中自裂解A2肽包含SEQ ID N0:56或SEQ ID N0:57 的氨基酸序列。
42. 根据权利要求39至41中任一项所述的方法，其中所述第一抗原为NY-ES0-1并且 所述第二抗原为MAGE-A3。
43. 根据权利要求39所述的方法，其中所述第一和第二抗原由双向启动子表达。
44. 根据权利要求29-43中任一项所述的方法，其中所述kifunensine以约0. 1 y g/ml 至约10 y g/ml的浓度存在于培养基中。
45. 根据权利要求44所述的方法，其中所述kifunensine以约0. 25 y g/ml至约2 y g/ ml的浓度存在于培养基中。
46. 根据权利要求29-45中任一项所述的方法，其中所述病毒包装细胞还包含： (i) 包含gag和pol基因的多核苷酸；以及 (ii) 编码rev蛋白的多核苷酸。
47. 根据权利要求46所述的方法，其中所述gag和pol基因为人类密码子优化的并且 包含SEQ ID NO:54的位置1228至1509周围的非优化窗。
48. 根据权利要求46或47所述的方法，其中包含gag和pol基因的所述多核苷酸不含 功能性rev应答元件（RRE)。
49. 根据权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述pol基因编码无活性整合 酶。
50. 根据权利要求49所述的方法，其中所述整合酶具有D64V突变。
51. 根据权利要求46至50中任一项所述的方法，其中编码所述Vpx蛋白的所述多核苷 酸与编码所述rev蛋白的所述多核苷酸或者包含所述gag和pol基因的所述多核苷酸在相 同或不同的质粒上。
52. 根据权利要求29至51中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体基因组衍生自 HIV-1。
53. 根据权利要求29至52中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体基因组具有灭活 的3'长末端重复序列（LTR)或自灭活3'长末端重复序列（LTR)。
54. 根据权利要求53所述的方法，其中所述慢病毒载体基因组包含不含增强子序列、 TATA盒、Spl位点、NK-kB位点或聚嘌呤区（PPT)中的至少一个的U3元件。
55. 根据权利要求29至54中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体基因组包含SEQ ID NO:21、22或23任一者的核苷酸序列。
56. 根据权利要求29至55中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体基因组还包含编 码树突细胞成熟/刺激因子的核苷酸序列。
57. 根据权利要求56所述的方法，其中所述树突细胞成熟/刺激因子选自GM-CSF、 IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-15、IL-21、IL-23、TNFa、B7. 1、B7. 2、4_1BB、CD40 配体和药物 诱导型⑶40。
58. 根据权利要求29至57中任一项所述的方法，其中编码抗原的所述核苷酸序列可操 作地连接到选自人泛素-C启动子（UbiC)、巨细胞病毒立即早期启动子（CMV)、劳氏肉瘤病 毒启动子（RSV)和四环素反应性启动子的启动子。
59. 根据权利要求58所述的方法，其中所述启动子为内含子缺陷型启动子。
60. 根据权利要求59所述的方法，其中所述内含子缺陷型启动子为UbiC启动子。
61. 通过根据权利要求29-45所述的方法产生的慢病毒载体粒子。
62. 通过根据权利要求46-60所述的方法产生的慢病毒载体粒子。
63. -种生成假型化慢病毒载体粒子的方法，所述方法包括： (a)在包含kifunensine的培养基中培养病毒包装细胞，所述病毒包装细胞包含： (1)含有编码MAGE-A3和NY-ES0-1的多核苷酸的慢病毒载体基因组，其中将编码自裂 解TA2肽的多核苷酸设置在编码MAGE-A3与NY-ES0-1的所述多核苷酸之间，其中所述慢病 毒基因组不含聚嘌呤区（PPT)，并且其中MAGE-A3和NY-ES0-1的表达受不含内含子的UbiC 启动子控制， (2) 编码优先地结合表达DC-SIGN的树突细胞的辛德毕斯E2糖蛋白的多核苷酸， (3) 包含人类密码子优化的gag和pol基因的多核苷酸，其中所述多核苷酸不含功能性 rev应答元件（RRE)并且其中所述pol基因编码无活性整合酶， (4) 编码保持SAMHD1抑制活性的Vpx蛋白或Vpr蛋白的多核苷酸，以及 (b)分离优先地结合表达DC-SIGN的树突细胞的假型化慢病毒载体粒子。
【专利摘要】本发明提供了可用于生成包含Vpx蛋白的高度甘露糖化假型化慢病毒载体粒子的材料和方法。
【IPC分类】C07K14-18, C12N15-867, A61K39-00, C07K14-16
【公开号】CN104583231
【申请号】CN201380028044
【发明人】克里斯多福·詹姆士·尼可莱, 山米·U.·塔林
【申请人】免疫设计公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年3月29日
【公告号】CA2868838A1, EP2831095A1, WO2013149167A1