艾杜糖-2-硫酸酯酶的纯化的制作方法
【专利说明】艾杜糖-2-硫酸酯酶的纯化
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年6月29日提交的美国临时专利申请系列号61/666, 733的优 先权；其完整内容在此通过引用并入。
[0003] 序列表
[0004] 在本说明书提及在2013年6月27日以电子形式提交的命名为"2006685-0342_ SEQ_LIST"的ASCII, txt文件的序列表。所述.txt文件于2013年6月25日产生，并且大 小为15KB。将序列表的全部内容通过引用并入本文。
[0005] 背景
[0006] 粘多糖贮积症II型（MPS II，亨特综合症）是因酶艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)的 缺乏而引起的X染色体连锁隐性溶酶体贮积症。I2S从葡糖氨基聚糖（GAG)硫酸皮肤素和 硫酸乙酰肝素切割末端2-0-硫酸酯部分。由于亨特综合症患者中丧失I2S酶或存在有缺 陷的I2S酶，因此GAG在多种细胞类型的溶酶体中逐渐累积，从而导致细胞肿胀，器官肿大， 组织破坏和器官系统功能障碍。
[0007] 一般而言，具有亨特综合症的人的身体表现包括躯体和神经症状。例如，在亨特综 合症的一些病例中，中枢神经系统受累导致发育迟缓和神经系统的问题。而亨特综合症的 非神经症状在出生时一般不存在，随着时间的推移，GAG在体内细胞中的渐进累积可能对身 体的外周组织具有巨大影响。GAG在外周组织中的累积导致患者面部特征的鲜明粗糙度，并 且造成前额突出、扁平桥和巨舌，此为亨特综合征患者的最典型特征。类似地，GAG的累积 可不利地影响身体的器官系统。最初表现为心脏、肺和呼吸道的壁的增厚，以及肝、脾和肾 的异常肿大，这些深刻的变化最终可导致广泛的灾难性器官衰竭。因此，亨特综合症总是严 重的、进行性的和限制寿命的。
[0008] 酶替代疗法（ERT)是用于治疗亨特综合症（MPS II)的批准的疗法，其包括向亨特 综合症患者施用外源替代I2S酶。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明除其它事项以外提供了用于纯化重组产生以用于酶替代疗法的I2S蛋白 的改进方法。本发明部分地基于以下令人惊讶的发现，即可使用包括少至4个色谱柱的工 艺从未经处理的生物材料例如含I2S的细胞培养基纯化重组I2S蛋白。用于酶替代疗法的 重组I2S的批准现有的纯化工艺包括6个色谱柱。如在实施例部分中描述的，使用根据本发 明的4柱工艺纯化的重组I2S蛋白符合美国和许多其他国家的市场营销纯度要求。此外， 根据本发明纯化的重组I2S酶保留高百分比的C a-甲酰甘氨酸（FGly)(例如，高于70%并 高达100% )(这对于I2S酶的活性是重要的）和明显的特性例如唾液酸含量和聚糖图谱 (这可促进重组I2S蛋白的生物利用度和/或溶酶体靶向）。因此，本发明提供了有效的、 更廉价且更快速的用于纯化重组I2S蛋白的工艺。本发明特别适用于纯化在无血清培养基 中产生的重组I2S蛋白。
[0011] 因此，在一个方面，本发明提供了使用基于阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混 合模式色谱和疏水相互作用色谱中的一种或多种的工艺从不纯制剂纯化重组I2S蛋白的 方法。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法包括少于6个（例如，少于5个，少于4 个或少于3个）色谱步骤。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法包括2、3、4或5个 色谱步骤。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法包括4个色谱步骤。在一些实施方 案中，根据本发明的纯化的重组I2S蛋白含有小于lOOng/mg的宿主细胞蛋白质（HCP)(例 如，小于 90ng/mg 的 HCP、小于 80ng/mg 的 HCP、小于 70ng/mg 的 HCP、小于 60ng/mg 的 HCP、 小于 50ng/mg 的 HCP、小于 40ng/mg 的 HCP、小于 30ng/mg 的 HCP、小于 20ng/mg 的 HCP、小于 10ng/mg 的 HCP)。
[0012] 在一些实施方案中，合适的阴离子交换色谱为Q色谱。在一些实施方案中，合适的 阳离子交换色谱为SP色谱。在一些实施方案中，适合的混合模式色谱为羟基磷灰石（HA) 色谱。在一些实施方案中，合适的疏水相互作用色谱为苯基色谱。
[0013] 预期阴离子交换色谱（例如，0柱）、阳离子交换色谱（例如，SP柱）、混合模式色 谱（例如，HA柱）以及疏水相互作用色谱（例如，苯基柱）可以以任何顺序进行。在一些实 施方案中，根据本发明的方法按照该顺序进行阴离子交换色谱（例如，〇柱）、阳离子交换色 谱（例如，SP柱）、混合模式色谱（例如，HA柱）以及疏水相互作用色谱（例如，苯基柱）。
[0014] 在一些实施方案中，在上样至阴离子交换色谱柱（例如，Q柱）之前，将不纯制剂 或中间洗脱液或过柱液（flow-through)调整至约5. 0-7. 0(例如，约5. 0、5. 5、6. 0、6. 5或 7.0)的？11以及约10-201115/〇11(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或201115/〇11)的电 导率。在一些实施方案中，使用IM醋酸钠调整pH。在一些实施方案中，使用5M氯化钠调 整电导率。在一些实施方案中，上样后，使用pH为约5. 0-7. 0 (例如，约5. 0、5. 5、6. 0、6. 5 或 7. 0)的包含在约 HOmM 至 200mM(例如，约 140mM、145mM、150mM、155mM、160mM、165mM、 170mM、175mM、180mM、185mM、190mM、195mM 或 200mM)的范围内的盐（例如，NaCl)浓度的洗 涤缓冲液洗涤阴离子交换色谱柱。在一些实施方案中，使用包含线性盐（例如，NaCl)梯 度的洗脱缓冲液洗脱阴离子交换色谱柱。在一些实施方案中，适当的线性NaCl梯度含有 在约 0-500mM 范围内的 NaCl (例如，约 0-400mM、约 0-350mM、约 0-300mM、约 50-500mM、约 150-500mM、约 150-450mM、约 150-400mM)。
[0015] 在一些实施方案中，在上样至阳离子交换色谱柱（例如，SP柱）之前，将不纯制 剂或中间洗脱液或过柱液调整至在约lmS/cm与20mS/cm之间（例如，约lmS/cm与15mS/ cm 之间、约 lmS/cm 与 10mS/cm 之间、约 lmS/cm 与 8mS/cm 之间、约 lmS/cm 与 6mS/cm 之间、 约lmS/cm与4mS/cm之间、约2mS/cm与4mS/cm)的范围内的电导率。在一些实施方案中， 在上样至阳离子交换色谱柱（例如，SP柱）之前，将不纯制剂或中间洗脱液或过柱液调整 至在约2mS/cm与4mS/cm之间（例如，2、2. 5、3、3. 5或4mS/cm)的范围内的电导率。在一 些实施方案中，通过用 H2O 以约 1-2:1(例如，1:1、1. 1:1、1. 2:1、1. 3:1、1. 4:、1. 5:1、1. 6:1、 I. 7:1、I. 8:1、1. 9:1或2:1)的比率从阴离子交换色谱柱稀释洗脱液来调整电导率。在一些 实施方案中，通过渗滤调整电导率。在一些实施方案中，在约5. 0-6. 5 (例如，约5. 0、5. 5、 6.0或6. 5)的pH下运行阳离子交换色谱柱。在一些实施方案中，利用包含在约0. OlM至 约 0· IM (例如，约 0· 01Μ、0· 02Μ、0· 03Μ、0· 04Μ、0· 05Μ、0· 06Μ、0· 07Μ、0· 08Μ、0· 09M 或 0· 1M) 的范围内的磷酸盐（例如，NaP04)浓度的缓冲液运行阳离子交换色谱柱。在一些实施方案 中，合适的pH为约5. 0-6. 5 (例如，约5· 0、5· 5、6· 0或6. 5)。
[0016] 在一些实施方案中，在上样至混合模式色谱柱（例如，HA柱）之前，将不纯制剂 或中间洗脱液或过柱液调整至在约0. OOlM至约0. OlM(例如，约0. 001M、0. 002M、0. 003M、 0. 004M、0. 005M、0. 006M、0. 007M、0. 008M、0. 009M 或 0. 01M)的范围内的磷酸盐（例如， NaP04)浓度和约5. 0-6. 5(例如，约5. 0、5. 5、6. 0或6. 5)的pH。在一些实施方案中，在上 样后，用中性pH或接近中性pH的含有磷酸盐（例如，I-IOmM的磷酸钠或磷酸钾）的洗涤缓 冲液来洗涤混合模式色谱柱（例如，HA柱）。在一些实施方案中，用具有在约10-20mM(例 如，约 10-18mM、10-16mM、10-15mM、12-20mM、14-18mM、14-16mM)的范围内的磷酸盐浓度的 洗涤缓冲液洗涤上样的混合模式色谱柱（例如，HA柱）。在一些实施方案中，用具有是或 大于 10mM、I ImM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM 的磷酸盐浓度的洗 涤缓冲液洗涤上样的混合模式色谱柱（例如，HA柱）。在一些实施方案中，用梯度磷酸盐 缓冲液实现从混合模式色谱柱（例如，HA柱）的洗脱。在一些实施方案中，适当的洗脱缓 冲液可具有约 l_400mM(例如，l-300mM、l-200mM、l-150mM、l-100mM、10-350mM、10-300mM、 10-250mM、10-200mM、10-150mM、10-140mM、10-130mM、10-120mM、10-110mM、10-100mM、 10-90mM、10-80mM、10-70mM、10-60mM、10-50mM)的磷酸钠或磷酸钾的磷酸盐梯度。在一些 实施方案中，通过逐步增加洗脱缓冲液中的磷酸盐浓度实现从HA柱的洗脱。在一些实施 方案中，逐步洗脱缓冲液可具有选自 10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、 100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM 的磷酸盐（例 如，磷酸钠）浓度。在一些实施方案中，通过具有在约50mM至150mM的范围内的磷酸盐（例 如，磷酸钠）浓度（例如，选自 50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、 140mM、150mM及其组合的磷酸盐（例如，磷酸钠）浓度）的洗脱缓冲液实现从混合模式色谱 柱（例如，HA柱）的洗脱。
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