9] 色谱：如本文中所用，"色谱"是指用于混合物的分离的技术。通常情况下，将混合 物溶解在称为"流动相"的流体中，所述流体携带其通过称为"固定相"的保持另一种材料 的结构。柱色谱是其中固定床在管（即柱）内的分离技术。
[0050] 稀释剂：如本文中所用，术语"稀释剂"是指用于复水制剂的制备的药学上可接受 的（例如，对于向人施用是安全和无毒的）稀释物质。示例性稀释剂包括无菌水、注射用 抑菌水（BWFI)、pH缓冲液（例如，磷酸盐缓冲盐水）、无菌盐溶液、林格氏溶液（Ringer' s solution)或葡萄糖溶液。
[0051] 洗脱：如本文中所用，术语"洗脱"是指通过用溶剂洗涤来从另一种材料提取一种 材料的过程。例如，在离子交换色谱中，洗脱是洗涤上样树脂以除去捕获的离子的过程。
[0052] 洗脱液：如本文中所用，术语"洗脱液"是指通常作为洗脱结果的流动相"载体"与 出自色谱的分析材料的组合。
[0053] 酶替代疗法（ERT):如本文中所用，术语"酶替代疗法（ERT) "指的是通过提供缺失 的酶校正酶缺乏的任何治疗策略。一旦施用，酶被细胞吸收并转运至溶酶体，在溶酶体中酶 用于消除因酶缺乏而在溶酶体中积累的物质。通常情况下，为了使溶酶体酶替代疗法有效， 将治疗性酶递送至其中表现贮积缺陷的靶组织中适合的细胞中的溶酶体中。
[0054] 使平衡或平衡：如本文中所用，关于色谱的术语"使平衡"或"平衡"是指用另一种 液体使第一液体（例如，缓冲液）平衡，通常以实现液体（例如，缓冲液）的组分的稳定和 均衡分布的过程。例如，在一些实施方案中，色谱柱可通过使一个或或多个柱体积的所需液 体（例如，缓冲液）通过柱来进行平衡。
[0055] 提高、增加或减少：如本文中所用，术语"提高"、"增加"或"减少"或语法等同物， 指示相对于基线测量，例如在本文中描述的治疗开始之前相同个体中的测量或在本文中描 述的治疗不存在的情况下对照个体（或多个对照个体）中的测量的值。"对照个体"是患有 与正在治疗的个体相同的溶酶体贮积病形式的个体，所述个体与正在治疗的个体年龄大致 相同（以确保被治疗个体与对照个体的疾病分期是可比较的）。
[0056] 杂质：如本文中所用，术语"杂质"是指有限量的液体、气体或固体内的与目标材料 或化合物的化学组成不同的物质。杂质也称为污染物。
[0057] 接头：如本文中所用，"接头"是指在融合蛋白中，除在天然蛋白质中的特定位置上 出现的氨基酸序列外的氨基酸序列，并且其通常被设计成柔性的或插入在两个蛋白质部分 之间的结构，例如α-螺旋。接头也称为间隔子。
[0058] 上样：如本文中所用，术语"上样"是指在色谱中，将含有样品的液体或固体添加 至柱。在一些实施方案中，当上样的样品通过柱时，上样至柱上的样品的特定组分随后被捕 获。在一些实施方案中，当上样的样品通过柱时，上样至柱上的样品的特定组分未被柱捕获 或"流过"柱。
[0059] 多肽：如本文中所用，"多肽"，一般来说，是通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸 的串。在一些实施方案中，多肽可以包括至少3-5个氨基酸，其每一个通过至少一个肽键连 接于其它氨基酸。本领域普通技术人员将理解，多肽有时任选地包括"非天然"氨基酸或然 而能够任选地掺入多肽链的其它实体。
[0060] 汇集：如本文中所用，与色谱相关的术语"汇集"是指将一个或多个已通过柱的液 体级分组合在一起。例如，在一些实施方案中，可将一个或多个已通过色谱分离的包含样品 的期望组分的级分（例如，"峰级分"）"汇集"一起，产生单个"汇集"级分。
[0061] 替代酶：如本文中所用，术语"替代酶"是指可用于至少部分地替代待治疗的疾病 中的有缺陷或缺失的酶的任何酶。在一些实施方案中，术语"替代酶"是指可用于至少部分 地替代待治疗的溶酶体贮积症中的有缺陷或缺失的溶酶体酶的任何酶。在一些实施方案 中，替代酶能够减少哺乳动物溶酶体中积累的材料或者能够挽救或改善一种或多种溶酶体 贮积病症状。适合于本发明的替代酶包括野生型溶酶体酶或经修饰的溶酶体酶并且可使用 重组的和合成的方法来产生或从自然来源纯化而来。替代酶可以是重组的、合成的、基因活 化的或天然的酶。
[0062] 可溶的：如本文中所用，术语"可溶的"是指治疗剂形成均质的溶液的能力。在一 些实施方案中，治疗剂在其中被施用和借助其被转运至靶作用位点的溶液中的溶解度足以 允许治疗有效量的治疗剂至靶作用位点的递送。若干因素可影响治疗剂的溶解度。例如， 可影响蛋白质溶解度的相关因素包括离子强度、氨基酸序列和其它共增溶剂或盐（例如， 钙盐）的存在。在一些实施方案中，根据本发明的治疗剂可溶于其相应的药物组合物。 [0063] 稳定性：如本文中所用的，术语"稳定的"是指治疗剂（例如，重组酶）在长时期内 保持其治疗效能（例如，全部或大部分其预期的生物学活性和/或生理化学完整性）的能 力。可在长时期内（例如，至少1，3,6，12，18,24,30、36个月或更长时间）评估治疗剂的稳 定性和药物组合物维持这样的治疗剂的稳定性的能力。在制剂的情形中，稳定的制剂是如 下的制剂，其中的治疗剂在贮存后和在处理（例如冷冻/解冻、机械混合和冷冻干燥）过程 中基本上维持其物理和/或化学完整性和生物活性。对于蛋白质稳定性，其也可通过高分 子量（HMW)聚集物的形成、酶活性的丧失、肽片段的产生和电荷特征谱的移位来测量。
[0064] 病毒处理：如本文中所用，术语"病毒处理"是指其中病毒被简单地从样品除去的 "病毒去除"，或其中病毒保留在样品中但以非感染性形式存在的"病毒灭活"。在一些实施 方案中，病毒去除可以利用除其它以外，纳米过滤和/或色谱技术。在一些实施方案中，病 毒灭活可利用除其它以外，溶剂灭活、去垢剂灭活、巴氏消毒法、酸性PH灭活和/或紫外线 灭活。
[0065] 发明详述
[0066] 本发明除其它事项以外提供了基于包括少于6个色谱步骤的方法的用于纯化用 于酶替代疗法的重组I2S蛋白的改进的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用基于 阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱和疏水相互作用色谱中的一种或多种的 工艺从不纯制剂种纯化重组I2S蛋白的方法。在一些实施方案中，本发明提供了通过进行 Q色谱、羟基磷灰石（HA)色谱、SP色谱、苯基色谱来从不纯制剂纯化重组I2S蛋白的方法。 本发明还提供了纯化的重组I2S蛋白及使用方法。
[0067] 在以下小节中进一步详细地描述了本发明的各个方面。小节的使用并不意味着限 制本发明。每一个小节可适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，否则"或" 的使用表示"和/或"。
[0068] 重组I2S蛋白
[0069] 如本文中所用，I2S蛋白是可取代天然存在的艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)蛋白的 至少部分活性或挽救一个或多个与I2S缺乏相关的表型或症状的任何蛋白质或蛋白质的 部分。如本文中所用，术语" I2S酶"和" I2S蛋白"以及语法等同物可互换使用。
[0070] 通常情况下，人I2S蛋白作为前体形式产生。人I2S的前体形式包含信号肽（全 长前体的氨基酸残基1-25)、原肽（全长前体的氨基酸残基26-33)和一条链（全长前体的 残基34-550)，所述链可被进一步加工成42kDa的链（全长前体的残基的34-455)和HkDa 的链（全长前体的残基446-550)。通常情况下，前体形式也称为全长前体或全长I2S蛋白， 其含有550个氨基酸。已除去信号肽的成熟形式的氨基酸序列（SEQ ID NO: 1)和典型野生 型或天然存在的人I2S蛋白的全长前体的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)示于表1中。信号肽 加以下划线。此外，人I2S蛋白同种型a和b前体的氨基酸序列也分别提供于表1中的SEQ ID NO :3 和 4。
[0071] 表1.人艾杜糖-2-硫酸酯酶
[0072]
【主权项】
1. 一种包含纯化的重组艾杜-2-硫酸酯酶（I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫酸 酯酶具有与SEQ ID NO: 1具有至少70%的同一性的氨基酸序列， 其中所述纯化的重组I2S包含至少约70%的对应于SEQ ID NO: 1的Cys59的所述半胱 氨酸残基至Ca-甲酰甘氨酸（FGly)的转化和 另外地其中所述纯化的重组I2S含有小于150ng/mg的宿主细胞蛋白质（HCP)。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S含有小于100ng/mg的HCP。
3. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S含有小于80ng/mg的HCP。
4. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S含有小于60ng/mg的HCP。
5. -种包含纯化的重组艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫 酸酯酶具有与SEQ ID NO: 1具有至少70%的同一性的氨基酸序列 其中所述纯化的重组I2S包含至少约70%的对应于SEQ ID NO: 1的Cys59的所述半胱 氨酸残基至Ca-甲酰甘氨酸（FGly)的转化和 另外地其中所述纯化的重组I2S含有平均每分子至少16个唾液酸。
6. 根据权利要求5所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S含有平均每分子至少18个 唾液酸。
7. 根据权利要求5所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S含有平均每分子至少20个 唾液酸。
8. -种包含纯化的重组艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫 酸酯酶具有与SEQ ID NO: 1具有至少70%的同一性的氨基酸序列 其中所述纯化的重组I2S包含至少约70%的对应于SEQ ID NO: 1的Cys59的所述半胱 氨酸残基至Ca-甲酰甘氨酸（FGly)的转化和 另外地其中所述纯化的重组I2S含有每种酶至少10%的二磷酸化寡糖。
9. 根据权利要求8所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S含有每种酶至少20 %的二 磷酸化寡糖。
10. -种包含纯化的重组艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫 酸酯酶具有与SEQ ID NO: 1具有至少70%的同一性的氨基酸序列 其中所述纯化的重组I2S包含至少约70%的对应于SEQ ID NO: 1的Cys59的所述半胱 氨酸残基至Ca-甲酰甘氨酸（FGly)的转化和 另外地其中所述纯化的I2S的特征在于包含7个或更少的峰组的聚糖