图谱，所述峰组 选自指示中性（峰组1)、单唾液酸化（峰组2)、二唾液酸化（峰组3)、单磷酸化（峰组4)、 三唾液酸化（峰组5)、四唾液酸化（峰组6)或二磷酸化（峰组7) I2S蛋白的峰组。
11. 根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S包含至少约 75%的对应于SEQ ID NO: 1的Cys59的所述半胱氨酸残基至C a -甲酰甘氨酸（FGly)的转 化。
12. 根据权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S包含至少约 80%的对应于SEQ ID NO: 1的Cys59的所述半胱氨酸残基至C a -甲酰甘氨酸（FGly)的转 化。
13. -种包含纯化的重组艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)的组合物，所述重组艾杜糖-2-硫 酸酯酶具有与SEQ ID N0:1具有至少70%的同一性的氨基酸序列，其中所述纯化的重组 I2S包含大于约85%的对应于SEQ ID NO: 1的Cys59的所述半胱氨酸残基至C a -甲酰甘 氨酸（FGly)的转化。
14. 根据权利要求13所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S包含大于约90 %的对应 于SEQ ID NO: 1的Cys59的所述半胱氨酸残基至C a -甲酰甘氨酸（FGly)的转化。
15. 根据权利要求13所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S包含大于约95%的对应 于SEQ ID NO: 1的Cys59的所述半胱氨酸残基至C a -甲酰甘氨酸（FGly)的转化。
16. 根据权利要求13所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S包含大体上100%的对 应于SEQ ID NO: 1的Cys59的所述半胱氨酸残基至Ca -甲酰甘氨酸（FGly)的转化。
17. 根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S具有与SEQ ID NO: 1具有至少80%的同一性的氨基酸序列。
18. 根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S具有与SEQ ID NO: 1具有至少90%的同一性的氨基酸序列。
19. 根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S具有与SEQ ID NO: 1具有至少95%的同一性的氨基酸序列。
20. 根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述纯化的重组I2S具有与SEQ ID NO: 1相同的氨基酸序列。
21. -种制剂，其包含根据前述权利要求中任一项所述的组合物和生理上可接受的载 体。
22. 根据权利要求21所述的制剂，其中所述制剂适合用于静脉内施用。
23. 根据权利要求21所述的制剂，其中所述制剂适合用于鞘内施用。
24. 根据权利要求21所述的制剂，其中所述制剂适合用于皮下施用。
25. 根据权利要求21所述的制剂，其中所述制剂用于治疗亨特综合症。
26. -种方法，其包括 通过进行阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱和疏水相互作用色谱中的 一种或多种从不纯制剂纯化重组艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)蛋白，和 其中所述方法包括少于6个色谱步骤并且其中所述纯化的重组I2S蛋白含有小于 100ng/mg的宿主细胞蛋白质（HCP)。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述阴离子交换色谱为Q色谱。
28. 根据权利要求26或27所述的方法，其中所述阳离子交换色谱为SP色谱。
29. 根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述混合模式色谱为羟基磷灰石 (HA)色谱。
30. 根据权利要求26-29中任一项所述的方法，其中所述疏水相互作用色谱为苯基色 谱。
31. 根据权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述方法包括5个色谱步骤或更少 色谱步骤。
32. 根据权利要求26-31中任一项所述的方法，其中所述方法包括4个色谱步骤或更少 色谱步骤。
33. 根据权利要求26-32中任一项所述的方法，其中所述方法按照该顺序进行阴离子 交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱和疏水相互作用色谱。
34. 根据权利要求26-33中任一项所述的方法，其中在上样不纯制剂或中间洗脱液后， 使用pH 5. 5的包含浓度在约140mM和200mM之间的范围内的NaCl的洗涤缓冲液洗涤所述 阴离子交换色谱柱。
35. 根据权利要求26-34中任一项所述的方法，其中使用包含线性NaCl梯度的洗脱缓 冲液洗脱所述阴离子交换色谱柱。
36. 根据权利要求33所述的方法，其中所述线性NaCl梯度包含在0-500mM范围内的 NaCl。
37. 根据权利要求26-36中任一项所述的方法，其中在上样至所述阳离子交换色谱柱 之前，将所述不纯制剂或中间洗脱液调整至在约lmS/cm和20mS/cm之间的范围内的电导 率。
38. 根据权利要求37所述的方法，其中在约5. 5的pH下运行所述阳离子交换色谱柱。
39. 根据权利要求26-38中任一项所述的方法，其中在上样至所述混合模式色谱柱之 前，将所述不纯制剂或中间洗脱液调整至在约〇. 001-0. 01M的范围内的磷酸盐浓度和pH 5. 5〇
40. 根据权利要求39所述的方法，其中在上样后，使用pH 5. 5的包含在约10-20mM的 范围内的磷酸盐浓度的洗涤缓冲液洗涤所述混合模式色谱柱。
41. 根据权利要求40所述的方法，其中使用pH 5. 5的包含在约50-150mM的范围内的 磷酸盐浓度的洗脱缓冲液洗脱所述混合模式色谱柱。
42. 根据权利要求26-41中任一项所述的方法，其中在上样至疏水相互作用色谱柱上 之前，将所述不纯制剂或中间洗脱液调整至的在约〇. 5-2. 0M的范围内的盐浓度，pH为约 4. 5-6. 0〇
43. 根据权利要求42所述的方法，其中在上样后，使用pH为约4. 5-6. 0的包含在约 0. 5-2. 0M的范围内的盐浓度的洗涤缓冲液洗涤所述疏水相互作用色谱柱。
44. 根据权利要求43所述的方法，其中使用pH为约4. 5-6. 0的包含在约0. 1-0. 5M的 范围内的盐浓度的洗脱缓冲液洗脱所述疏水相互作用色谱柱。
45. 根据权利要求26-44中任一项所述的方法，其中所述阴离子交换色谱、阳离子交换 色谱、混合模式色谱和疏水相互作用色谱柱中的每一种具有在14-25cm的范围内的高度。
46. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括病毒灭活的步骤。
47. 根据权利要求46所述的方法，其中所述病毒灭活的步骤在将所述不纯制剂上样至 所述第一色谱柱上之前进行。
48. 根据权利要求46所述的方法，其中所述病毒灭活的步骤包括将去垢剂添加至所述 不纯制剂。
49. 根据权利要求26-48中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述最后一个 色谱柱之后除去病毒的步骤。
50. 根据权利要求26-49中任一项所述的方法，其中所述方法还包括超滤和/或渗滤的 步骤。
51. 根据权利要求50所述的方法，其中所述超滤和/或渗滤的步骤包括将所述纯化的 重组I2S蛋白交换至药物配制缓冲液中。
52. 根据权利要求26-51中任一项所述的方法，其中所述重组I2S蛋白具有与SEQ ID NO: 1具有至少70%的同一性的氨基酸序列。
53. 根据权利要求26-52中任一项所述的方法，其中所述重组I2S蛋白具有与SEQ ID NO: 1相同的氨基酸序列。
54. 根据权利要求26-53中任一项所述的方法，其中所述重组I2S蛋白由在无血清培养 基中悬浮培养的哺乳动物细胞产生。
55. 根据权利要求54所述的方法，其中在生物反应器中培养所述哺乳动物细胞。
56. 根据权利要求54或55所述的方法，其中所述无血清培养基缺乏动物来源的组分。
57. 根据权利要求54-56中任一项所述的方法，其中所述无血清培养基是化学成分确 定的培养基。
58. 根据权利要求54-56中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞共表达所述重 组I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶（FGE)。
59. 根据权利要求58所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为人细胞。
60. 根据权利要求54-59中任一项所述的方法，其中从含有由所述哺乳动物细胞分泌 的重组I2S蛋白的所述无血清培养基制备所述不纯制剂。
61. 根据权利要求60所述的方法，其中将所述不纯制剂从冷冻的培养基制剂解冻。
62. 根据权利要求26-61中任一项所述的方法，其中所述纯化的重组I2S蛋白含有小于 80ng/mg 的 HCP。
63. 根据权利要求26-62中任一项所述的方法，其中所述纯化的重组I2S蛋白含有小于 60ng/mg 的 HCP。
64. 根据权利要求26-63中任一项所述的方法，其中所述纯化的重组I2S蛋白含有平均 每分子16-22个唾液酸。
65. 根据权利要求26-63中任一项所述的方法，其中所述纯化的重组I2S蛋白具有至少 60U/mg的比活性，如通过使用肝素二糖作为底物的体外硫酸酯释放活性测定所测定的。
66. -种药物组合物，其包含根据如权利要求26-65中任一项所述的方法纯化的重组 I2S蛋白。
67. -种治疗亨特综合症的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用根据权利要 求66所述的药物组合物。
【专利摘要】本发明除其它事项以外提供了用于纯化重组产生以用于酶替代疗法的I2S蛋白的改进方法。本发明部分地基于以下令人惊讶的发现，即可使用包括少至4个色谱柱的工艺从未经处理的生物材料例如含I2S的细胞培养基纯化重组I2S蛋白。
【IPC分类】C07K16-00, A61K38-17, C07K1-00
【公开号】CN104583225
【申请号】CN201380042665
【发明人】D·尼科尔斯
【申请人】夏尔人类遗传性治疗公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年6月28日
【公告号】CA2877517A1, EP2867245A2, US9051556, US20140004096, WO2014005014A2, WO2014005014A3