0017] 在一些实施方案中，在上样至疏水相互作用色谱柱（例如，苯基柱）之前，将不 纯制剂或中间洗脱液或过柱液调整至pH为约4. 5-6. 0 (例如，约4. 5、5. 0、5. 5或6. 0)的 在 0· 5M 至约 2. OM (例如，约 0· 5Μ、1· 0Μ、1· 1Μ、1· 2Μ、1· 3Μ、1· 4Μ、1· 5Μ、1· 6Μ、1· 7Μ、1· 8M、 1.9Μ或2. OM NaCl)的范围内的盐（例如，NaCl)浓度。在一些实施方案中，上样后，使用 pH为约4. 5-6. 0 (例如，约4. 5、5. 0、5. 5或6. 0)的包含在约0. 5Μ至2. OM (例如，约0. 5Μ、 1. 0Μ、1· 1Μ、1· 2Μ、1· 3Μ、1· 4Μ、1· 5Μ、1· 6Μ、1· 7Μ、1· 8Μ、1· 9M或 2. OM NaCl)的范围内的盐（例 如，NaCl)浓度的洗涤缓冲液洗涤疏水相互作用色谱柱。在一些实施方案中，使用pH为约 4. 5-6. 0 (例如，约 4. 5、5. 0、5. 5 或 6. 0)的包含在约 0. IM 至约 0. 5M (例如，约 0. 1M、0. 2M、 0·3Μ、0·4Μ或0.5M NaCl)的范围内的盐（例如，NaCl)浓度的洗脱缓冲液洗脱疏水相互作 用色谱柱。
[0018] 在一些实施方案中，阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱和疏水相 互作用色谱柱中的每一种具有在14_25cm(例如，15_25cm、15_20cm、14_24cm、14_22cm、 14-20cm或16-18cm)的范围内的高度。在一些实施方案中，阴离子交换色谱、阳离子交换 色谱、混合模式色谱和疏水相互作用色谱柱中的每一种具有约14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24 或 25cm 的高度。
[0019] 在一些实施方案中，根据本发明的发明方法包括在将不纯制剂上样至第一色谱柱 之前进行病毒灭活的步骤。在一些实施方案中，病毒灭活的步骤包括将去垢剂添加至不纯 制剂。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法还包括在最后一个色谱柱之后除去病毒 的步骤。在一些实施方案中，本发明的方法还包括超滤和/或渗滤的步骤。在一些实施方 案中，超滤和/或渗滤的步骤包括将纯化的重组I2S蛋白交换至药物配制缓冲液中。
[0020] 在一些实施方案中，本发明用于纯化具有与SEQ ID NO: 1具有至少约50% (例 如，至少约 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% )的 同一性的氨基酸序列的重组I2S蛋白。在一些实施方案中，本发明用于纯化具有与SEQ ID NO: 1相同的氨基酸序列的重组I2S蛋白。
[0021] 在一些实施方案中，本发明用于纯化由在无血清培养基中悬浮培养的哺乳动物细 胞产生的重组I2S蛋白。在一些实施方案中，适合于本发明的无血清培养基缺乏动物来源 的组分。在一些实施方案中，适合于本发明的无血清培养基是化学成分确定的培养基。在 一些实施方案中，在生物反应器中培养哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞共 表达重组I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶（FGE)。在一些实施方案中，哺乳动物细胞为人细 胞。
[0022] 在一些实施方案中，从含有由哺乳动物细胞分泌的重组I2S蛋白的无血清培养基 制备用于本发明的方法的不纯制剂。在一些实施方案中，将用于本发明的方法的不纯制剂 从冷冻的培养基制剂解冻。
[0023] 在一些实施方案中，根据本发明的纯化的重组I2S蛋白含有平均每分子16-22个 (例如，16-21 个、16-20 个、16-19 个、17-22 个、17-21 个、17-20 个、17-19 个）唾液酸。在 一些实施方案中，根据本发明的纯化的重组I2S蛋白含有平均每分子16、17、18、19、20、21 或22个唾液酸。
[0024] 在一些实施方案中，根据本发明的纯化的重组I2S蛋白具有至少约70% (例如， 至少约 77%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%)对应于人I2S(SEQIDN0:1) 的Cys59的半胱氨酸残基至C a-甲酰甘氨酸（FGly)的转化。在一些实施方案中，根据本发 明的纯化的重组I2S蛋白具有大体上100%的对应于人I2S(SEQ ID N0:1)的Cys59的半 胱氨酸残基至Ca-甲酰甘氨酸（FGly)的转化。在一些实施方案中，根据本发明的纯化的 重组 12S 蛋白具有至少 20U/mg、30U/mg、40U/mg、50U/mg、60U/mg、70U/mg、80U/mg、90U/mg 或 lOOU/mg的比活性，如通过使用肝素二糖作为底物的体外硫酸酯释放活性测定所测定的。
[0025] 在一些实施方案中，根据本发明的纯化的重组I2S蛋白特征在于大于70%、75%、 80%、85%、90 %、95%的细胞摄取，如通过体外摄取测定所测定的。
[0026] 在一些实施方案中，根据本发明的纯化的重组I2S蛋白特征在于包含7个峰组的 聚糖图谱，所述峰组分别指示中性（峰组1)、单唾液酸化（峰组2)、二唾液酸化（峰组3)、 单磷酸化（峰组4)、三唾液酸化（峰组5)、四唾液酸化（峰组6)和二磷酸化（峰组7) I2S 蛋白。在一些实施方案中，在神经氨酸酶消化后产生聚糖图谱。在其它实施方案中，在碱性 磷酸酶消化后产生聚糖图谱。
[0027] 除其它事项以外，本发明提供了如本文所述的纯化的重组I2S蛋白以及包含所述 重组I2S蛋白的药物组合物或制剂。在一些实施方案中，配制用于静脉内、皮下和/或鞘内 施用的制剂。本发明还提供了通过向需要治疗的受试者施用纯化的重组I2S、包含重组I2S 的药物组合物或制剂来治疗亨特综合症的方法。
[0028] 如本文中所用，除非另有明确所指，否则术语"I2S蛋白"、"I2S"、"I2S酶"或语法 等同物是指重组I2S蛋白分子的制剂。
[0029] 如本申请中所用，术语"约"和"大致"可作为等同物使用。具有或不具有约/大 致的用于本申请的任何数字涵盖由相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。
[0030] 本发明的其他特征、目的和优势在下面的详细描述中显而易见。然而，应当理解， 所述详细描述，虽然表示本发明的实施方案，但仅通过举例说明的方式给出，而非限制性 的。根据所述详细描述，本发明的范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说是显 而易见的。
[0031] 附图简述
[0032] 共同地构成附图的以下描述的图仅用于说明目的而不是为了限制。
[0033] 图1描述了无血清培养基中产生的重组I2S的示例性纯化方案。
[0034] 图2描述了与参考I2S相比较的纯化的重组I2S AF的示例性肽图谱。
[0035] 图3描述了纯化的重组I2S AF的示例性SDS-PAGE(银）分析。
[0036] 图4描述了通过离子交换色谱评估的纯化的重组I2S AF的示例性电荷特征谱分 析。
[0037] 图5描述了纯化的重组I2S AF的示例性聚糖特征图谱。
[0038] 图6描述了在病毒灭活UPB步骤后重组I2S的澄清收获物的活性（U/mg)的示例 性分析。
[0039] 图7描述了在病毒灭活UPB步骤后重组I2S的澄清收获物的SE C-HPLC示例性分 析。
[0040] 图8描述了纯化的重组I2S蛋白的利用银染处理的示例性SDS-P AGE。
[0041] 图9显示相较于参考，从在无血清培养条件（顶图）下生长的I2S-AF 2D细胞系 产生的纯化的重组I2S酶的示例性肽图谱。
[0042] 图10描述了相较于参考，针对使用在无血清细胞培养条件下生长的I2S-AF 2D和 4D细胞系产生的纯化的重组I2S酶产生的示例性聚糖特征谱。
[0043] 图11描述了相较于I2S参考对照，针对使用在无血清细胞培养条件下生长的 I2S-AF 2D细胞系产生的纯化的重组I2S酶产生的示例性电荷征谱。
[0044] 定义
[0045] 为了使本发明更容易被理解，首先定义某些术语。对下列术语和其他术语的附加 定义陈述于整个说明书中。
[0046] 大致或约：如本文中所用，术语"大致"或"约"，如用于一个或多个目标值，意指 与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，除非另外指出或另外地根据上下文显而易见 的（除其中这样的数值超过可能值的100%外），否则术语"大致"或"约"是指在任一方向 (大于或小于）上落在所述参考值的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、 12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少内的值的范围。
[0047] 生物活性：如本文中所用，短语"生物活性"是指在生物系统（例如，细胞培养物、 生物体等）中具有活性的任何物质的特征。例如，当向生物体施用时对该生物体具有生物 作用的物质被认为是有生物活性的。生物活性还可通过体外测定（例如，体外酶促测定如 硫酸酯释放测定法）来确定。在具体实施方案中，当蛋白质或多肽具有生物学活性时，共 有蛋白质或多肽的至少一种生物活性的该蛋白质或多肽的一部分通常称为"生物活性"部 分。在一些实施方案中，从细胞培养系统产生和/或纯化蛋白质，当向受试者施用时，所 述蛋白质显示生物活性。在一些实施方案中，蛋白质需要进一步加工以变得具有生物活 性。在一些实施方案中，蛋白质需要翻译后修饰，例如但不限于，糖基化（例如，唾液酸化 (sialyation))、法尼基化（farnysylation)、切割、折叠、甲酰甘氨酸转化及其组合，以变得 具有生物活性。在一些实施方案中，作为前体（proform)形式（即未成熟的形式）产生的 蛋白质可能需要额外的修饰来变得具有生物活性。
[0048] 不依赖于阳离子的甘露糖-6-磷酸受体（CI-MPR):如本文中所用，术语"不依赖 于阳离子的甘露糖-6-磷酸受体（CI-MPR) "是指结合注定被转运至溶酶体的高尔基体中的 酸性水解酶前体上的甘露糖-6-磷酸（M6P)标签的细胞受体。除了甘露糖-6-磷酸以外， CI-MPR还结合其它蛋白质，包括IGF-II。CI-MPR也被称为"M6P/IGF-II受体"、"CI-MPR/ IGF-II受体"、"IGF-II受体"或"IGF2受体"。这些术语及其缩写在本文可互换使用。 [004