通过图案化转移片材的试剂靶向递送的制作方法
【专利说明】通过图案化转移片材的试剂靶向递送
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请根据35U.S.C. § I. 119(e)的规定，要求2012年7月25日提交的美国临时 申请号61/675, 451的权益，该申请内容通过引用全文纳入本文。
[0003] 发明背景和概述
[0004] 1.技术领域
[0005] 本发明涉及生物结合试验的领域，具体而言涉及将结合成员或其他试剂转移至 膜、凝胶或其他平面支持物上的点、条带或其他空间阵列，用于检测、鉴定和定量的目的。
[0006] 2.现有技术说明
[0007] 通常将在平板凝胶上已通过电泳分离的蛋白、核酸或其他生物物质转移至硝酸纤 维素、尼龙、聚二氟乙烯或类似材料的膜上以用于鉴定和定量，原因在于与凝胶相比，这些 步骤更易于在膜上操作。常用的转移技术是电印迹，其中凝胶和膜的平坦表面直接接触且 电流横向通过凝胶和膜，从而通过与凝胶内物质移动相类似的方式转移物质。当该物质 是DNA片段时，转移称为Southern印迹，该名称来源于其最初使用者英国生物学家Edwin M. Southern。类似地，RNA片段的转移称为Northern印迹，蛋白或多肽的转移称为Western 印迹。其他示例是针对翻译后修饰的"Eastern"印迹和针对蛋白相互作用的"Far Western" 印迹。
[0008] 所有这些类型的电印迹都可以湿、干或半干的形式进行。在湿印迹中，凝胶和膜在 层叠体中彼此覆盖，该层叠体浸没于容器中的转移缓冲溶液内，该容器壁上安装有导线或 板状电极。随后对电极施加电压以使溶质从凝胶迀移至膜。在半干印迹中，使用了用转移 缓冲液湿润的滤纸，且层叠体的顶部和底部含有该滤纸，凝胶和膜位于滤纸之间以形成"印 迹夹心"。随后使电极直接接触湿润滤纸的暴露表面。干电印迹不使用除凝胶中残留缓冲 液以外的液体缓冲液。湿、干和半干电印迹以及相关材料和设备的描述可参见Margalit 等（英杰公司（Invitrogen))的美国专利申请公开号US 2006/0272946 Al (2006年12月 7日公开）、旧 2006/0278531 41(2006 年12月14日公开）和旧 2009/0026079六1(2009 年1月29日公开）；Littlehales (美国伯内特公司（American Bionetics))的美国 专利号4, 840, 714 (1989年6月20日授权）；Dyson等（阿莫仙国际公司（Amersham International))的美国专利号 4, 889, 606 (1989 年 12 月 26 日授权）；Schuette(生命科 技公司（Life Technologies, Inc.))的美国专利号5,013,420(1991年5月7日授权）； Chan等（雅培实验室（Abbott Laboratories))的美国专利号5, 356, 772(1994年10月 18日授权）；Camacho(胡夫科学仪器公司（Hoefer Scientific Instruments))的美国 专利号5,445,723(2005年8月29日授权）；Boquet (BC公司（Bertin&Cie))的美国专利 号5, 482, 613(1996年1月9日授权）；以及Chen(威泰克企业股份有限公司（Wealtec Enterprise Co. ,Ltd.))的美国专利号 6,592,734 (2003 年 1 月 15 日授权）。
[0009] 无论电印迹是以湿、干或是半干形式进行，均使用检测试剂进一步处理所得电印 迹以在可通过适用于生物物质本身的方法检测的印迹中呈现该物质。例如，在Southern 和Northern印迹中，该检测试剂是通过检测荧光或化学发光染料来监测的杂交探针。在 Western印迹中，该检测试剂可包括一抗并随后使用二抗以检测抗体，该二抗被荧光团、发 色团或酶标记。或者，可使用检测剂（如生物素或亲和素/链霉亲和素）标记二抗，该检测 剂是否存在是可以检测的。在Far Western印迹和Eastern印迹中使用了生物化学技术人 员已知的类似或相似方法。
[0010] 生物试验中还使用了除电印迹以外的空间阵列。例如，结合试验可以直接在平板 凝胶以及质谱目标、ELISA板和已经以规则间隔或不规则间隔的二维阵列形式沉积在膜或 其他支持物表面的蛋白、核酸或其他生物物质上进行，该沉积是通过静电喷雾、真空沉积、 针点样法（pin spotting)和其他方法进行的。
[0011] 在所有这些空间阵列中，应用于点的结合试剂（包括检测试剂、杂交探针、抗体或 其他物质）是这些步骤成本的重要组分，且由于结合发生的条带或点仅占据支持物表面积 的一小部分，浪费了大量体积的任意给定试剂。限制成本的一种方式是使用高度稀释形式 的结合试剂，但需要延长接触时间，这限制了给定时间内可完成的分析数目。
[0012] 概述
[0013] 现在已发现，通过使用转移片材上侧向限定区域中含有结合试剂的多孔亲水性转 移片材，可高效地将结合试剂应用于点样在平坦表面上的物质。该片材可由阻隔侧向限定。 合适的阻隔包括疏水性阻隔（如蜡阻隔）或由多孔亲水性转移片材的气相或液相硅烷化形 成的阻隔。合适的阻隔还包括不可透过阻隔。这类不可透过阻隔包括包含塑料、聚合物或 树脂的阻隔。在一些情况下，该不可透过阻隔是支持亲水性转移片材的框架，该转移片材悬 浮于框架内。
[0014] 在一些情况下，该阻隔由疏水性（如蜡或硅烷化纤维素）和不可透过阻隔的组合 构成。例如，在一些情况下，多孔亲水性转移片材被不可透过（如塑料或树脂）阻隔框架围 绕并由蜡或硅烷化纤维素阻隔进一步细分。
[0015] 随后在使结合试剂向表面转移的条件下使转移片材与平坦表面接触，从而应用于 经点样物质。结合成员可通过扩散充满限定的区域而不跨过阻隔，并在接触具有经点样表 面的转移片材后，结合成员将其接触限于点或者包括该点、与该区域对准的小面积区域。从 片材至点的转移可通过简单扩散发生，或可通过多种已知方法中的任意一种（如电印迹） 诱导。例如，为使试剂针对印迹膜上所需位点处感兴趣的分析物，需放置多孔片材使得限定 区域与膜上分析物（如果存在）所占据的位置对准。对准可通过多种已知方式实现，如对 准膜和多孔片材上的标记或特征。
[0016] 在一些实施方式中，可以定向的方式递送试剂，使得转移片材在侧向限定区域中 含有结合试剂并将结合试剂转移至不与转移片材的侧向限定区域垂直对准的平坦表面的 侧向限定区域。例如，限定该侧向限定区域的阻隔可形成一个或多个通道以在转移期间指 导结合试剂的流动。作为另一个示例，可从转移片材通过一个或多个额外的具有偏移侧向 限定亲水性区域的亲水性片材至平坦表面来影响转移。作为另一个替代方案，各自具有仅 部分穿透各转移片材的侧向限定区域的第一和第二转移片材可相对放置以建立垂直通道。 随后该垂直通道可使来自第一转移片材的结合试剂转移至不与第一转移片材对准的平面 支持物上的区域。
[0017] 该限定区域可以是毫米大小的比例（如IOmm或更少）、微米大小（100微米或更 少）甚至亚微米大小，且其宽度可基本等于：电印迹中单个泳道、横跨一系列平行泳道的单 个条带、一部分泳道（其中具有不同检测试剂的两个或多个区域可置于单个泳道的不同片 段上）或限制与印迹膜上感兴趣的特定区域接触的任何小区域。对于凝胶或含有具有潜在 兴趣的分子物质的条带或点的任何其他表面上的应用也是如此。在一些情况下，限定区域 的宽度基本相当于电印迹中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多条泳道的宽 度。
[0018] 该转移片材可含有任何大小的圆形、矩形、方向等限定区域的阵列。例如，该转移 片材可以是圆形限定区域的阵列。在一些情况下，圆形限定区域的阵列是适用于一种或多 种结合试剂转移至微量滴定或ELISA板（例如6、12、24、48、96、384或1536孔微量滴定或 ELISA板）的一个或多个孔的尺寸。类似地，还可将各限定区域细分成较小区域用于将试剂 复合递送至各点、孔或阵列中的位置。
[0019] 使用该方法，无再需要使用结合试剂涂覆整个经点样表面，且该方法可使用少得 多的量的结合试剂发生结合反应。该方法还允许使用不同结合试剂或使用不同浓度或稀释 的同一结合试剂处理经点样表面的不同区域。多孔片材的不同区域中两种或多种结合试剂 的使用使得用户能够同时检测不同的经点样物质，例如通过不同反应检测物质，而不同浓 度或稀释的同一结合试剂的使用使得用户能够通过同时进行的测试确定给定样品中给定 分析物的最适当稀释。其他用途和优势对本领域技术人员而异显而易见。
[0020] 疏水性蜡阻隔可由以下方式形成：手动绘制、打印或针对多孔片材表面在蜡中形 成所需区域的轮廓，随后加热该片材以使蜡溶解，导致其透过片材的厚度。因此，可形成任 何形状、尺寸或数目的轮廓并在单个步骤中进行多种结合反应（包括单个反应和不同反应 之间的比较）。
[0021] 疏水性阻隔还可通过气相或液相硅烷化形成。例如，可将转移片材置于罩（mask) 中，使转移片材的各区域接触硅烷化试剂（如三甲基氯硅烷）。随后可使硅烷化试剂接触 片材和形成的一个或多个侧向限定区域。随后可使侧向限定区域接触含有结合试剂的水溶 液，从而制备含有水基结合试剂的转移片材，该水基结合试剂可逆地固定在以阻隔为边界 的侧向限定区域中。
[0022] 在一些实施方式中，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含容器和其中的1、2、 3、4或更多个多孔亲水性片材，该多孔亲水性片材各自具有1、2、3、4或更多个以疏水性或 不可透过阻隔为边界的侧向限定区域。在一些情况下，该多孔亲水性片材各自具有1、2、3、 4或更多种可逆地固定于其上的结合试剂。该结合试剂可以是抗体。该侧向限定区域的宽 度基本相当于电印迹中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多条泳道的宽度。可 将容器构造为保护多孔亲水性片材免于接触光照和/或水分。
[0023] 在一些情况下，该试剂盒还包含转移缓冲液，如Western印迹转移缓冲液。在一些 情况下，该试剂盒还包含转移缓冲液的组分。在一些情况下，该