肽及其应用
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年8月29日递交的新加坡专利申请第201206407-7号的优先权 权益，其内容通过引用整体并入本文，用于所有目的。
技术领域
[0003] 本发明总体上涉及抗微生物肽及其使用方法。
[0004] 发明背景
[0005] 尽管在过去100年中生活水平和生物医疗技术得到了显著改善，全球的传染性 疾病负荷仍然非常高，并且是公共健康、经济和社会问题的主要诱因。根据世界卫生组织 (WHO)统计，传染性疾病和寄生虫病如肺炎、结核病、脑膜炎、腹泻病、HIV和疟疾是全球范 围内造成死亡的第二大主要诱因。抗生素在工业化国家的广泛和通常不加选择的使用加剧 了这一问题，其促使抗药性病原体快速出现，使得传染性疾病越来越难以利用现有的抗生 素类型进行控制。耐抗生素性传染病爆发的危机加上新的小分子抗生素开发的持续缺乏， 激励了大量的努力来发现和开发具有膜活性的抗微生物肽（AMP)作为抗微生物剂的替代 类型。天然存在的抗微生物肽，也称为"宿主防御肽"，最初被发现是先天免疫的组分，其形 成了所有活的生物体中对抗入侵的病原体的第一道防线。不同于抑制特定生物合成途径如 细胞壁或蛋白合成的常规抗生素，大部分的阳离子型抗微生物肽通过对带有更多负电荷的 微生物膜脂双分子层进行物理破坏，以诱导细胞质成分泄露从而导致细胞死亡来发挥其活 性。据信，膜破坏的物理特性能导致更低的抗药性发展可能性，因为微生物以与遭受损伤相 同的速率进行突变或修复其膜成分在代谢上"更为昂贵"。
[0006] 尽管在过去30年中已分离和定征了来自不同来源（包括微生物、植物和动物）的 1700多种天然存在的抗微生物肽，当前临床上仅使用非常少的AMP，如多粘菌素和短杆菌 肽；由于它们的高系统毒性并且主要用于局部制剂。通过使用抗微生物肽作为药物而确定 的主要挑战在于，合成长肽序列成本较高、稳定性不好和全身给药后的毒性未知。为了努力 增加抗微生物活性并将非特异性毒性减至最小，更多的研究者开始越来越多地使用天然存 在的抗微生物肽或蛋白序列作为模板以进行化学修饰，如环化、序列截短和以D-氨基酸、 β -氨基酸或氟化的氨基酸进行取代，以用于生成具有更多的针对体内局部或全身感染的 广泛应用的新的肽类似物。然而，当前优化天然存在的抗微生物肽序列的方法最多仍然为 经验性为主，使得特别难以描绘总体的结构-活性关联，尤其是针对大序列和结构多样性 的背景。此外，许多新的肽类似物仍然较长（20个氨基酸或更多），其可诱导显著的免疫原 性，并最终增加大规模制备的成本。更重要的是，已表明使用具有与宿主防御抗微生物肽太 过接近的序列的抗微生物肽可引起先天AMP耐受的发生，这可能会不可避免地危害对感染 的天然防御，造成显著的健康和环境风险。
[0007] 同时，医院和社区环境中快速出现耐抗生素的细菌和真菌在世界范围内已对医 疗保健制度产生了明显的压力。虽然诸如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) (MRSA)、耐万古霉素肠球菌（Enterococci)(VRE)以及耐多药肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae)和不动杆菌（Acinetobacter spp.)的耐抗生素病原体的全球 发生率已达到了传染病水平，进入临床开发渠道的新抗生素的数目不容乐观；自2000年 仅3种新结构类型的抗生素进入市场，包括恶唑烷酮（利奈唑胺）、脂肽（达托霉素）和 截短侧耳素（pleuromutilin)(瑞他帕林）。考虑到病原菌如金黄色葡萄球菌、肠杆菌 (Enterobacter)和克雷伯氏菌正在发展对万古霉素和碳青霉烯的耐受性（其传统上被保 留为作为住院的脆弱患者最终防御底线的强效抗生素），该发展尤其让人担忧。随着小分子 抗生素开发的持续缺乏，设计和鉴定具有能有效克服耐药机制的新作用模式的可选类型的 抗微生物剂相比以前更为紧迫。
[0008] 由于大多数的抗微生物肽通过快速和直接的膜溶解机制来发挥其抗微生物活性， 其在克服常规的抗生素抗性机制方面具有固有优势，如微生物膜上增加药物外排泵的表 达、产生药物降解酶或改变针对靶向特定生物合成途径的小分子抗生素的微生物所获得的 药物相互作用位点。然而，限制抗微生物肽的成功临床翻译的重要障障包括高系统毒性，这 是由于不良的微生物膜选择性、相对高的制造成本（对于长肽序列）和易于被生物液体如 血清、伤口渗出液或泪液中存在的蛋白酶降解。
[0009] 由于上述原因，需要提供可供选择的抗微生物肽。还需要提供可选的治疗微生物 感染的方法。
[0010] 发明概述
[0011] 在一个方面，提供了两亲性肽。该肽包含（X1Y1X 2Y2)n(式I)，其中所述肽的C-末端 被酰胺化；XJP X 2彼此独立地为疏水性氨基酸；Y i和Y 2彼此独立地为阳离子型氨基酸，并 且其中η至少为1。
[0012] 在另一方面，提供了本文所述的肽以用作药物。
[0013] 在另一方面，提供了治疗细菌感染或去除细菌的方法。所述方法包括给予药学有 效量的如本文所述的肽。
[0014] 在另一方面，提供了中和内毒素的方法。所述方法包括给予药学有效量的如本文 所述的肽。
[0015] 在另一方面，提供了治疗基于病毒的传染性疾病的方法。所述方法包括给予药学 有效量的如本文所述的肽。
[0016] 在另一方面，提供了治疗真菌感染或侵扰，或者去除真菌的方法。所述方法包括给 予药学有效量的如本文所述的肽。
[0017] 在另一方面，提供了治疗增殖性疾病的方法。所述方法包括给予药学有效量的如 本文所述的肽。
[0018] 在另一方面，提供了本文所述的肽在制备用于治疗细菌感染，或者去除细菌，或者 中和内毒素，或者治疗基于病毒的传染性疾病，或者治疗真菌感染或侵扰，或者去除真菌的 药物中的用途。
【附图说明】
[0019] 当结合非限制性实例和附图考虑时，参考详细描述将会更好地理解本发明，其 中：
[0020] 图1显示了合成的形成β -折叠的肽的设计特征。Α)显示了本公开的示例性肽。 B)显示了存在为线性分子的本公开的肽的实例。C)显示了由本公开的肽引起的可能的膜 破坏的示意图。简而言之，在水溶液中，由于质子化的Arg和/或Lys残基之间的静电排斥， 所述肽存在为单体的无规则卷曲。然而，在微生物细胞膜存在下，所述肽容易组装成β-折 叠二级结构，其通过带正电荷的残基与带负电荷的磷脂之间的静电相互作用，然后将其疏 水残基插入至脂质双分子层中以介导膜破坏来稳定。
[0021] 图2显示了于去离子水和25mM SDS胶束溶液中的（a) (VRVK)2-NH2(SEQ ID NO: 11), (b) (IRIR)2-NH2(SEQ ID NO: 12), (c) (IKIK)2-NH2 (SEQ ID NO: 13), (d) (IRIK)2-NH2(SEQ ID NO: 17), (e) (IRVK)2-NH2 (SEQ ID NO: 14) , (f) (FRFK) 2-NH2 (SEQ ID NO: 15)、（g) (VRVK)3-NH2 (SEQ ID NO: 20)、OO(IRIK)3-NH2 (SEQ ID NO: 21)、（i) (IRVK)3-NH2 (SEQ ID NO: 22)的圆二色谱。图2显示了本公开的肽如何在微生物膜模拟条 件下（25mM SDS溶液）容易地自组装成β -折叠二级结构。
[0022] 图3显示了合成的抗微生物肽的溶血活性。图3显示了本公开的肽针对处于不同 的最小抑制浓度（MIC)值的大鼠红细胞诱导的最小溶血或无溶血。
[0023] 图4显示了以不同浓度（即0、0. 5 X最小抑制浓度（MIC)、MIC和2 XMIC)的代表 性肽（IRIK)2-NH2(SEQ ID NO: 17)处理后的存活微生物集落形成单位（CFU)的图示。图4 显示本公开的肽处在MIC值和以上具有杀菌活力。
[0024] 图5显示了以含有10% (体积）的水作为对照的液体培养基，以及用代表性 肽（IRIK)2-NH2(SEQ ID N0:17)和（IRVK)3-NH2(SEQ ID N0:22)处理 2h 的（a)大肠杆菌 (Escherichia coli)和（b)金黄色葡萄球菌的FE-SEM图像。图5显不本公开的肽可造成 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的膜溶解。
[0025] 图6显示了使用XTT检测测定的以不同浓度的（IRIK)2_NH2(SEQ ID N0:17)和 (IRVK) 3-NH2 (SEQ ID NO: 22)处理24h的生物膜中金黄色葡萄球菌的细胞活力。*P〈0. 01相 对于（IRVK)3-NH2。图6显示本公开的肽显现出生物膜中存在的金黄色葡萄球菌的剂量依 赖性杀伤。
[0026] 图7显示了通过结晶紫染色测定的以不同浓度的（IRIK)2-NH2(SEQ ID NO: 17)和 (IRVK) 3-NH2(SEQ ID NO: 22)处理24h的预先形成的金黄色葡萄球菌生物膜的生物量变化。 图7表明本公开的肽可用于去除生物膜。
[0027] 图8显示了具有（a) 2个重复单元（η = 2)和（b) 3个重复单元（η = 3)的本公开 的肽对FITC标记的LPS聚集体的稳定性的影响。图8表明本公开的肽可有效破坏脂多糖 (LPS)聚集体。
[0028] 图9显示了本公开的肽对NR8383大鼠巨噬细胞细胞系中LPS刺激的NO产生的抑 制作用。图9表明本公开的肽可有效中和LPS的影响。
[0029] 图10显示了以不同浓度的本公开的肽孵育18h后，NR8383大鼠巨噬细胞系的细 胞活力。图10显示本公开的肽的抗炎性独立于其对细胞活力的影响，并且所述肽在抗微生 物和抗炎活性所需的浓度下无毒。
[0030] 图11显示了于微生物膜模拟条件（25mM SDS胶束溶液）下，（a) IK8对映体、（b) IK12对映体、（C)IKS立体异构体和（d)对照肽的圆二色谱。图11显示了本公开的肽容易 在微生物膜模拟条件下自组装形成β-折叠二级结构。
[0031] 图12显示了兔红细胞中（a)IK8立体异构体、（b)IK12对映体和（c)IK8非形成 β -折叠的肽对照的溶血活性。图12显示本公开的肽的D-立体异构体在MIC值时显示最 小的溶血或无溶血，其对微生物膜具有高选择性。
[0032] 图13显示了以蛋白酶（a)胰蛋白酶和（b)蛋白酶K处理6h后，IK8-均为L和 IK8-均为D针对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)的 抗微生物活性。图13显示本公开的肽的所有D对映体均为耐蛋白酶的。
[0033] 图14显示了以不同浓度（即，0、0.5父最小抑制浓度（10〇、10(：和2\10〇的 IK8-均为D处理18h后，（a)表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis)、（b)金黄色葡 萄球菌、（c)大肠杆菌、（d)绿脓假单胞菌和（e)白色链珠菌（Candida albicans)的存活集 落形成单位（CFU)图。对于每种微生物，所设计的肽在MIC和2XMIC值时实现了集落计数 (>99.9%杀伤）的大于3个对数的减少，显示了杀菌作用机制。图14表明类似于L-对映 体，本公开的肽的D-对映体具有杀菌机制。
[0034] 图15显示了以含有10% (体积）HPLC水的125mg Γ1的IK8-均为D和MHBII处理 2h，（a)金黄色葡萄球菌和（b)绿脓假单胞菌的FE-SEM图。图15表明本公开的肽的D-对 映体能造成金黄色葡萄球菌和绿脓假单胞菌的膜溶解。
[0035] 图16显示了暴露于亚最小抑制浓度（MIC)的IK8-均为D和各种临床用抗生素的 (a)大肠杆菌和（b)金黄色葡萄球菌的耐药性发展概况。图16表明本公开的肽在测试的时 间范围内不诱导任何耐药性发展。
[0036] 图17显示了感染的小鼠巨噬细胞细胞系RAW264. 7(M0I 10)中，由IK8-均为D介 导的金黄色葡萄球菌的细胞内杀伤。图17表明本公开的肽针对感染的细胞中存在的细菌 具有有效的抗微生物特性。
[0037] 图18显示了于去离子水中的（a) IK8对映体、（b) IK8立体异构体、（c) IK12对映体 和（d)对照肽的圆二色谱。图18表明在去离子水中，本公开的肽的对映体和立体异构体均 保留为无规则卷曲，并且未采用任何二级结构。
[0038] 图19显示了 MALDI-T0F质谱，其显示了胰蛋白酶和蛋白酶K对（a) (IRIK)2-NH2(SEQ ID N0:17)和（b)(irik)2-NH2(SEQ ID N0:18)的蛋白水解活性。箭头指 示主要的酶切割位点。图19显示与L-对映体相反，对本公开的D-对映体肽的蛋白酶处理 未引起D-对映体肽的降解。
[0039] 图20显示了以合成的抗微生物肽IK8-均为D处理18h后，（a)耐环丙沙星大肠 杆菌和（b)耐庆大霉素大肠杆菌的最小抑制浓度（MIC)的测定。图20表明本公开的肽的 D-对映体能够在与野生型（非耐药性）大肠杆菌相同的浓度下，抑制耐庆大霉素大肠杆菌 和耐环丙沙星大肠杆菌。
[0040] 图21显示了针对小鼠肺泡巨噬细胞RAW264. 7和人胎儿肺成纤维细胞WI-38细胞 系，IK8-均为D的细胞毒性研究。图21表明本公开的肽的D-对映体仅在远高于抗微生物 浓度的浓度下有毒。
[0041] 图22显示本公开的肽选择性杀伤癌细胞（HeLa)，并且对非癌性的大鼠肺泡巨噬 细胞（NR8383)和人表皮成纤维细胞系毒性更小。
【附图说明】
[0042]
[0043] 表1显示了本公开的肽的定征。
[0044] 表2显示了本公开的肽的最小抑制浓度（MIC)和选择性指数。
[0045] 表3显示了本公开的肽的设计和定征。
[0046] 表4显示了本公开的肽的最小抑制浓度（MIC)和选择性指数。
[0047] 表5显示了本公开的肽针对临床上分离的耐药性微生物的最小杀菌浓度（MBC)。
[0048] 表6显示了本公开的肽针对临床上分离的结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis)的最小抑制浓度（MIC)。
[0049] 发明详述
[0050] 与天然存在的肽序列具有最小相似性的短合成肽的设计和优化是对开发用于临 床的安全和有效的抗微生物肽有用的策略。除了具有+2至+9的净电荷的阳离子特性以及 由?30-50 %的疏水性氨基残基组成外，不同的天然存在的和合成的抗微生物肽的一种共 性在于：两亲性肽折叠形成二级结构，通常在与微生物膜接触后形成。在两种主要形式的折 叠结构（包括α-螺旋肽（例如，Cathelicidin、天蚕素、蛙皮素）和β-折叠肽（例如，防 御素和Protegrin))间，已发现两亲素 β-折叠肽溶血性较小，同时具有与其同等电荷和疏 水性的α-螺旋等同物相当的抗微生物活性。因此，本公开的目的是提供具有β-折叠结 构的短合成肽，其具有抗微生物活性并且溶血性较小。
[0051] 因此，在一个方面，提供了两亲性肽。在一个实例中，所述肽包含（X1Y1X 2Y2)n(式 I)，其中&和X 2可单独地选自疏水性氨基酸；Y JP Y 2可单独地选自阳离子型氨基酸；并且 η可至少为1.5。在一个实例中，本公开的发明人基于来自天然存在的β-折叠 AMP的几种 基本设计原理设计了短合成β-折叠肽（其由短的重复（X1Y1X 2Y2)n-MV^列组成），所述设 计原理包括但不限于：1)在跨膜β-折叠中两亲性二联体重复的普遍存在，2)需要疏水性 残基（诸如但不限于Val、lie、Phe和Trp)和阳离子型残基（诸如但不限于Arg和Lys)，以 与微生物细胞壁和细胞膜相互作用并将之扰乱，以及3) Val、lie、Phe和Trp较强的β -折 叠倾向（图1)。
[0052] 如本文所用，术