专利名称：：用于高度专一性检测过亚硝酸根的试剂的制作方法
技术领域：
：本发明一般涉及过亚辨酸根(peroxynitrite)的检测领域。更具体地，本发明涉及可用作专一性检测过亚硝酸根的试剂的化合物。本发明包括探针分子、其途。
背景技术：
：过亚硝酸根(ONOO-)是硝酸根的异构体，为人所知的历史已有约一个世纪。由于它在生物和医药领域具有潜在重要作用，在过去十年里，人们对它做了广泛研究，参见Beckman，J.S.，J附./户/i",0/.CW//Vi"/o/.1996,271，C1424誦1437;Goldstein,S.等，Free及fl力cfl/所o/.在1996，21，965-974;Groves,J.T.，Curr.Opin.Chem.Biol.1999，3,226;Radi，R.等，/^ee肠/.在2001，30，463-488;Ta卩pey，M.M.等，C7m2001，89，224-236;Koppenol，W.H.，2001，6，339-341。过亚硝酸根可通过氧化氮(NO)和超氧根(superoxide)(02—)以1:1的化学计量比率在活体中发生扩散控制的反应(k=0.4-1.9xl010M-V)来形成(Kissner，R.等，CTie附.r。ja'co/.1997，10，1285-1292)，在产生过亚硝酸根的过程中，NO的浓度是关键控制因素。当NO的浓度增加时，氧化氮与超氧根发生反应，并能克服超氧化物歧化酶引起的歧化反应。当氧化氮(NO)在受细胞因子刺激的诱导型氧化氮合酶(iNOS)作用下过量产生时，就会发生这种情况。ONOO-的病理活性同它跟生物中普遍存在的C02之间的反应有关，该反应产生高反应活性的自由基C(V和N02'，产率约为35%(Radi，R.等，及fl^/ca/历o/.在Aferf.2001，30，463-488)。结果，过亚硝酸根能够使酪氨酸发生硝化(Ischiropoulos，H.，JrcA.5&c/ie附.5fV/;/^s.1998，356，l画ll，以及BeckmanJ.S.等，JrcA5/ocAe附.5/印Ajs.,1992，298，438-445)，并氧化蛋白质、脂质(Radi，R.等，^rc/i5z>p/^s.，1991,288,481，以及Shi,H.等，所oc/ie附.Com附"rt.，1999,257，651)和生物分子中的铁及硫蔟(Radi，R.等，J.5,》/.CAew.，1991，266，4244-4250)。与生物活体中的其他氧化剂类似，过亚硝酸根及其质子化形式既产生有益作用，也具有有害作用。巨嗜细胞产生过亚硝酸根，作为对细菌入侵的宿主防御反应。然而，若干研究表明，过亚硝酸根在许多人类疾病中是导致组织损伤的一个因素，所述疾病例如为缺血再灌注损伤、风湿性关节炎、脓毒性休克、多发性硬化、动脉硬化症、中风、炎症性肠病、癌症以及几种神经变性疾病(MacMillan-Crow，L.A.等，iVoc.V"rf.Sc/.USA1996，93,11853;Rodenas，J.等，Free及flrfica/.5/。/.在2000，28，374;Cuzzocrea，S.等，户Afl簡actf/及ev.2001,53，135;Szabo，C.r頻co/.丄e汰2003，140,105;White,C.R.等，iVoc.胸/.」c".5W.USA1994，91，1044;Lipton，S.A.等，胸瞬1993,364,626;Pappolla，M.A.等，/.7Ve訓/T腦亂2000,107,203;以及Beal,M.F.，/Vee及arf/ca/在Merf.2002,32，797-803)。对过亚硝酸根在生物活体中所起关键作用作出解释变得日益重要。虽然过亚硝酸根在碱性溶液中稳定，但它在生理pH下发生质子化后迅速分解。由于过亚硝酸根在生物体系中的半衰期短(在中性pH值的緩冲剂中为1秒，在细胞中短于100毫秒)，所以不可能将其直接分离出来(Radi，R.，CTie附.r狄/o/.1998，11，720-721;Denicola，A.等，Jrc/^5/oc/ie附.5/o/7/^s.1996，333，49-58)。即便在有确凿证据证明活体内形成了过亚硝酸根的情况下，还没有工具可用来明确检测并定量细胞和组织中的过亚硝酸根。迄今为止，用来检测和测定过亚硝酸根的可用分析方法可分为三类。第一类是电化学传感器，其用来估测在氧化应激下细胞中所产生的过亚硝酸根的量(Augusto，O.等，/五"矽附o/.1996，269，346-354;Gatti,R.M.等，F五^yIe汰，1994，348，287-290;Gatti,R.M.等，/^c/t.5/oc/ie附.1998，349，36-46;以及Karoui，H.等，/.CTie附.1996，271，6000-6009)。但此方法需要操作复杂的设备，且无法得到过亚硝酸根的立体图像。第二类方法依赖氧化探针的使用。例如，可被过亚硝酸根氧化成高荧光分子的DCFH(2，，7，-二氯二氢荧光素)和DHR123(二氢若丹明123),已被用来监测细胞和组织中的过亚硝酸根(Royall，J.A.等，JrcA.说'ocAe附.5Zo/;/ijs.1993,302，348-355;Kooy，N.W.等，及atrf/c.及o/.^ferf.1994，16，149-156;Kooy，N.W.等，/^ee1997，27，245-254;Crow,J.P.，iVi加c1997，1，145-157;Ischiropoulos,H.等，^/^"/^rfs五"矽附o/.1999，301，367-373;以及Miles,A.M.等，J.所o/.CAe附.1996，271，40-47)。然而，过亚硝酸根氧化DCFH和DHR的机理还有大量不清楚之处，这些探针也能被细胞产生的许多其他ROS(活性氧中间体(species))氧化。用来检测细胞培养液中的过亚硝酸根的鲁米诺化学发光体系也存在类似的问题。HPF(羟苯基荧光素)可用来鉴别过亚硝酸根和氧化氮，但(Setsukinai，K.等，丄B/o/.CTie附.2003，278，3170-3175;国际公开WO01/64664(Nagano等)；以及国际公开WO2004040296(Nagano等))。第三类方法利用生物分子的足迹反应。例如，可用免疫化学方法检测3-硝基酪氨酸，其是在生物体系中蛋白质上的酪氨酸残基被过亚硝酸根氧化后产生的硝化产物(Kaur，H.等，尸五AS"1994，350，9-12)。近来也有人通过荧光法，用NADH(还原型烟酰胺腺噪呤二核苦酸)来监测緩冲液中过亚硝酸根的浓度。然而，目前还没有一种化学修饰方法能够使探针或生物分子获得完全专一性，使它们能够直接而明确地显示细胞中是否产生了过亚硝酸根。这意味着生物体系中存在的其它活性氧中间体和活性氮中间体可能与过亚硝酸根形成竟争，干扰了结果。已知有若干方法用于检测/测定过亚硝酸根，包括电化学方法、化学发光法和足迹法。然而，这些方法需要做烦瑣、耗时的对照实验，实验中要联合使用清除剂和抑制剂，灵敏度低，专一性差。因此，为了便于直接研究生物体系中的过亚硝酸根，开发出灵敏度高、操作简便的专门用于检测和测定过亚硝酸根的方法是极为重要的。发明概述本发明涉及可用于确切检测和测定过亚硝酸根的新颖化合物。具体而言，本发明提供了化合物或其盐，它们与过亚硝酸根发生专一性反应，而不与其他的活性氧中间体和活性氮中间体反应，所述化合物由以下通式(I)、(II)、(III)表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(I)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中Rj(i=l~22)的定义见下面的"发明详述"。本发明还提供了用于测定过亚硝酸根的试剂，该试剂包含上述任意化合物。本发明还提供了测定样品中的过亚硝酸根的方法，其包括以下步骤a)使上述任意化合物与样品接触；的荧光。本发明还提供了用于检测过亚硝酸根的高通量筛选荧光法(high-throughputscreeningfluorescentmethod),该方法包括采用测定过亚硝酸根的试剂，其中所述试剂包含上述任意化合物。本发明还提供了用于筛选化合物的高通量方法，所述化合物能增加或减少过亚硝酸根的产生，所述方法包括使用上述任意化合物。图1图示了用过亚硝酸根或Oxone(2KHS05KHS04'K2S04)氧化酮的反应(la/lb)。图2显示了通式(II)所示化合物的一般合成方案，其中各Ri(i=7~17)的定义见"发明详述"部分。图3显示了通式(III)所示化合物的一般合成方案，其中各Ri(i=18~27)的定义见"发明详述"部分，图4~图7显示了实施例1的合成方案，图8显示了实施例1中所得到的本发明化合物(ss-6)的20jiM溶液的荧光光谱。图9显示了15当量ONOO-与5毫升20jiMss-6反应30分钟后的溶液的荧光光谱。图IO显示了20nMss-6的吸收光谱。图ll显示了ss-6与浓度为0~300nM的ONOO'反应30分钟后获得的荧光光镨'图12显示了焚光强度与ONOO—浓度之间的线性关系。图13图18显示了实施例5的合成方案。图19显示了实施例5中所得到的本发明化合物(ss-12)的20jiM溶液的荧光光镨。图20显示了15当量ONOCT与5毫升20fiMss-12反应30分钟后的溶液的荧光光镨。图21显示了20fiMss-12的吸收光谱。图22显示了ss-6与浓度为0-300pM的ONOCT反应30分钟后获得的荧光光谱'图23显示了荧光强度与ONOO-浓度之间的线性关系。图24显示了经原代培养的神经元细胞的荧光显微镜检结果，所述神经元细胞先用20jiM的ss-6和ss-12孵育，然后用10jiM和IOOjiM的SIN-1(3-吗啉代-斯德酮亚胺《盐酸)处理。发明详述定义除非另外明确指出，本申请中所用下列各术语均应具有下面所描述的含义。"烷基"指含有碳和氢的完全饱和的无环单价基团，其可以是支链的或直链的.烷基的例子有甲基、乙基、正丁基、叔丁基、正庚基和异丙基。"低级烷基"指1~6个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、异戊基、正戊基和异戊基。"烯基"指含有碳和氢的一价或二价不饱和(优选单不饱和)基团，其可以是环状的、支链的或直链的。"低级烯基，，指具有15个碳原子的这样的基团。"芳基"指取代或未取代的一价芳基，一般含有一个单环(例如苯)或稠合双环(例如萘)。一般优选单环芳基。该术语包括杂芳基，它是环中含有一个或多个氮原子、氧原子或石危原子的芳环基团，如呋喃基、吡咯基、吡啶基和吲哚。"取代"是指芳基中一个或多个环上氢原子被一个或多个基团取代，所述基团优选选自氟、氯、溴、碘、甲基、乙基、羟基、羟曱基、硝基、氨基、甲基氨基、二曱基氨基、甲氧基、卣代甲氧基和卣代甲基。"芳烷基，，指进一步被芳基取代的烷基(优选为低级烷基)取代基，其例子有节基和苯乙基。"荧光团"指能被光激发而发射荧光的小分子或大分子的一部分。优选地，在波长范围为约200~约1000纳米，优选为约500~约800纳米的光的激发下荧光团能有效地产生荧光。荧光团优选选自吖啶橙、蒽环、别藻蓝蛋白、BODIPY、花青、香豆素、Edans、曙红、赤藓红、荧光胺、荧光素、FAM(羧基荧光素)、HEX(六氯荧光素)、JOE(6-羧基-4，,5，-二氯-2，，7，-二甲氧基-荧光素)、俄勒冈绿(OregonGreen)、藻蓝蛋白、藻红蛋白、若丹明、ROX(羧基-X-若丹明)、TAMRA(羧基四甲基若丹明)、TET(四氯荧光素)、德克萨斯红、四曱基若丹明和黄嘌呤。这样的基团报道于《荧光探针和研究产品手册》(i^"rf^do/jP/worescew,iVo6e51/fesearc/j9thEdition,MolecularProbes,Eugene,Oregon,Haughland，2003)中。"无机酯"指无机酸与醇的反应产物。无机酯主要得自无机酸与醇的缩合。术语"盐"指标准酸碱反应的产物，其中碱性基团(如氨基)的平衡离子来自有机酸或无机酸。这样的平衡离子包括氯根、硫酸根、磷酸根、乙酸根、琥珀酸根、柠檬酸根、乳酸根、马来酸根、富马酸根、棕榈酸根、胆酸根、谷氨酸根、戊二酸根、酒石酸根、硬脂酸根、水杨酸根、曱磺酸根、苯磺酸根、山梨酸根、苦味酸根、苯甲酸根、肉桂酸根等。术语"生理上可接受的盐"包括含有机阳离子和无机阳离子的羧酸盐，所述阳离子例如为碱金属阳离子和碱土金属阳离子(如锂、钠、钾、镁、钡和钙)；铵；或有机阳离子，例如二苄基铵、苄基铵、2-羟乙基铵、二(2-羟乙基)铵、苯基乙基节基铵等。上述术语涵盖的其它阳离子包括普鲁卡因、奎宁和N-曱基葡萄糖胺的质子化形式，以及碱性氨基酸(如甘氨酸、鸟氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和精氨酸)的质子化形式。本发明的实施方式如上所述，本发明提供了与过亚硝酸根发生专一性反应而不与其它活性氧中间体和活性氮中间体发生反应的化合物。所述化合物具有以下通式(I):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>(I)其中R!为OR,，或NR2，R3，，其中R、R和R3，独立地为氢或选自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、芳酰基或聚醚的基团；R2、R3、R4和R5独立地为氢或选自卤素、烷基、烷氧基、烷基氧基(alkyoxy)、聚醚的基团；R2和R3共同形成5、6或7元环，其选自芳基、杂环(heterocyclic)、杂芳基或杂芳环(heteroaromatic);或者Rt和Rs共同形成5、6或7元环，其选自芳基、杂环、杂芳基或杂芳环；R6是吸电子基团，选自CF3、卤素取代的低级烷基(例如CFnH3_n，其中n为l或2)、或(C-O)-O-W,,其中W,是选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基或芳烷基的基团；并且荧光团或掩蔽(masked)荧光团可与R,(i=l~5)之一共价键合。此外，上面刚刚讨论过的化合物进一步具有以下实施方式R2和R3共同形成5、6或7元环，其选自芳基、杂环、杂芳基或杂芳环；R4和Rs共同形成5、6或7元环，其选自芳基、杂环、杂芳基或杂芳环；R是CH3或OCHzOZp其中Zi是选自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、芳酰基或聚醚的基团；R3，是(C-0)Z2，其中Z2是选自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、或聚醚的基团；且/或荧光团选自吖啶橙、蒽环、别藻蓝蛋白、BODIPY、花青、香豆素、Edans、曙红、赤藓红、荧光胺、荧光素、FAM(羧基荧光素)、HEX(六氯荧光素)、JOE(6-羧基-4，，5，-二氯-2，，7，-二曱氧基荧光素)、俄勒冈绿、藻蓝蛋白、藻红蛋白、若丹明、ROX(羧基-X-若丹明)、TAMRA(羧基四甲基若丹明)、TET(四氯荧光素)、德克萨斯红、四甲基若丹明和黄嘌呤。本发明还提供了在过亚硝酸根的测定中具有高度专一性和选择性的化合物。在一种实施方式中，所述化合物具有以下通式(II):(II)其中R7和RK)独立地为氩或选自卣素、低级烷基、低级烯基、卣代烷基、CN或戰的基团；R8、R9、Ru和Ru独立地为氢、由素、烷基、卣代烷基、烯基，或是选自酮基、醛、羧酸根、羧酸酯、烷基氨基、羟基、烷氧基、烷氧基烷基、聚醚、烷基硫代(alkylthio)、氰基、硝基的基团，或者具有(C-O)-Y或(C-O)-X-Y形式，其中X是低级烷基或烯基链，Y是氢或者选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、酮基、醛、羧酸根、羧酸酯、氨基甲酸酯、酰胺、氨基、烷基氨基羟基、烷氧基、聚醚、烷基硫代、氰基、硝基、磺酰基、无机酯的基团，或者为57元杂环，其环原子选自碳、氮、氧和硫，其中环原子进一步包括3~6个碳原子以及一般不超过2个的杂原子；Ru是ORt，或NR5，R6，，其中R4，、Rs，和R6，独立地为氢或选自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、芳酰基或聚醚的基团；R!4和Ri5独立地为氢、卣素、烷基、烷氧基、聚醚；或者R"和R!5共同形成5、6或7元环，其选自芳基、杂环、杂芳基或杂芳环；Rw是氢、烷基、烷氧基或聚醚；以及R,7是吸电子基团，其选自CF"卤素取代的低级烷基(例如CFJH3-n,其中n为1或2)或(00)-0-W2，其中\￥2是选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基或芳烷基的基团。此外，上面讨论的通式(II)的化合物进一步具有以下实施方式R9是(C-0)NR,R2"，其中R,和R2"是烷基(例如-(CH2)k-CH3，其中k=024，以及國(CH2)「CH3，其中1=0~24);Rs和R9共同形成环，优选为5、6或7元环，以形成环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环、杂芳基或杂芳环；R,2是(C-0)NR3"R4"，其中Rs，，和R4"是烷基(例如-(CH2)p-CH3，其中p=0~24,以及-(CH2)q-CH3，其中q一24);R"和Ri2共同形成环，优选为5、6或7元环，以形成环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环、杂芳基或杂芳环；和/或Rt，是CH3或OCH2OZ3,其中Z3是选自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、芳酰基或聚醚的基团。通式(II)表示的化合物可以盐的形式存在。生理上可接受的水溶性盐可适用于本发明的试剂和测定方法。此外，游离态的通式(II)所示化合物或其盐可以水合物或溶剂合物存在，这些物质中的任何一种均落入本发明的范围之内。对形成所述溶剂合物的溶剂类型没有特别限制。例如，乙腈、乙醇、水或乙腈-水混合物可以作为所述溶剂的例子。在另一种实施方式中，在过亚硝酸根的测定中具有高度专一性和选择性的化合物具有以下通式(III):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>(III)其中Rjs和R^独立地为氢、囟素、烷基或烷氧基；R20是氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、羧基烷基、羧酸酯或氨基烷基；R^和R22独立地为氢或选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、酮基、羧基烷基、羧酸根、羧酸酯、氨基曱酸酯、酰胺、氨基、烷基氨基、聚醚、烷基硫代、氰基、硝基、磺酰基或无机酯的基团；R23选自下式所示基团R7，、R8，、R9，和Rn)，独立地为氢或选自囟素(例如C1、Br或I)、烷基(例如CH3)、烷氧基、烷基氧基或聚醚的基团；Ru，是吸电子基团，其选自CF3、囟素取代的低级烷基(例如CFJH3-n,其中n为1或2)或(C-0)-0-W3，其中W3是选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基或芳烷基的基团；以及R24、R25、Rm和1127独立地为氢或选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氧基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、酮基、醛、羧酸根、羧酸、羧酸酯、氨基甲酸酯、酰胺、氨基、烷基氨基、聚醚、烷基硫代、氰基、硝基、磺酰基、无机酯的基团；Rm和1125共同形成5、6或7元环，其选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环、杂芳基或杂芳环；Rm和R^共同形成5、6或7元环，其选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环、杂芳基或杂芳环；或R26和R27共同形成5、6或7元环，其选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环、其中j一或1;杂芳基或杂芳环。此外，上面讨论的具有通式(III)的化合物进一步具有以下实施方式R/和R8，共同形成5、6或7元环，其选自芳基、杂环、杂芳基或杂芳环；R9，和R^，共同形成5、6或7元环，其选自芳基、杂环、杂芳基或杂芳环；R2o是-(CH2U-COOH，其中m-l24;R24和R25共同形成5、6或7元环，其选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环、杂芳基或杂芳环；R25和R26共同形成5、6或7元环，其选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环、杂芳基或杂芳环；和/或R26和Rr/共同形成5、6或7元环，其选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环、杂芳基或杂芳环。通式(III)表示的化合物也可以盐的形式存在。生理上可接受的水溶性盐可适用于本发明的试剂和测定方法。此外，游离态的通式(III)所示化合物或其盐可以水合物或溶剂合物存在，这些物质中的任何一种均落入本发明的范围之内。对形成所述溶剂合物的溶剂类型没有特别限制。例如，乙腈、乙醇、水或乙腈-水混合物可以作为所述溶剂的例子。已经发现，过亚硝酸根对通式(I)表示的某些特定酮的氧化方式类似于后者与过一硫酸根的反应，所述过一硫酸根的商业来源是Oxone(2KHS05*KHS04'K2S04)(产率为30-55%，转化率为100%)(图1)。该反应经由二氧杂环丙烷(dioxirane)中间体进行。二氧杂环丙烷的形成及其随后在分子内对酚衍生物的氧化，为设计用于专一性检测细胞内的过亚硝酸根的探针提供了基础。此外，已经发现，生物体系中存在的酮与其它活性氧中间体或活性氮中间体之间不会发生类似的反应。进一步发现，通过用荧光团取代酮中的一些基团，可以合成针对过亚硝酸根的荧光探针。在一种实施方式中，可通过PET(光诱导电子转移)机理来控制BODIPY基探针的荧光性质。基于PM3计算方法，设计了受到依赖于PET(光诱导电子转移)的荧光灭/亮开关机理(fluorescenceoff/onswitchingmechanism)控制的荧光探4十(图2)。在另一种实施方式中，在用过亚硝酸根氧化之前，将焚光团掩蔽起来，所述探针没有荧光性。然而，与过亚硝酸根反应后，该焚光团被释放出来，变得具有强焚光性。例如，荧光素/二氯荧光素的酚羟基处发生的衍生可显著降低荧光强度。因此，设计了不同的基于荧光素/二氯荧光素的探针。还发现，通式(II)或(III)表示的基本无荧光的化合物在生理条件下与过亚硝酸根高效反应，给出强荧光信号。因此，通过测定氧化态荧光化合物的荧光，可以非常高的专一性和选择性来测定过亚硝酸根，由所述通式(II)或(III)所示无荧光化合物与过亚硝酸根在活细胞或活组织内反应生成该氧化态荧光化合物。本发明还提供了用于测定过亚硝酸根的试剂，其包含上述任意化合物。本发明还提供了用于测定化学或生物样品(例如来自动物或植物的细胞和组织，以及微生物)中的过亚硝酸根的方法，其包括如下步骤a)使上述任意化合物与化学或生物样品接触；的荧光。本发明还提供了用于检测过亚硝酸根的高通量筛选荧光法，该方法包括使用以上提到的用于测定过亚硝酸根的试剂。本发明还提供了筛选化合物的高通量方法，所述化合物能增加或减少过亚硝酸根的产生，所述方法包括采用上述任意化合物。通用合成程序借助已知技术以及本文揭示的通用合成程序，有机合成领域的技术人员可以制备本发明的化合物。例如，通式(I)表示的一些化合物一般可利用Yang等概述的程序(义CTiew.，2000，65，4179-4184)来合成。通式(II)的化合物一般可通过以下程序合成(Nagano,T.等，j挑.CTie附.5"oc，2004,126,3357-3367)。一般合成方案如图2所示。在室温80。C的温度下，用催化量的TFA(三氟乙酸)在合适的溶剂(如二氯曱烷或1,2-二氯乙烷)中处理相应的(corresponding)吡咯部分和醛部分。当TLC监控显示相应的醛消耗完毕时，加入DDQ(2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醍)，并继续搅拌15~30分钟。通过后处理(work-up)和柱纯化，可以分离出纯的中间体，然后用乙醚合三氟化硼和三乙胺在二氯甲烷中处理所述中间体。在室温下搅拌溶液14小时。通式(II)表示的本发明化合物可先后通过后处理和纯化而分离出来。用于实施合成反应的优选化合物见"实施例"部分。其中，可独立制备相应的吡咯部分和醛部分，一些官能团可通过保护基予以保护。上述合成方案有时可通过选择不同的保护基来优化。举例而言，有关保护基的详细解释和合适的保护基的选择技术可参见名为《有机合成中的保护基》一书(iVCe"/veGVowps/wOrgam'c5^w^rew's，Greene,T.W.，JohnWiley&Sons,Inc.,1999)。通式(III)所示化合物一般可通过以下程序合成(John,E.T.等，丄CAe附.Soc，户e^/"7>a"s/.,1995,1993;McWatt，M.等，五w./CTie附.2001,2535-2545;Rychnovsky，S.D.等，义爿附.CAe/w.Src.1992，114，671~677)。该一般合成方案如图3所示。用叔丁醇钾在适当溶剂(如苯和甲醇的混合物)中的溶液处理相应的荧光素衍生物。当荧光素衍生物固体完全溶解时，真空蒸发溶剂，得到相应的钾盐。然后，加入溶于合适溶剂(如吡啶)中的R23I和CuCl，其中Ru如前文所定义。所得混合物在氩气下回流24小时。冷却至室温后，可先后通过后处理和纯化而分离出通式(III)所示的本发明化合物。用于实施合成反应的优选化合物见"实施例"部分。其中，可独立制备相应的荧光素衍生物和R23I，一些官能团可通过保护基予以保护。跟通式(II)所示化合物的一般合成方案一样，上述合成方案有时可通过选择不同的保护基来优化。术语"后处理"和"纯化"是指有机合成中所用的技术的组合，例如洗涤、过滤、萃取、蒸发、蒸馏、结晶、色谱处理等。中间体也可不经纯化而直接用于后续反应。实施例以下实施例1~4是对通式(II)所示化合物的制备和使用方法的详细描述。该详述落入上述"通用合成程序"的范围之内，并起示例作用，而所述"通用合成程序"构成本发明的一部分。这些实施例以及实施例5-9仅用于说明目的，无意限制本发明的范围。实施例1一ss-6的合成方案1)吡咯-2-甲酸的合成(如图4所示)将吡咯-2-曱醛(IO.O克，105毫摩尔)溶解在50毫升曱醇中，然后用500毫升蒸馏水稀释。加入新鲜制备的氧化银(48.3克，210毫摩尔)和氢氧化钠(8.5克，212毫摩尔)。然后在室温下搅拌反应混合物1小时。滤出沉淀，用热水洗涤。用乙醚(500毫升)萃取合并的滤液和洗涤液，然后在O'C用37%盐酸酸化。用乙醚(200毫升x4)萃取所得溶液。用硫酸镁干燥合并的有机萃取液。减压蒸发溶剂，得到吡咯-2-甲酸634-97-9(9.9克，产率85%)。2)N，N-二乙基-lH-吡咯-2-甲酰胺(ss-l)的合成(如图4所示)将吡咯-2-曱酸(IO.O克，90毫摩尔)溶解在250毫升二氯甲烷中，随后在氩气气氛下于O'C加入DCC(N，N，-二环己基碳二亚胺)(20.4克，99毫摩尔)、DMAP(4-二曱基氨基吡啶)(2.2克，18毫摩尔)和二乙胺(10.2毫升，99毫摩尔)。在0。C搅拌反应混合物30分钟，然后在室温搅拌8小时。用二氯甲烷稀释所得溶液，滤去固体。先后用稀盐酸和饱和碳酸氢钠溶液洗涤滤液。用硫酸钠干燥有机层，然后减压蒸发溶剂。用硅胶柱色谱纯化残留物(洗脱剂乙酸乙酯/正己烷=1/2),得到N，N-二乙基-lH-吡咯-2-曱酰胺，其为白色固体(10.5克，产率70%),熔点78.6-79.9。C;'HNMR(300MHz，CDC13):S10.1(br，1H),6.94-6.88(m，1H)，6.57-6.51(m，1H),6.26-6.21(m，1H)，3.95國3.86(m，4H)，1.31-1.24(m，6H);13C醒R(75.5Hz,CDC13):S161.9，120.7，111.3，110.1，109.5，41.9，13.4;IR(CH2C12)3442，2981，2937，1716,1600cm1;LRMS(EI)m/z(%)166(M+;100);HRMS(EI):对于C9H14N20，计算值166.1106,测量值116.1106。3)4-曱氧基肉桂酸甲酯的合成(如图5所示)将对羟基肉桂酸(IO.O克，61毫摩尔)溶解在200毫升丙酮中，在室温下加入碳酸钾(58.7克，213毫摩尔)。15分钟后，在氩气下于室温加入硫酸二曱酯(16.4毫升，213毫摩尔)，然后在氩气气氛下加热回流8小时。滤去固体，在滤液中加入50毫升水。减压蒸发溶剂，用200毫升乙酸乙酯萃取所得混合物两次。用硫酸钠干燥合并的有机层，然后减压蒸发溶剂。用硅胶柱色谱纯化残留物(洗脱剂乙酸乙酯/正己烷=1/10)，得到4-甲氧基肉桂酸甲酯832-01-91Ul.7克，产率99%)。4)3-(4-曱氧基苯基)丙酸曱酯的合成(如图5所示)将4-甲氧基肉桂酸甲酯Ul.7克，61毫摩尔)溶解在300毫升甲醇中。在强氩气流下緩慢加入钯(5%位于活化碳粉上；1.1克)。鼓泡通入氢气，将反应混合物剧烈搅拌2小时。滤出固体，用硫酸钠干燥滤液。减压蒸发溶剂，得到3-(4-甲氧基苯基)丙酸甲酯[15823-04-8(U.7克，99%)。5)3-(3-甲酰基-4-曱氧基苯基)丙酸甲酯(ss-2)的合成(如图5所示)将3-(4-甲氧基苯基)丙酸曱酯(500毫克，2.56毫摩尔)溶解在30毫升无水二氯曱烷中，随后在氩气下于-20。C加入TiClj(2.1毫升，19毫摩尔)和MeOCHCl2(0.81毫升，9.0毫摩尔)。在-20。C下搅拌反应混合物6小时。然后将反应混合物緩慢倒入稀盐酸溶液中。分离二氯甲烷层，依次用水和盐水洗涤，然后用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂。然后用硅胶柱色语纯化粗残留物(洗脱剂乙酸乙酯/正己烷=1/10),得到3-(3-曱酰基-4-曱氧基苯基)丙酸曱酯(ss-2),其为无色油状物(429毫克，产率75%)。^NMR(400MHz，CDC13):510.4(s，1H)，7.65(s，1H)，7.40(dd，J=6.3，1.6Hz，1H)，6.92(d，J=6.4Hz，1H),3.91(s，3H)，3.66(s,3H);2.92(t，J=5.6Hz，2H)，2.61(t，J=5.6Hz，2H);13C醒R(100MHz，CDC13):8189.7，173.0，160.4，135.9，132.7，127.8，124.6，111.8，55.7，51.6，35.4，29.7;IR(CH2C12)3055,2945，1734，1682cm1;LRMS(EI)m/z(%)222(M+;61)，149(100);HRMS(EI):对于C12H1404，计算值222.0892，测量值222.0892。6)N，N-二乙基-5-[2-甲氧基-5-(3-曱氧基-3-氧代丙基)苯基卜10H-二吡咯曱烯(dipyrrin)-1,9-二曱酰胺(ss-3)的合成(如图6所示)在氩气气氛下将化合物ss-1(134毫克，0.81毫摩尔)和ss-2(90毫克，0.41毫摩尔)溶解在30毫升无水1，2-二氯乙烷中。加入一滴TFA(三氟乙酸)，加热回流所得溶液。当TLC监控(二氧化硅；CH2Cl2)显示搭消耗完时，加入DDQ(2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌)(189亳克，0.81毫摩尔)在CH2C12中的溶液，持续搅拌15分钟。用水洗涤反应混合物，用MgS04干燥，过滤，蒸发。用硅胶柱色谱纯化粗化合物(洗脱剂乙酸乙酯/二氯曱烷/正己烷=1/1/1)，得到化合物ss-3，其为棕红色油状物(289毫克，67%)。^NMR(400MHz，CDC13):37.27(dd，J=8.4，1.9Hz，1H)，7.07(d，J=1.9Hz，1H)，6.92(d，J=8.4Hz，1H)，6.62(d，J=4.3Hz，2H)，6.45(d，J=4.3Hz，2H);3.72-3.60(m，14H),2.93(t，J=7.5Hz,2H),2.64(t,J=7.5Hz，2H)，1.30画1.23(m，12H);13C画R(75.5MHz,CDC13):S172.8，162.8，155.7，148.6，141.7，139.4，131.5，131.3，129.8，128.0，125.1,119.1，111.0，55.5，51.3，41.0(br)，35.5，29.6，12.5(br);IR(CH2C12)3483，2938，1639cm1;LRMS(EI)m/z(%)534(M+;21)，463(100);HRMS(EI):对于C3。H38N4Os,计算值534.2842,测量值534.2842。7)N，N-二乙基-8-2-甲氧基-5-(3-甲氧基-3-氧代丙基)苯基]-4，4-二氟-4-硼-3a，4a，-二氮杂-s-引达省(indacene)-3，5-二曱酰胺(ss-4)的合成(如图7所示)在氩气气氛下将化合物ss-3(100毫克，0.19毫摩尔)和三乙胺(0.73毫升，5.2毫摩尔)溶解在20毫升无水二氯甲烷中，室温下搅拌所得溶液10分钟。加入BF3-OEt2(0.73毫升，5.8毫摩尔)，继续搅拌40分钟。用水和2NNaOH洗涤反应混合物。用CH2Cl2萃取水溶液。用Na2S04干燥合并的有机萃取液，过滤，蒸发。用硅胶柱色镨纯化粗化合物(洗脱剂乙酸乙酯/二氯曱烷=1/1),得到化合物ss-4，其为橙色晶体(74毫克，产率70%)。熔点77.0~77.9°C;NMR(400MHz，CDC13):S7.33(dd，J=8.2，2.2Hz，1H)，7.12(d，J=2.2Hz，1H),6.98(d，J=8.5Hz,1H)，6.78(d，J=4.2Hz，2H)，6.44(d，J=4.2Hz，2H)，3.73(s，3H);3.66(s，3H)，3.58(q，J=7.1Hz，4H)，3.29(q，J=7.1Hz，4H)，2.95(t，J=7.5Hz，2H),2.64(t，J=7.5Hz，2H)，1.25(t，J=7.1Hz，6H)，1,10(t，J=7.1Hz，6H);13C應R(100MHz，CDC13):8172.7，162.6，155.4,151.0，145.1，135.2,131.9，131.3，131.2，131.1,121.9，116.6，111.3，55.4，51.4，42.8，38.4，35.4,29.5，13.7,11.9;19FNMR(376.5MHz，CDC13):S-144.2(m，J=30Hz)，-145.2(m,J=30Hz);IR(CH2C12)2980,1734，1640cm1;LRMS(EI)m/z(%)582(M+;21)，551(100);HRMS(EI):对于C30H37BF2N4O5，计算值582,2825，测量值582.2831。8)N，N-二乙基-8-5-羧乙基-2-甲氧基苯基卜4，4-二氟-4-硼-3a，4a，-二氮杂-s國引达省-3，5-二曱酰胺(ss-5)的合成(如图7所示)将化合物ss-4(100毫克，0.17毫摩尔)溶解在3毫升THF中，然后加入1毫升甲醇和l毫升蒸馏水。加入一水合氢氧化锂(22毫克，0.52毫摩尔)，持续搅拌6小时，然后加入1毫升盐水。用10毫升Et20将所得溶液萃取3次。用Na2S04干燥合并的有机萃取液，过滤，蒸发。所得粗化合物无须进一步纯化，直接用于下一步反应。9)N，N-二乙基-8-[2-甲氧基-(4，4，4-三氟-3-氧代丁基)苯基]-4,4-二氟-4-硼-33，48,-二氮杂-8-引达省-3，5-二曱酰胺(ss-6)的合成(如图7所示)将粗化合物ss-5(560毫克，约1.0毫摩尔)溶解在20毫升无水二氯甲烷中，然后在O'C和氩气气氛下加入草酰氯和一滴DMF。然后在室温下搅拌所得反应混合物30分钟。蒸发溶剂，在高真空条件下用泵抽掉痕量水和溶剂。然后，将所得固体重新溶解在20亳升无水二氯甲烷中。随后在-40'C和氩气气氛下加入三氟醋酐(0.84毫升，6.0毫摩尔)和无水吡啶(0.65毫升，8.0毫摩尔)。然后在-20。C搅拌反应混合物4小时。加入5毫升水，使反应猝灭，并用20毫升二氯曱烷萃取所得溶液2次。用MgS04干燥合并的有机萃取物，过滤，蒸发。用硅胶柱色i瞽纯化粗化合物(洗脱剂乙酸乙酯/二氯甲烷=1/2)，得到化合物ss-6，其为红色晶体(210毫克，约34%)。熔点83.6~84.6°C;HNMR(300MHz，CDC13):87.32(d，J=8,6，1H)，7.12(dd，J=6.5,2.2Hz，1H)，6.96(d，J=8.6Hz，1H)，6'73(d，J=4.0Hz，2H),6.43(d，J-4.6Hz，2H)，3.73(s，3H);3.59(q，J=7.2Hz,4H)，3.31(q，J=7.2Hz，4H)，3.06-3.00(m，2H)，2.83-2.77(m，1H)，2.08画2.03(m，1H)，1.25(t，JN7.1Hz，6H)，1.09(t，J=7.1Hz，6H);13CNMR(100MHz，CDCI3):Sl卯.4(q，Jc_F=35.4Hz),162.9，155.8，151.2，145.0，135,3，131.4，131.2，122.3，116.8,U1.6(q，Jc.产285Hz)，55.6，43.0，38.7，37.8，36.1，29.6，27.2，13.8，12.0;19FNMR(376.5MHz，CDC13):8画79.3(m，J=llHz)，-144.0(m，J=30Hz)，-145.3(m，J=30Hz);IR(CH2C12)2980，1639，1565cm、LRMS(EI)m/z(%)620(M+;30)，589(100);HRMS(EI):对于C3。H34BF5N404，计算值620.2593，测量值620,2598。实施例21)ss-6的荧光光谱将实施例1中得到的化合物ss-6溶解于CH3CN至浓度为2mM，然后向该溶液中加入100mM磷酸钠緩冲液(pH7.4)使其溶解，终浓度为20pM。用PerkinElmerLS50荧光光谱仪测定20jiMss-6溶液的激发光谱和荧光光谱。用于测定激发光谱和荧光光谱的狭缝宽度均为5纳米，光电倍增管电压为775伏。在515纳米的激发光波长处进行测定。所得结果示于图8。为了研究ss-6与过亚硝酸根(ONOO-)之间的反应，按照Keith和Powell(Keith,W.G.&Powell,R.E.;氾weft.csrfec糊/7柳'ft'卵o//;emx:j;m'^"sac/rf;J.Chem.Soc.A.，1969，l，90)的方法制备ONOCT溶液。筒而言之，用盐酸(0.6摩尔/升)酸化亚硝酸钠(0.6摩尔/升)和过氧化氢(0.7摩尔/升)的混合物，在1~2秒内加入氢氧化钠(1.5摩尔/升)以中和酸，使溶液呈碱性。使该溶液通过二氧化锰，以驱除过量的过氧化氢。然后冷冻该溶液，分离出富含过亚硝酸根的暗黄色溶液，用于以下所有试验。利用1670厘米"(摩尔/升)"的消光系数(302纳米处)估测所用储备溶液中过亚硝酸根的浓度(Hughes&Nicklin;Thechemistryofpernitrites.PartI.Kineticsofdecompositionofpernitriousacid;CAew.5"ocA，1968,2,450-452)。所制备的过亚硝酸盐溶液的碱性一般非常强(pH12)。当加入较大量的过亚硝酸盐时，在实验当天中和部分过量的碱。在研究开始和结束时，都要检查该较低碱性的过亚硝酸盐溶液的吸光率，以确定过亚硝酸根在所需孵育时间内没有分解。还要定期检查孵育管，以确信加入过亚硝酸盐后，最终的pH没有变化。随后在室温和剧烈搅拌下，向20nMss-6溶液中緩慢加入不同浓度的15当量ONOO-溶液。体积变化不得超过1%。30分钟后测定荧光强度的变化，结果示于图9。反应完成后，利用上述相同条件测定溶液的激发光谱和荧光光谱。与图8相比，可以看到荧光强度急剧增加。2)ss-6的紫外-可见光吸收光谱将化合物ss-6溶解于二氯甲烷至浓度为20jiM,测定所得20pMss-6溶液的吸收光谱，结果示于图10。该结果证实了ss-6在515纳米附近有最大吸光度。实施例3—比较ss-6与不同活性氧中间体的专一性将实施例1中得到的化合物ss-6溶解于CH3CN至浓度为2mM，然后向所得溶液中加入100mM磷酸钠緩冲液(pH7.4)使其溶解，终浓度为20jiM。将50微升不同的活性氧中间体(10当量)分别加入5毫升相应的ss-6溶液中。测定处理前后荧光强度的变化，在实施例2中所述相同条件下测定荧光强度。上述荧光探针的浓度均为20jiM(lOOmM磷酸钠緩冲液，pH7.4)。结果示于表1。结果证实了ss-6具有非常高的选择性。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>(a)SIN-1在緩冲液中能緩慢产生ONOO-。(b)加入Fe(CI04)2(25微升，40mM在緩冲液中)和H202(25微升，80mM),(c)在37。C下加入3-(l，4-二氢-l，4-桥二氧-l-萘基)丙酸(50微升，20mM)。(d)首先加入黄嘌呤氧化酶，待所有XO溶解后，加入黄嘌"H50微升，20mM)。实施例4—ss-6对过亚硝酸根的专一性检测将实施例1中得到的化合物ss-6溶解于CH3CN至浓度为2mM，然后向该溶液中加入100mM磷酸钠緩冲液(pH7.4)使其溶解，终浓度为20jiM。然后加入过亚硝酸才艮，使其终浓度达到0、20、60、100、200、240和300nM，30分钟后测定荧光光语。在与实施例2中相同的条件下测定荧光光谱，结果示于图11。从图ll可清楚看到，ss-6极大提高了荧光强度，且荧光强度与ONOO-的浓度具有良好的线性关系(如图12所示)。以下实施例详细描述了通式(III)所示化合物的制备和使用方法。该详述落入上述"通用合成程序"的范围之内，并起示例作用，而所述"通用合成程序"构成本发明的一部分。这些实施例仅用于说明目的，无意本限制发明的范围。实施例5—ss-12的合成方案1)ss-7的合成(如图13所示)向2，7-二氯荧光素(l.O克，2.5毫摩尔)的DMF(二甲基甲酰胺)溶液中加入烯丙基溴(0.47毫升，5.0毫摩尔)。在60。C下搅拌反应混合物3小时后，加水，形成红色固体。过滤得到化合物ss-7，产率大于99%。NMR(300MHz，CDC13):S8.33(d，J=7.6，1H)，7'78(t，J=7.3Hz，1H)，7'74(t，J=7.3Hz，1H)，7.30(d，J=7.3Hz，1H)，7.03(d，J=2.8Hz，2H)，6.96(s，1H);6.58(s，1H)，6.12國6.00(m，1H)，5.74國5.58(m,1H)，5.56誦5.38(m，2H)，5.21-5.13(m，2H)，4.75(d，J=6.2Hz,2H)，4.53(d，J=5.8Hz,2H);13C醒R(75MHz，CDC13):8177.71，164.54，158.16，157.79，152.35，149.52，135.28，133.55,133,12，131.59，131.05，130.97，130.38，130.27，130.13，128.03，127.29，120.43，119.29，119.08，117.71，115.04，105.67，101.14，70.35，66.10;IR(CH2C12)1718，1589cm';LRMS(EI)m/z(%)480(M+;100);HRMS(EI):对于C26H17C1205，计算值480.0453，测量值480.0447。2)ss-8的合成(如图14所示)将化合物ss-7(1.2克，2.5毫摩尔)溶解在丙酮(50毫升)与NaOH(1.25M,50毫升)的混合物中，将所得溶液加热至回流，并保持1小时。冷却到室温后，在反应混合物中加入1N盐酸，以将溶液中和到pH2。加入乙酸乙酯进行萃取。有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，真空蒸发。用硅胶柱色语纯化残留物，得到化合物ss-8(760毫克，产率68%)。，HNMR(400MHz，CDC13):S8.30(br，1H)，8.07(d，J=7.1Hz，1H)，7.72(t,J=7.3Hz,IH)，7.68(t，J=7.3Hz，1H),7.16(d，J=7.4Hz，IH)，6.91(s，IH);6.80(s,IH)，6.73(s，1H),6.71(s，IH)，6.10画6.03(m，IH)，5.48(d，J=17.2Hz,IH)，5.36(d，J=10.5Hz，IH)，4.12(d，J=7.2Hz，2H);13C醒R(lOOMHz，CDC13):S168.27，155.21，155.04，151.51，150.30，149.98，135.96，132.59,130.59，128.27，128.09，125.83，125.18，123.95，118.10，117.26，116.44，111.48，110.34,103.62，102.39，81.23，69.53;IR(CH2CI2)2955，1771，1597cm1;LRMS(EI)m/z(%)440(M+;3)，361(100);HRMS(EI):对于C23H14C1205，计算值440.0218,测量值440.0222'3)ss-9的合成(如图15所示)在室温下，在叔丁醇钾(230毫克，2.0毫摩尔)在苯(8毫升)和甲醇(3毫升)的混合物中形成的溶液中加入ss-8。当固体完全溶解后，真空蒸发溶剂，得到相应的钾盐。然后，加入CuCl(204毫克，1.9毫摩尔)和溶于吡啶(9毫升)中的化合物ss-8(980毫克，3.4毫摩尔)。所得混合物在氩气下回流24小时。冷却到室温后，反应混合物用HC1水溶液酸化。用乙酸乙酯萃取所得混合物。有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，真空蒸发。用硅胶柱色谱纯化残留物，得到化合物ss-9(200毫克，产率20%)。力NMR(300MHz，CDCI3):88.07(d，J=6.6Hz，1H),7.74(t,J=7.3Hz，1H)，7'71(t，J=7.3Hz，1H)，7.24(d，J=8.3Hz，2H),7'18(d，J=7.0Hz，1H)，7.00(d，J=8.4Hz,2H);6.82(s，1H)，6.74(s，1H)，6.73(s，1H)，6.71(s，1H),6.08-6.01(m，1H)，5.46(d,J=17.2Hz，1H),5.34(d，J=10.5Hz，1H)，4.62(d，J=5.0Hz，2H),3.70(s，3H)，2.98(t，J=7.5Hz，2H)，2.66(t，J=7.5Hz,2H);13CNMR(75MHz，CDC13):5173.16，168.74，155.62，155.33，153.67，151.91，150.43，150.37，137.21，135.51,131.65，130.38，129.94，129.36，128.74，126.34，125.50，123.81，119.78，118.83，118.47，115.29，114.10，111.32，106.29，101.52，81.53，69.83，51.68，35.64，30.19;IR(CH2C12)3055，2928，1765，1589，1475，1412cm";LRMS(EI)m/z(%)602(M+;100);HRMS(EI):对于C33H24C1207,计算值602.0899，测量值602.0890。4)ss-10的合成(如图16所示)在室温下，向化合物ss-9(874毫克，1.44毫摩尔)在THF(IO毫升)和水(3毫升)中的溶液里加入LiOH'H20(300毫克，7.2毫摩尔)。在40。C下搅拌3小时后，用1N盐酸酸化反应混合物。用NaCI使所得溶液达到饱和，并用乙酸乙酯进行萃取。用无水硫酸钠干燥合并的有机层，浓缩得到ss-10(500毫克，产率60%)。'HNMR(400MHz，CDC13):S8.30(br，1H)，8.08(d，J=7.3Hz，1H)，7.74(t，J=7.3Hz,1H)，7.70(t,J=7.3Hz，1H)，7.26(d，J=8.3Hz,2H)，7.18(d，J=7.0Hz，1H);7.01(d，J=8.4Hz，2H),6.82(s，1H)，6.74(s，1H)，6.73(s，1H)，6.71(s,1H),6.06-6.00(m:1H)，5.46(d，J=17.2Hz，1H),5.33(d，J=10.5Hz，1H)，4.61(d，J=5.0Hz，2H)，2.99(t，J=7.5Hz，2H)，2.72(t，J=7.5Hz，2H);13C醒R(75MHz，CDC13):8177.77，168.81，155.67，155.30，154.83,151.93，150.46，150.42，136.87，135.55，131.67，130.42，129.97，129.41，128.78，126.38，125.55，123.83，119.80，118.89，118.50，115.37，114.21，111.35，106.42,101.56，81.59，69.87，35.76，29.93;IR(CH2C12)3421，3055，1765，1624,1416cm1;FABm/z589(JVT);HRMS(EI):对于C32H22C1207，计算值589.0821，测量值589.0820。5)ss-11的合成(如图17所示)在化合物ss-10(490毫克，0.83毫摩尔)的CH2C12(15毫升)溶液中加入将草酰氯(0,22毫升，2.5毫摩尔)，在室温下搅拌所得溶液3小时。减压蒸发掉溶剂和过量的草酰氯。将所得酰基氯溶解在CH2C12(20毫升)中，然后在氮气下于-40"加入三氟醋酐(0.7毫升，5毫摩尔)和吡啶(0.54毫升，7毫摩尔)'使所得混合物緩慢升温到-20。C，在该温度下持续搅拌4小时。緩慢加水，使反应猝灭。用盐水洗涤反应混合物。用无水硫酸钠干燥有机层并浓缩。用快速柱色谱纯化残留物，得到ss-l1，其为黄色固体(240毫克，产率45%)。熔点85.0~86.1°C;NMR(400MHz，CDC13):S8.08(d，J=7.4Hz，1H)，7.76-7.68(m，2H)，7.26(d，J=8.5Hz，2H)，7.18(d，J=7.4Hz，1H)，7.02(d，J=8.4Hz,2H),6.83(s，1H);6.74(s，1H)，6.73(s，1H)，6.71(s，1H)，6.07-6.00(m，1H),5.46(d，J=17.2Hz，1H)，5.33(d，J=10.5Hz，1H)，4.62(d,J=4.4Hz，2H),3.10-3.07(m，2H)，3.04画3.00(m,2H);13CNMR(101MHz，CDC13):S190.5(q，Jc.F=35.3Hz)，168.72，155.67，155.09，154.12，151.91，150.43，150.41，135.79,135.53，131.66，130.41，129.97，129.44，128.76，126.36，125.52，123.81，120.07，119.82，118.92，118.47，H5.70(q，Jc.F=292Hz)，114.41，111.34，106.60，101.55，81.49，69.86，37.99，27.61;19F(376MHz，CDC13)S-79.18;IR(CH2C12)3055，1765，1597，1475，1402cm1;LRMS(EI)m/z(%)640(M4)，561(100);HRMS(EI):对于C33H21a2F306,计算值640.0665，测量值640.0667。6)ss-12的合成(如图18所示)向化合物ss-11(260毫克，0.4毫摩尔)在混合溶剂CH3CN(4毫升)、CC14(4毫升)和水(6毫升)中形成的溶液里依次加入催化剂RuCl3'3H20(5毫克)和NaI04(865毫克，4,0毫摩尔)在室温下剧烈搅拌所得混合物1小时，然后加入CH2Clz。分离有机层，用无水硫酸钠干燥，浓缩后得到残留物。用快速柱色语纯化残留物，得到化合物ss-12(214毫克，产率80%)。熔点105.0~106.0°C;NMR(400MHz，CDC13):58.09(d，J=7.2Hz，IH)，7.76-7.71(m，2H)，7.24(d，J=8.5Hz，2H),7.18(d，J=7.4Hz，IH)，7.01(d，J=8.5Hz，2H)，6.83(s，1H);6.78(s，IH)，6'71(s，1H)，6'67(s，IH)，4.76(d,J=2.5Hz，2H)，3.08(t，J=6.2Hz，2H)，3.02(t，J=6.2Hz，2H);13CNMR(75MHz，CDC13):5190.48(q，Jc.F=35.3Hz)，172.44，168.82，155.23，154.72，153.97，151.77，150.32，150.24,135.88，135.64,130.51，129.99，129.40，129.24，126.21，125.59，123.82，120.16，119.87，118.94，U5.46(q，Jc—F=292.2Hz)，114.13，112.71，106.44，101.67，81.34，65.49，37.96，27.57;IR(CH2C12)3420，3055，1765，1610，1408cm1;LRMS(EI)m/z(%)614(M+画COOH;19)，579(100);HRMS(EI):对于C31H18CI2F306，计算值613.0433,测量值613.0469。实施例61)ss-12的荧光光谱将实施例5中得到的化合物ss-12溶解于CH3CN至浓度为2mM，然后向所得溶液中加入lOOmM磷酸钠緩冲液(pH7.4)使其溶解，终浓度为20fiM。用PerkinElmerLS50荧光光镨仪测定20fiMss-12溶液的激发光镨和荧光光谱。用于测定激发光谱和荧光光谱的狭缝宽度均为2.5纳米，光电倍增管电压为775伏。在490纳米的激发光波长处进行测定。所得结果示于图19。随后在室温和剧烈搅拌下，向20jiMss-12溶液中緩慢加入不同浓度的15当量ONOO-溶液。体积变化不得超过1%。30分钟后测定荧光强度的变化，结果示于图20。反应完成后，利用上述相同条件测定溶液的激发光谱和荧光光谱。与图19相比，可以看到荧光强度急剧增加。2)ss-12的紫外-可见光吸收光谱将化合物ss-12溶解于二氯甲烷至浓度为20pM，测定所得的20jiMss-12溶液的吸收光谱，结果示于图21。结果表明，ss-12在460纳米和490纳米附近有两个吸收峰。实施例7—比较ss-12与不同活性氧中间体的专一性将实施例5中得到的化合物ss-12溶解于CH3CN至浓度为2mM,然后向该溶液中加入100mM磷酸钠緩冲液(pH7.4)使其溶解，终浓度为20fiM。将50微升不同的活性氧中间体(10当量)分别加入到5毫升相应的ss-12溶液中。测定处理前后荧光强度的变化，在实施例2中所述相同条件下测定荧光强度。上述荧光探针的浓度均为20jiM(100mM磷酸钠緩沖液，pH7.4)。结果示于表2。结果证实了ss-12具有非常高的选择性。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>(a)请参见实施例3表1中ROS的产生过程。(b)通过SNP(二水合亚硝基铁(III)氰化钠)产生NO(FeelischM.，义1993，14,123-132)。实施例8—ss-12对过亚硝酸根的专一性检测将实施例5中得到的化合物ss-12溶解于CH3CN至浓度为2mM，然后向该溶液中加入100mM磷酸钠緩冲液(pH7.4)使其溶解，终浓度为20pM。然后加入过亚硝酸根，使其终浓度达到0、20、60、100、200、240和300fiM，30分钟后测定荧光光谱。在与实施例6中相同的条件下测定荧光光谱，结果示于图22。从图22可清楚看到，ss-12极大提高了荧光强度，且荧光强度与ONOCT的浓度具有良好的线性关系(如图23所示)。实施例9一细胞试验在该研究的整个过程中，由胚龄为15天的Sprague-Dawley大鼠制备原代培养的皮质神经元。简而言之，在聚-L-赖氨酸包被的6孔板上(BDBiosciences,SanDiego，CA，USA)上用Neurobasal/2%B27(Gibco-BRL，GrandIsland,NY)平板培养(plated)解离的细胞悬浮体，密度为2xl()S个细胞/孔，所述Neurobasal/2%B27中有含谷氨酸(0.5mM，SigmaChemicalCompany,St.Louis,MO)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100jig/mL).在5%C02-95%空气和37。C条件下，将细胞保持在增湿孵育器中。在第10天，将培养的皮质细胞用于实验，用浓度为20fiM的ss-6和ss-12在孵育所述经过原代培养的神经元细胞15分钟，然后用磷酸钠緩冲液(100mM，pH7.4)洗涤3次。随后，分别用10和IOOjiMSIN-1(3-吗啉代_斯德酮亚胺*盐酸)处理细胞15分钟。用磷酸钠緩冲液(100mM,pH7.4)洗涤后，在荧光显微镜下观察细胞。结果表明，探针在测定分子内ONOO-的产生方面给出了令人满意的结果(如图24所示)。参考文献1.PCT国际公开WO01/64664，公开于2001年9月7日(Nagano等)。2.PCT国际公开WO2004040296，公开于2004年5月31日(Nagano等)。3.Augusto，O.;Radi，R,Gatti，R.M.;Vasquez國Vivar，J.MethodsEnzymol.1996，269，346-354.4.Beal，M.F.，FreeRadicalBiol.&Med.2002,32，392.5.Beckman，J.S.，Am.J.Physiol.CellPhysiol.1996，271，C1424.6.BeckmanJ.S.，IschiropoulosH，ZhuL，vanderWoerdM，SmithC,ChenJ,HarrisonJ，MartinJ,C.andTsaiM.，ArchBiochem.Biophys.,1992，298，438-445.7.Crow,J.P.，NitricOxide.1997，1,145-157.8.Cuzzocrea，S.，Riley,D.P.，Caputi，A.P.，Salvemini，D.，PharmacolRev.2001，53，1359.FeelischM.，EurHeartJ.1993，14，123-132.10.Gatti，R.M.，Alvarez,B.,Vasquez-Vivar，J.，Radi，R.，Augusto,O.，Arch.Biochem.Biophys.1998，349，36-46.11.Gatti，R.M.，Radi，R.，Augusto,O.，FEBSLett.,1994,348，287-290.12.Groves,J.T.，Curr.Opin.Chem,Biol.1999，3,226.13.Gryglewski，R.，Nature1986，320，454.14.Hughes,M.N.，Nicklin,H.G，，J.Chem.Soc.A.，1968，2，450-452.15.Ischiropoulos,H.，Arch.Biochem.Biophys.1998，356，1-11.16.Ischiropoulos,H.，Gow，A.，Thom，S.R.，Kooy，N,W,，Royall，J.A,，Ceow，J.P.,MethodsEnzymol.1999，301，367-373.17.John,E.T.Corrie，DavidR.Trentham，J.Chem.Soc.，PerkinTransI.，1995，1993.18.Kaur，H.，Halliwell，B.，FEBSLett.1994，350，9-12,19.Keith,W.G.，Powell,R.E.，J.Chem.Soc，A.，1969，1，90.20.Kooy，N.W.，Royall,J.A.，Ischiropoulos,H.，Beckman,J.S.，FreeRadic.Biol.Med.1994，16，149-156.21.Kooy，N.W.，Royall,J.A.，Ischiropoulos,H.,FreeRadic.Biol.Med.1997，27，245-254.22.Koppenol，W.H.，RedoxReport2001，6，339-341.23.Lipton，S.A.，Ghol，Y,國B，Pan,Z.-H，Lei，S.-Z.，Ghen，H.-S.V,，Sucher，IV,J.，Loscanizo，J.，24,Singel，D.J.，Stamier，J.S.,Nature1993，364，626.24.Mematt,M.，Geert國JanBoons.,，Eur.J.Org.Chem.2001，2535-2545.25.MacMillan國Ciw，L.A;Crow，J.P.;Kerby，J.D.;Beckman,J.S.;Thomson,J.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996，93，11853.26.Miles,A.M.;Bohle，D.S.;Glassbrenner,P.A.;Hansert，B.;Wink，D.A.;Grisham，M.S.，J.Biol.Chem.1996，271，40-47.27.Nagano,T.;Gabe，Y.;Urano，Y.;KikuchiK.;KojimaH.，J.Am.Chem.Soc.2004，126，3357-336728.Pappolla,M.A.;Chyan，Y.-J.;Poeggeler,B.;Frangione,B.;Wilson,G.;Ghiso，J.;Reiter,R.J.，J.NeuralTransm.2000，107，203.29.Radi，R.，Chem,Res.Toxicol,1998，11，720-721.30.Radi，R.;Beckman,J.S.;Bush,K.M.;Freeman,B.A.，ArchBiochem.Biophys"1991,288，481.31.Radi，R,;Beckman,J.S.;Bush,K.M.andFreeman,B.A.，J.Biol.Chem.,1991，266，4244-4250.32.Radi，R.;Peluffo，G.;Alvarez,M.N.;Naviliat，M.;Cayota，A，FreeRadicalBiol.&Med.2001，30，463-488.33.Rodenas，J.;Carbonell，T.;Mitjavila,M.T.，FreeRadical.Biol.&Med.2000，28，374.34.Romero,N.;Denicola，A.;Souza，J.M.;Radi，R.，Arch.Biochem.Biophys.，1999，368，23-30.35.Royall，J.A.;Ischiropoulos,H,，Arch.Biochem.Biophys.1993，302，348-355.36.Rychnovsky，S.D.;Skalitzky,D.J.;Pathirana,C.;Jensen,P.R.;Fenical,W，，J.Am.Chem.Soc.1992,114，671-677.37.Setsukinai,K.;Urano，Y.;Kakinuma,K;Nagano,T.，J.Biol.Chem.2003:278，3170-3175.38.Shi，H.;Noguchi,N.;Xu，Y.;Niki，E.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1999，257，651,39.Squadrito,G.LandPryor，W.A.，FreeRadicalBiol.&Med.1998,25，797.40.Szabo，C.Toxicol.Lett.2003，140，105.41.Tarpey，M.M.;Fridovich,I"Circ.Res.2001，89，224-236.42.White,C.R.;Brock,T.A.;Chang,LY.;Crapo，J,;Briscoe,P.;Ku，D.;Bradley,W.A.;Gianturio，S.H.;Gore,J.;Freeman,B.A.;Tarpey,M.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1994，91，1044.43.Yang,D.;Wong,M,K.;Yan，Z.;J.Org.Chem.，2000，65，4179-4184.44.HandbookofFluorescentProbesandResearchProducts,9thEdition,MolecularProbes,Eugene,Oregon,Haughland,2003.45.ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,Greene,T.W.，JohnWiley&Sons,Inc.,1999.权利要求1.一种组合物，其组合物与过亚硝酸根发生专一性反应，而不与其它的活性氧中间体和活性氮中间体反应，所述组合物包含以下通式(I)、(II)、(III)表示的化合物或其盐其中R1为OR1’或NR2’R3’，其中R1’、R2’和R3’独立地为氢或选自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、芳酰基或聚醚的基团；R2、R3、R4和R5独立地为氢或选自卤素、烷基、烷氧基、聚醚的基团；R2和R3共同形成5、6或7元环，其选自芳基、杂环、杂芳基或杂芳环；或者R4和R5共同形成5、6或7元环，其选自芳基、杂环、杂芳基或杂芳环；R6是吸电子基团，选自CF3、卤原子取代的低级烷基或(C＝O)-O-W1，其中W1是选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基或芳烷基的基团；荧光团可与Ri(i＝1～5)之一共价键合；R7和R10独立地为氢或选自卤素、低级烷基、低级烯基、卤代烷基、CN或NO2的基团；R8、R9、R11和R12独立地为氢、卤素、烷基、卤代烷基、烯基，或为选自酮基、醛、羧酸根、羧酸酯、烷基氨基、羟基、烷氧基、烷氧基烷基、聚醚、硫醇、烷基硫代、氰基、硝基的基团，或者具有(C＝O)-Y或(C＝O)-X-Y的形式，其中X是低级烷基或烯基链，Y是氢或选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、酮基、醛、羧酸根、羧酸酯、氨基甲酸酯、酰胺、氨基、烷基氨基、羟基、烷氧基、聚醚、硫醇、烷基硫代、氰基、硝基、磺酰基、无机酯的基团，或者为5～7元杂环，其中环原子选自碳、氮、氧和硫，其中环原子包括3～6个碳原子以及不超过2个的杂原子；R13是OR4’或NR5’R6’，其中R4’、R5和R6’独立地为氢或选自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、芳酰基或聚醚的基团；R14和R15独立地为氢、卤素、烷基、烷氧基、聚醚；或者R14和R15共同形成5、6或7元环，其选自芳基、杂环、杂芳基或杂芳环；R16是氢、烷基、烷氧基或聚醚；R17是吸电子基团，其选自CF3、卤素取代的低级烷基或(C＝O)-O-W2，其中W2是选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基或芳烷基的基团；R18和R19独立地为氢、卤素、烷基或烷氧基；R20是氢或选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、羧基烷基、羧酸酯或氨基烷基的基团；R21和R22独立地为氢或选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、酮基、羧基烷基、羧酸根、羧酸酯、氨基甲酸酯、酰胺、氨基、烷基氨基、聚醚、烷基硫代、氰基、硝基、磺酰基或无机酯的基团；以及R23选自下式所示基团其中j＝0或1；R7’、R8’、R9’和R10’独立地为氢或选自卤素、烷基、烷氧基、烷基氧基、聚醚的基团；R7’和R8’共同形成5、6或7元环，其选自芳基、杂环、杂芳基或杂芳环；或者R9’和R10’共同形成5、6或7元环，其选自芳基、杂环、杂芳基或杂芳环；R11’是吸电子基团，其选自CF3、卤素取代的低级烷基或(C＝O)-O-W3，其中W3是选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基或芳烷基的基团；以及R24、R25、R26和R27独立地为氢或选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氧基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、酮基、醛、羧酸根、羧酸、羧酸酯、氨基甲酸酯、酰胺、氨基、烷基氨基、聚醚、硫醇、烷基硫代、氰基、硝基、磺酰基、无机酯的基团；R24和R25共同形成5、6或7元环，其选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或杂芳基或杂芳环；R25和R26共同形成5、6或7元环，其选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或杂芳基或杂芳环；或R26和R27共同形成5、6或7元环，其选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或杂芳基或杂芳环。2.权利要求1所述的化合物，其中R是CH3。3.权利要求1所述的化合物，其中Rr是OCBhOZ"4.权利要求3所述的化合物，其中Z，是选自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、芳酰基或聚醚的基团。5.权利要求4所述的化合物，其中Zi是CH3。6.权利要求1所述的化合物，其中IV是NR2，R3，。7.权利要求6所述的化合物，其中R是氢。8.权利要求7所述的化合物，其中R3，是(C-0)Z2。9.权利要求8所述的化合物，其中Z2是选自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基或聚醚的基团。10.权利要求l所述的化合物，其中&和R3共同形成5、6或7元环，其选自芳基、杂环或杂芳基或杂芳环。11.权利要求l所述的化合物，其中R4和Rs共同形成5、6或7元环，其选自芳基、杂环或杂芳基或杂芳环。12.权利要求l所述的化合物，其中R6是卣素取代的低级烷基。13.权利要求12所述的化合物，其中R6是CFnH3—n。14.权利要求13所述的化合物，其中"n"为1或2。15.权利要求l所述的化合物，其中Wn是CH3。16.权利要求1所述的化合物，其中W,是叔丁基。17.权利要求l所述的化合物，其中R7是CH3。18.权利要求1所述的化合物，其中所述荧光团选自吖啶橙、蒽环、别藻蓝蛋白、BODIPY、花青、香豆素、Edans、曙红、赤藓红、荧光胺、荧光素、FAM(羧基荧光素)、HEX(六氯荧光素)、JOE(6-羧基-4，，5，-二氯-2，，7，-二甲氧基荧光素)、俄勒冈绿、藻蓝蛋白、藻红蛋白、若丹明、ROX(羧基-X-若丹明)、TAMRA(羧基四曱基若丹明)、TET(四氯荧光素)、德克萨斯红、四曱基若丹明和黄嘌呤。19.权利要求l所述的化合物，其中R9是(00)NR，R2"。20.权利要求19所述的化合物，其中R，是-(CH2)k-CH3.21.权利要求20所述的化合物，其中k-024。22.权利要求19所述的化合物，其中R2"是-(CH2),-CH3。23.权利要求22所述的化合物，其中1=0~24。24.权利要求l所述的化合物，其中Rg和R9共同形成5、6或7元环，其选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环、杂芳基或杂芳环。25.权利要求l所述的化合物，其中Ru选自(C-0)NR3"R4"。26.权利要求25所述的化合物，其中R3"是-(CH2)p-CH3。27.权利要求26所述的化合物，其中p=0~24。28.权利要求25所述的化合物，其中R4"是-(CH2)q-CH3。29.权利要求28所述的化合物，其中q=0~24。30.权利要求l所述的化合物，其中Rn和Ru共同形成5、6或7元环，其选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或杂芳基或杂芳环。31.权利要求1所述的化合物，其中R4，是CH3。32.权利要求1所述的化合物，其中R4，AOCH2OZ3。33.权利要求32所述的化合物，其中Z3是选自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、芳酰基或聚醚的基团。34.权利要求33所述的化合物，其中Z3是CH3。35.权利要求1所述的化合物，其中Ru，是NRs，R6，。36.权利要求35所述的化合物，其中Rs，是氢。37.权利要求36所述的化合物，其中IV是(C-0)Z4。38.权利要求37所述的化合物，其中Z4是选自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、聚醚的基团。39.权利要求l所述的化合物，其中R"和Rw共同形成5、6或7元环，其选自芳基、杂环、杂芳基或杂芳环。40.权利要求1所述的化合物，其中Rn是卣素取代的低级烷基。41.权利要求40所述的化合物，其中Rn是CFJH:^。42.权利要求41所述的化合物，其中"n"为1或2。43.权利要求1所述的化合物，其中\￥2是CH3。44.权利要求1所述的化合物，其中\￥2是叔丁基。45.权利要求l所述的化合物，其中R^是C1、Br或I。46.权利要求1所述的化合物，其中议18是CH3。47.权利要求l所述的化合物，其中R^是C1、Br或I。48.权利要求1所述的化合物，其中Rw是CH3。49.权利要求1所述的化合物，其中R2Q是-(CH2)m-COOH。50.权利要求49所述的化合物，其中m-l24。51.权利要求l所述的化合物，其中R/和Rs，共同形成5、6或7元环，其选自芳基、杂环或杂芳基或杂芳环。52.权利要求l所述的化合物，其中119，和R^，共同形成5、6或7元环，其选自芳基、杂环、杂芳基或杂芳环。53.权利要求l所述的化合物，其中Ru，是自素取代的低级烷基。54.权利要求40所述的化合物，其中Ru，是CFnH3—n。55.权利要求41所述的化合物，其中"n"为1或2。56.权利要求1所述的化合物，其中W3是CH3。57.权利要求1所述的化合物，其中\￥3是叔丁基。58.权利要求l所述的化合物，其中1124和R2s共同形成5、6或7元环，其选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或杂芳基或杂芳环。59.权利要求l所述的化合物，其中Rm和Rm共同形成5、6或7元环，其选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或杂芳基或杂芳环.60.权利要求l所述的化合物，其中Rm和1127共同形成5、6或7元环，其选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或杂芳基或杂芳环。61.用于测定过亚硝酸根的试剂，其包含根据权利要求1所述的化合物。62.测定样品中过亚硝酸根的方法，其包括以下步骤a)使根据权利要求1所述的化合物与样品接触；荧光。63.权利要求62所述的方法，其中所述样品是化学样品或生物样品。64.权利要求63所述的方法，其中所述生物样品是动物细胞、动物组织、植物细胞、植物组织或微生物。65.用于检测过亚硝酸根的高通量篩选荧光法，其包括使用根据权利要求61所述的试剂。66.用于筛选化合物的高通量方法，所述化合物能增加或减少过亚硝酸根的产生，所述方法包括使用根据权利要求l所述的化合物。全文摘要本发明提供了能与过亚硝酸根发生专一性反应，而不与其他的活性氧中间体和活性氮中间体反应的组合物。本发明还提供了用于测定过亚硝酸根的相关试剂。本发明还提供了利用这样的组合物和试剂测定样品中过亚硝酸根的相关方法、检测过亚硝酸根的高通量筛选荧光法和筛选化合物的高通量方法，所述化合物能增加或减少过亚硝酸根的产生。文档编号G01N31/22GK101321767SQ200680045462公开日2008年12月10日申请日期2006年8月25日优先权日2005年10月7日发明者D·扬,H·王,J·沈,Z·孙申请人:香港大学