新型枯草杆菌突变株的制作方法

专利名称：：新型枯草杆菌突变株的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新型枯草杆菌(5a"7/MsWrifo)突变株。本发明尤其涉及各种蛋白的分泌生产率提高的新型枯草杆菌突变株。
背景技术：
：枯草杆菌不仅作为革兰氏阳性细菌模型被广泛用于分子生物学研究，而且也作为生产各种酶如淀粉酶和蛋白酶的细菌被广泛用于发酵相关工业、制药工业和类似工业。枯草杆菌基因组的整个核苷酸序列已经由日本和欧洲联合基因组项目(jointJapaneseandEuropeangenomeproject)确定。但枯草杆菌基因组中存在的大约4100个类型的基因的功能鉴定仍然没有完成。迄今已经对具有大约4100个类型的存在于枯草杆菌基因组中的断裂基因的菌株进行了广泛地研究。由此已经提出271个基因对生长是至关重要的(K.Kobayashi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、100、4678-4683、2003)。而且，已经通过使涉及枯草杆菌早期芽孢形成或类似过程的基因或蛋白酶基因、涉及D-丙氨酸添加至细胞壁或细胞膜内的磷壁酸的基因、或涉及表面活性肽(Surfactin)的生物合成或分泌的基因缺失或灭活，构建了各种细菌菌株(参见JP专利公开(Kokai)第58-l卯390A号(1983)、JP专利公开(Kokai)第61-1381A号(1986)、国际专利公开第89/04866号册子、JP专利公开(Kohyo)第ll-50卯96A号(1999)、日本专利第321.0315号、JP专利公开(Kohyo)第2001-527401A号、JP专利公开(Kohyo)第2002-520017A号和JP专利公开(Kohyo)第2001-503641A号)。但这些细菌菌株的蛋白生产率的提高程度不足。而且，迄今关于各种蛋白的生产率提高的枯草杆菌来源突变株或关于这些突变株的广泛分析尚没有获得有用的发现。
发明内容本发明要达到的目的考虑到上述的情况，本发明的目的是通过对来源于枯草杆菌的基因断裂株的广泛分析提供各种酶的生产率优异的新型枯草杆菌突变株。达到目的的方式为达到上述目的，本发明人广泛地分析了通过使枯草杆菌基因组的大区域缺失而获得的突变株，并因此成功地获得了许多各种酶的生产率优异的枯草杆菌突变株。因此完成了本发明。根据本发明的枯草杆菌突变株具有通过使下表1中所示的缺失区域栏中所列举的区域缺失而制备的基因组结构。通过导入编码耙蛋白的基因使得该蛋白可以得以表达，制备这种枯草杆菌突变株，由此获得的枯草杆菌突变株与其中相同基因导入到野生型菌株内的情况相比，具有显著较高的靶蛋白分泌生产率。而且，这种枯草杆菌突变株可以是其中导入有编码靶蛋白的基因的突变株，使得该基因可以得以表达。而且，编码靶蛋白的基因可以含有编码对应于分泌信号的区域的核苷酸序列，或该基因可以适当地连接在含有编码对应于分泌信号的区域的核苷酸序列的DNA上游。在此上述靶蛋白可以是选自纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶的至少一种酶。而且，这种枯草杆菌突变株可以使用枯草杆菌168株作为野生型菌株来制备。而且，如下表1中所列的在缺失区域栏中列举的基因组区域可以含有各自位于形成如下表2中所列的组的寡核苷酸之间的区域。发明效果根据本发明，可以提供具有优异的各种酶的生产率的新型枯草杆菌突变株。通过使用根据本发明的枯草杆菌突变株，不仅可以实现用于以优异的生产率生产各种酶的工业方法，而且也可以提供用于阐明各种酶的生产机制或类似作用的生物学材料。本说明书包括日本专利申请第2005-298406号的说明书和/或附图中所公开内容的部分或全部，该申请是本申请的优先权文件。图1的示意图用于解释从枯草杆菌基因组缺失预定区域的方法的实施例。图2的示意图用于解释从枯草杆菌168株制备枯草杆菌168Aupp株的方法。图3的示意图用于解释经由插入cat-upp盒DNA片段构建重组质粒pBRcatupp的方法。图4是解释制备A缺失靶区:xat-upp株的方法的示意图。图5是解释制备A缺失靶区株的方法的示意图。图6是解释制备△缺失靶区::tet株的方法的示意图。图7的示意图用于解释使用pBRcatuppA缺失靶区在预定的突变株中使缺失靶区缺失的方法。图8的示意图用于解释制备根据本发明的已经从其使多个缺失区域缺失的枯草杆菌突变株的方法。具体实施方式本发明详细地解释如下。根据本发明提供的新型枯草杆菌突变株可以通过从枯草杆菌基因组缺失大的区域而获得。这些枯草杆菌突变株具有提高的靶蛋白或来源于导入其中的克隆基因的多肽的生产率。要被导入其中的基因可以是外源性或内源性的，只要它们能编码蛋白质。基因的例子可以是含有编码对应于分泌信号的区域的核苷酸序列的基因，或可以是适当地连接在含有编码对应于分泌信号的区域的核苷酸序列的其DNA上游的基因。而且，基因的例子可以导入至枯草杆菌突变株的基因组中，或也可以作为表达载体被导入至枯草杆菌突变株中。而且，要被导入其中的这种基因的数量可以是一条或多条。当导入多条基因时，多条基因可以经其排列而导入到一个DNA片段上的系(line)中，或可以作为不同的DNA片段而导入。基因导入技术不受特别限制。可以使用常规已知的转化方法、转导方法和类似方法。要被导入其中的基因的例子包括但不限于，分泌性碱性纤维素酶、分泌性碱性蛋白酶和分泌性碱性淀粉酶。根据本发明的新型枯草杆菌突变株的名称和缺失区域列在表1中。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>此外，表1中所列的缺失区域也可被称为区域，每个区域都位于形成表2中所列组的寡核苷酸之间。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>此外，根据本发明的各个枯草杆菌突变株的例子是具有如下基因组结构的突变株，该基因组结构通过从标准野生型菌株(例如，枯草杆菌168株)的基因组DNA中，除上文定义的缺失区域以外，还使其它区域缺失而制备。该"其它区域"的例子包括排除对生长很重要的基因的基因区域和非编码区。即使将其从基因组中缺失也不会降低进行上述分泌和生产能力的区域是优选的。从枯草杆菌基因组中使表1所列的缺失区域缺失的方法不受具体限定。例如，在此可以应用下文所述并示于图1的方法。具体来说，通过应用两步单交法，使用经由插入缺失用DNA片段而构建的用于缺失的质粒，从枯草杆菌基因组中使表1所列的缺失区域缺失(即通过SOE-PCR法制备(Gene、77、61(1989))。在该方法中使用的缺失用DNA片段是通过将相邻于受试区域(要被缺失的区域)上游的大约0.1-kb至3-kb的片段(称为上游片段)与相邻于其下游的大约O.l-kb至3-kb的片段(称为下游片段)连接而制备的DNA片段。而且，通过将抗药性标记基因片段如氯霉素抗性基因结合在DNA片段的下游或上游制备的DNA片段也可以在此使用。首先，通过第一次PCR制备三个片段受试基因(要进行缺失)的上游片段和下游片段；和如果需要的抗药性标记基因片段。这时，设计引物，其中将受试DNA片段(要进行结合)末端10-至30-碱基对的序列添加到引物上。例如，当上游片段和下游片段以该顺序连接时对应于下游片段的上游侧上的10-30个核苷酸的序列被添加至位于(退火至)上游片段的下游侧上的引物的5'端；对应于上游片段的下游侧上的10-30核苷酸的序列被添加至位于(退火至)下游片段的上游侧上的引物的5，端。当上游片段和下游片段使用由此设计的引物组进行扩增时与下游片段的上游侧对应的区域被添加至由此扩增的上游片段的下游侧；与上游片段的下游侧对应的区域被添加至由此扩增的下游片段的上游侧。接下来，将通过第一次PCR制备的上游片段和下游片段混合。然后使用生成物作为模板，并使用包括位于(退火至)上游片段的上游侧的引物和位于(退火至)下游片段的下游侧的引物的一对引物，进行第二次PCR。通过将上游片段与下游片段以该顺序连接而制备的用于缺失的DNA片段可以通过第二次PCR来扩增。此外，当抗药性标记基因片段与缺失用DNA片段连接时，抗药性标记基因片段通过第一次PCR扩增，以便加入与下游片段的下游侧对应的区域。随后，使用包括位于(退火至)上游片段的上游侧的引物和位于(退火至)抗药性标记基因片段的下游侧的引物的一对引物，进行第二次PCR。因此，通过将上游片段、下游片段和抗药性标记基因片段以该顺序连接而制备的缺失用DNA片段可以得以扩增。而且，将通过以该顺序将上游片段连接至下游片段而制备的缺失用DNA片段通过第二次PCR进行扩增之后，将缺失用DNA片段插入到含有抗药性标记基因的质粒中。然后，可以制备以该顺序具有上游片段、下游片段和抗药性标记基因片段的用于缺失的DNA片段。而且，使用通用限制性内切酶和DNA连接酶，通过将根据上述方法或类似方法得到的缺失用DNA片段插入到在宿主细菌内不被扩增的质粒DNA中，或者插入到很容易出去的质粒DNA(例如，温度敏感质粒)中，构建用于导入缺失的质粒。这种在宿主细菌内不被扩增的质粒DNA的例子包括但不限于，例如，当使用枯草杆菌作为宿主时的pUC18、pUC118和pBR322。随后，通过感受态细胞转化方法(J.Bacterid.93、1925(1967))或类似方法，使用这种用于缺失的质粒，对宿主细菌进行转化。因此，通过在插入在质粒中的上游或下游片段和基因组上同源区之间的单交同源重组，可以获得其中用于缺失的质粒融合在宿主细菌的基因组DNA内的转化体。使用用于导入缺失的质粒的标记基因(如氯霉素抗性基因)的抗药性作为指示，可以对转化体进行选择。在由此获得的转化体的基因组上，要被缺失的抗药性基因的上游和下游区序列冗余性地(redundantly)存在。具体来说，来源于宿主细菌基因组的这些上游和下游区序列和来源于缺失用质粒的相同序列冗余性地存在。在这些上游或下游区当中，通过使同源重组在基因组内在与获得转化体时已经进行过同源重组的区域不同的区域处发生，使得除了来源于缺失用质粒的区域的缺失以外，在基因组上还发生了(要被缺失的)靶基因例如抗药性基因的缺失。用于在基因组内引起同源重组的方法的例子是，例如，涉及诱导感受态的方法(J.Bacteriol.93.1925(1967))。即使在通常培养基中的简单培养中，也通过自发诱导发生同源重组。由于相关抗药性基因的缺失，基因组内已经进行过同源重组的细菌菌株如所预期已经同时丧失了其对药物的抗性。因此，可以从得到的药物敏感性细菌菌株中选择这种进行过同源重组的细菌菌株。从这些细菌菌株中提取基因组DNA，然后可以通过PCR法或类似方法确认耙基因的缺失。当选择耙缺失株时，直接选择由抗药性菌株改变的药物敏感性细菌菌株是困难的。而且，考虑到基因组内发生同源重组的频率低达大约l(T4或更低。因此，需要发明一些方法，例如提高所存在药物敏感性菌株的比例以便有效地获得靶缺失株的方法。用于浓集药物敏感株的方法的例子是利用如下事实的浓集方法基于青霉素的抗生素例如氨节青霉素杀菌性地作用于增殖的细胞，而这些抗生素不作用于未增殖的细胞(MethodsinMolecularGenetics.ColdSpringHarborLabs、(1970))。当进行使用氨苄青霉素或类似物进行浓集时，这对于使对制菌性地作用于宿主细胞的药物(例如四环素或氯霉素)有抗性的基因缺失是有效的。保留有这种抗药性基因的耐药菌株可以生长在含有适量具有制菌作用的相关药物的适当培养基中。缺少抗药性基因的药物敏感株即不增殖也不死亡。在这种条件下，加入适当浓度的基于青霉素的抗生素如氨苄青霉素，然后进行培养。要增殖的耐药株死亡，敏感株保持不受氨苄青霉素或类似物的影响，使得存在的敏感株的比例增加。将适当的琼脂培养基涂有进行过这种浓集过程的培养溶液，然后进行培养。通过影印法(replicamethod)或类似方法，确认已经出现的集落对标记药物存在或不存在抗性。因此，可以有效地选择敏感株。如上所述，可以产生在基因组上具有缺少预定单个区域的基因组结构的枯草杆菌突变株。而且，通过LP(原生质体溶解)转化法，可以产生具有缺少多个区域的基因组结构的枯草杆菌突变株。LP转化法的使用可以参见"T.Akamatsu和J.Sekiguchi、"ArchivesofMicrobiology,"1987、vol.146、p.353-357"和"T.Akamatsu和H.Taguchi、"Bioscience、Biotechnology、andBiochemistry,"2001、vol.65、No.4、p.823-8297"。具体来说，根据LP转化法，提供通过细胞壁溶解获得的原生质体作为受体细菌菌株的感受态细胞的供体DNA。据认为，在此加入的原生质体被渗压震扰破坏，然后，培养溶液中释放的供体DNA并入到受体细菌菌株的感受态细胞中。而且，不像使用通常的转化法，通过使用LP转化法可以大大减少要导入的DNA的损害。通过应用LP转化法，可产生另一枯草杆菌突变株，其具有的基因组结构通过从具有含单个缺失的基因组结构的枯草杆菌突变株缺失多个区域而制备。具体来说，首先，制备具有缺少预定区域(称作第一缺失区域)的基因组结构的枯草杆菌突变株的原生质体。使该原生质体与具有缺少不同区域(第二缺失区域)的基因组结构的枯草杆菌突变株的感受态细胞共存。因此，在具有第一缺失区域的基因组DNA(供体DNA)和具有第二缺失区域的基因组DNA(宿主DNA)之间形成一组跨链交换结构(cross-strandexchangestructure)。该组跨链交换结构在供体DNA中第一缺失区域位于其间的位置处产生。因此供体DNA中的第一缺失区域被导入到宿主DNA中。如上所述，通过应用LP转化法，可以产生具有缺少第一缺失区域和第二缺失区域的基因组结构的枯草杆菌突变株。通过应用该方法，可以产生具有缺少多个区域的基因组结构的枯草杆菌突变株，只要对生长必不可少的基因不被缺失。如上所述生产的根据本发明的枯草杆菌突变株特征在于进行分泌和生产由导入基因所编码的蛋白或多肽的能力比野生标准细菌菌株如枯草杆菌168株要高。使用本发明的枯草杆菌突变株生产的靶蛋白或耙多肽的例子不受具体限定，包括工业用酶或生理学活性肽，其用于与去污剂、食品、纤维、词料、化学产品、药品、诊断和类似方面相关的各种工业领域。特别优选工业用酶。工业用酶的实例包括，当根据功能分类时，氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶/合成酶。其中，使用本发明的枯草杆菌突变株生产的靶蛋白的例子优选地包括水解酶，例如纤维素酶、a-淀粉酶和蛋白酶。例如，在已经导入有纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶基因的枯草杆菌突变株中，从细菌体分泌出的酶的生产量相比较于其中已经导入有相同酶基因的野生标准细菌菌株而显著提高。根据本发明的枯草杆菌突变株中这些酶的分泌生产率可以通过不受限定地应用各种传统的已知技术来测量。例如，纤维素酶的生产率可以如下进行测量。首先，将测试枯草杆菌突变株用具有纤维素酶基因的载体转化。接下来，培养由此获得的转化体，然后通过离心或类似方法去除细菌体，获得培养上清液。例如，将对硝基苯基-P-D-纤维三糖苷(cellotrioside)(SeikagakuCorporation)作为底物加入到每种由此获得的上清液中，然后使反应进行预设的时间。当反应进行时，根据420nm处吸光度(OD420nm)的变化，对产生的对硝基苯酚的量进行定量。因此，可以测量由已经导入到测试枯草杆菌突变株中的纤维素酶基因编码的纤维素酶的生产率。此外，以同样的方式测量标准野生型菌株如枯草杆菌168株的纤维素酶生产率，这样可以将测试枯草杆菌突变株的纤维素酶生产率评价为相对于标准野生型菌株的数值。纤维素酶的例子是属于多糖水解酶类别第5家族的纤维素酶(Biochem.J.、280、309、1991)。在这些纤维素酶中，优选来源于微生物的纤维素酶，尤其是来源于属于芽孢杆菌(5a"7/w)属的细菌的纤维素酶。其更为具体的例子是来源于属于芽孢杆菌属的细菌KSM-S237株(FERMBP-7875)的包括SEQIDNO:116所示的氮基酸序列的碱性纤维素酶；来源于属于芽孢杆菌属的细菌KSM-64株(FERMBP-2886)包括SEQIDNO:118所示的氨基酸序列的碱性纤维素酶；或包括与相关氨基酸序列的同一性为70%、优选80%、更优选90%或更高、进一步优选95%或更高、且特别优选98%或更高的氨基酸序列的纤维素酶。此外，作为氨基酸序列比较的结果，具有SEQIDNO:116所示的氨基酸序列的碱性纤维素酶和具有SEQIDNO:118所示的氨基酸序列的碱性纤维素酶显示出大约92%的同一性。两种纤维素酶都适合作为用于本发明的纤维素酶的具体例子。更优选具有SEQIDNO:116所示的氨基酸序列的碱性纤维素酶。对于这种纤维素酶的生产，在本发明的枯草杆菌突变株当中，更优选使用选自表1中所列举的枯草杆菌突变株MGB653株、MGB683株、MGB781株、MGB723株、MGB773株、MGB822株、MGB834株、MGB846株、MGB872株、MGB885株、MGB913株、MGB860株、MGB874株、MGB887株、NED02021株、NED0400株、NED0600株、NED0803株、NED0804株、NED1100株、NED1200株、NED1400株、NED1500株、NED1901株、NED1902株、NED2201株、NED2202株、NED2402株、NED2500株、NED2602株、NED2702株、NED2802株、NED3000株、NED3200株、NED3303株、NED3701株、NED3800株、NED4000株、NED4001株、NED4002株和NED4100株。例如，蛋白酶的生产率可以如下测量。首先，将测试枯草杆菌突变株用具有蛋白酶基因的载体转化。接下来，培养由此获得的转化体，然后通过离心或类似方法去除细菌体，获得培养上清液。例如，将琥珀酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酸对硝基苯胺(STANAPEPTIDEINSTITUTE、INC.)作为底物加入到每种由此获得的上清液中，然后使反应进行预设的时间。当反应进行时，根据420nm处吸光度(OD420nm)的变化，对产生的对硝基苯胺的量进行定量。因此，可以测量由己经导入到测试枯草杆菌突变株中的蛋白酶基因编码的蛋白酶的生产率。此外，以同样的方式测量标准野生型菌株如枯草杆菌168株的蛋白酶生产率，这样可以将测试枯草杆菌突变株的蛋白酶生产率评价为相对于标准野生型菌株的数值。蛋白酶的具体例子包括来源于微生物的蛋白酶，尤其是来源于属于芽孢杆菌属的细菌的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。蛋白酶更具体的例子包括来源于克劳氏芽孢杆菌(Bac/〃wc/aw^7)KSM-K16株(FERMBP-3376)的包括SEQIDNO:119所示的氨基酸序列的碱性蛋白酶和包括与相关氨基酸序列的同一性为70%、优选80%、更优选90°/。或更高、进一步优选95%或更高、且特别优选98%或更高的氨基酸序列的蛋白酶。对于这种蛋白酶的生产，在本发明的枯草杆菌突变株当中，更优选使用选自下列的枯草杆菌突变株:MGB533株、MGB592株、MGB604株、MGB625株、MGB653株、MGB683株、MGB781株、MGB723株、MGB773株、MGB822株、MGB834株、MGB846株、MGB872株、MGB885株、MGB913株、MGB943株、MGB860株、MGB874株、MGB887株、NED0302株、NED0400株、NED0600株、NED0803株、NED1500株、NED1902株和NED3200株。例如，碱性淀粉酶的生产率可以如下测量。首先，将测试枯草杆菌突变株用具有碱性淀粉酶基因的载体转化。接下来，培养由此获得的转化体，然后通过离心或类似方法去除细菌体，获得培养上清液。然后，例如，使用用于测定淀粉酶活性的试剂盒LiquitechAmyEPS(RocheDiagnostics),可以测定包含在每种上清液中的碱性淀粉酶的活性。因此，可以测量由己经导入到测试枯草杆菌突变株中的碱性淀粉酶基因编码的碱性淀粉酶的生产率。此外，以同样的方式测量标准野生型菌株如枯草杆菌168株的碱性蛋白酶生产率，这样可以将测试枯草杆菌突变株的碱性淀粉酶生产率评价为相对于标准野生型菌株的数值。淀粉酶的具体例子包括来源于微生物的a-淀粉酶。尤其是来源于属于芽孢杆菌属的细菌的液化型淀粉酶。淀粉酶更具体的例子包括来源于属于芽孢杆菌属的KSM-K38株细菌(FERMBP-6946)的包括SEQIDNO:120所示的氨基酸序列的碱性淀粉酶和包括与相关氨基酸序列的同一性为70%、优选80%、更优选90%或更高、进一步优选95%或更高、且特别优选98%或更高的氨基酸序列的淀粉酶。对于这种a-淀粉酶的生产，在本发明的枯草杆菌突变株当中，更优选使用选自下列的枯草杆菌突变株MGB653株、NED0301株、NED0302株、NED0400株、NED0600株、NED0802株、NED0804株、NED0900株、NED1002株、NED1003株、NED1100株、NED1602株、NED2602株、NED2702株、NED3402株、NED3701株和NED3800株。导入到本发明的枯草杆菌突变株中的靶蛋白或多肽的基因，合意地包括一个或多个以正确形式结合在基因上游的控制区(参与基因的转录、翻译和分泌)。具体地，这些区域选自含有启动子和转录起始点的转录起始控制区、含有核糖体结合位点和起始密码子的翻译起始区和分泌信号肽区。尤其是，优选结合包括转录起始控制区、翻译起始控制区和分泌信号区的三个区域。而且，其中分泌信号肽区来源于芽孢杆菌属细菌的纤维素酶基因；转录起始区和翻译起始区包括在位于纤维素酶基因上游0.6-kb至l-kb区域中的三个区域合意地以正确形式与耙蛋白或多肽的基因连接。例如，合意地，JP专利公开(Kokai)第2000-210081A号、JP专利公开(Kokai)第4-190793A号(1992)中所述的来源于芽孢杆菌属细菌的纤维素酶基因的转录起始控制区、翻译起始区和分泌信号肽区和类似区；即KSM-S237株(FERMBP-7875)或KSM-64株(FERMBP-2886)适当地与耙蛋白或多肽的结构基因连接。更具体地，合意地，由SEQIDNO:115所示的核苷酸序列的第1-659号核苷酸范围的核苷酸序列、包括由SEQIDNO:117所示的核苷酸序列的纤维素酶基因的核苷酸第1-696号范围的核苷酸序列、包括与相关核苷酸序列的同一性为70%或更高、优选80%或更高、更优选90%或更高、进一步优选95%或更高、且特别优选98%或更高的核苷酸序列的DNA片段、或者包括通过部分缺失而来源于任意一条上述核苷酸序列的核苷酸序列的DNA片段，合适地与靶蛋白或多肽的结构基因连接。此外，在此，这种包括通过部分缺失而来源于任意一条上述核苷酸序列的核苷酸序列的DNA片段是指缺少一部分相关核苷酸序列但保留了涉及基因转录、翻译和分泌功能的DNA片段。实施例本发明进一步参照实施例进行具体地描述。但本发明的技术范围并不受下列实施例所限制。在实施例中，通过在作为野生型菌株的枯草杆菌168株的基因组上使各个区域缺失，产生突变菌株。此外，关于实施例中使用的各条引物，引物名称、核苷酸序列和SEQIDNO的对应关系列在实施例结尾的表10中。制备缺少多个区域的突变株<制备含有cat-upp盒的upp基因缺陷株>如图2中所示，使用从枯草杆菌168株提取的基因组DNA作为模板，upp-AFW和upp-ARV的引物组以及upp-BFW和upp-BRV的引物组，通过PCR对靠近基因组中upp基因(BG13408;尿嘧啶磷酸核糖基转移酶)上游的l.O-kb片段(al)和靠近其下游的l.O-kb片段(bl)进行扩增。而且，使用质粒pMutinT.3(Microbiology、144、3097、1998)作为模板以及Erm-FW和Erm-RV的引物组，通过PCR制备含有红霉素抗性基因的1.2-kb片段(cl)。此外，使用20nL反应系统和LATaq聚合酶(由TAKARABIOINC.制造)根据所附试验方案进行PCR反应。对于(al)和(bl)的制备，使用50ng枯草杆菌168株基因组(模板DNA)。对于(cl)的制备，将lng质粒DNA、200nM每种上述引物、200uM各个dATP、dTTP、dCTP和dGTP、0.2ULATaq和附带的10x缓冲液混合，获得lx溶液。使用PCR系统(由AppliedBiosystems、GeneAmp9700制造)用于扩增反应，在95'C下进行5分钟热变性；进行25个反应循环，每个循环由95°C15秒、55°C30秒和72°C60秒组成；然后最后在72'C下进行30秒反应，以完成延伸。如上所述获得的三个PCR扩增片段(al)、(bl)和(cl)用Centricon(由MilliporeCorporation制造)纯化，然后将它们(每种0.5pL)混合。进一步加入引物upp-AFW和upp-BRV，在上述PCR条件下将72。C下的反应时间改变为3分钟，然后进行SOE-PCR。作为PCR的结果，得到3.2-kbDNA片段(dl)，其中三个片段以(al)、(cl)和(bl)的顺序连接。使用该DNA片段通过感受态方法(J.Bacterid"81、741、1960)，转化枯草杆菌168株。具体地，在37"C下将枯草杆菌168株在SPI培养基(0.20%硫酸铵、1.40%磷酸氢二钾、0.60%磷酸二氢钾、0.10%柠檬酸三钠二水合物、0.50%葡萄糖、0.02%酪蛋白氨基酸(Difco)、5mM硫酸镁、0.25pM氯化锰和50pg/ml色氨酸)中震荡培养，直至生长度(OD600)达到大约1。震荡培养后，将一部分培养溶液接种至SPII培养基(0.20%硫酸铵、1.40%磷酸氢二钾、0.60%磷酸二氢钾、0.10%柠檬酸三钠二水合物、0.50%葡萄糖、0.01%酪蛋白氨基酸(Difco)、5mM硫酸镁、0.40^iM氯化锰和5pg/ml色氨酸)中，其量比培养溶液高9倍，然后震荡培养，直至生长度(OD600)达到大约0.4。由此，制备枯草杆菌168株的感受态细胞。随后，将含有上述DNA片段(dl)的5溶液(上述SOE-PCR的反应溶液)加入至100[iL由此制备的感受态细胞悬液(SPII培养基的培养溶液)中。在37'C下震荡培养1小时后，用全部量的溶液涂在含有0.5g/mL红霉素的LB琼脂培养基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1。/。NaCl和1.5%琼月旨)上。在37。C下进行静置培养后，分离已经生长的集落作为转化体。从由此获得的转化体提取基因组。使用该基因组作为模板进行PCR，从而确认upp基因从基因组中缺失，并且upp基因用红霉素抗性基因置换。该菌株在本文中命名为168Aupp。此外，以与上述方法相似的方式使用如下所述的感受态法进行转化，不同之处在于所使用的DNA和用于选择转化体的琼脂培养基适当变化。<cat-upp盒DNA片段的构建>如图3中所示，upp基因连接在质粒pSM5022(Mol.Microbiol.6、309、1992)的氯霉素抗性基因(cat)的下游，其转录已经在枯草杆菌中确认，从而确保upp基因和cat基因的转录。具体来说，使用cat-Fw和cat-Rv的引物组，以pSM5022作为模板，通过PCR对含有cat的1.3-kbDNA片段进行扩增。而且，使用引物upp-Fw和upp-RV，以168株基因组作为模板，进行PCR，使得可以获得含有upp基因的l.l-kbDNA片段。接下来，纯化这两个片段，然后通过SOE-PCR连接。从而制备2.4-kbca-upp盒DNA片段(C)，其中upp基因连接在cat基因的下游。而且，该片段插入到质粒pBR322的C/fll切割位点中，从而获得重组质粒pBRcatupp。<制备含有cat-upp盒片段的Pro1区缺陷株>如图4所示，使用Prol-AFW和Prol-ARV的引物组、Prol-BFW和Prol-BRV的引物组和168株的基因组作为模板，通过PCR制备靠近Prol区上游的0.6-kb片段(A)和靠近相同区下游的0.3-kb片段(B)。此外，在图4中，Prol区被标为"缺失靶区"。接下来，使用由此获得的PCR扩增片段(A)和(b)和上述cat-upp盒片段(C)作为模板和引物Prol-AFW和Prol-BRV，进行SOE-PCR，使得三个片段以(A)、(C)和(B)的顺序连接。使用由此获得的DNA片段(D)，通过感受态方法对实施例2中所述的168Aupp株进行转化。分离出能够在含有10ppm氯霉素的LB琼脂培养基中生长的转化体。作为PCR的结果，确认在由此获得的转化体中，Prol区已经从基因组中缺失，并被cat-upp盒DNA片段置换。而且，将该转化体在补充有各种浓度5FU(由Sigma-AldrichCorporation制造)的Cg+葡萄糖琼脂培养基(7%磷酸氢二钾、3%磷酸二氢钾、0.5%柠檬酸钠、1%硫酸铵、0.1%硫酸镁、0.05%谷氨酸、0.5%葡萄糖、10ng/mLL-色氨酸、0.55pg/mL氯化,丐、0.17pg/mL氯化锌、43ng/mL氯化铜二水合物、60ng/mL氯化钴六水合物、60ng/mL钼酸钠(IV)二水合物和1.5%琼脂)中培养。在补充有0.5pg/mL或更高浓度5FU的培养基上没有观察到生长。另一方面，在相同条件下，甚至在补充有5吗/mL5FU的培养基上观察到转化体亲株168Aupp株的生长。基于上述结果，推断导入到转化体中的upp基因己经通过从cat基因启动子的转录而得到表达，使得转化体变得对5FU敏感。由此获得的菌株被命名为AProl::cat-upp菌株。此外，在图4中，AProl::cat-upp株被标为A缺失靶区::cat-upp株。〈从Pro1区缺陷株缺失cat-upp盒片段(C)>如图5中所示，使用八Prol::cat-upp株基因组作为模板、Prol-AFW和Prol-ERV的引物组和Prol-FFW和Prol-BRV的引物组，扩增靠近cat-upp盒片段(C)上游的0.6-kb片段(E)和靠近相同片段下游的0.3-kb片段(F)。而且，使用由此获得的两个DNA片段作为模板以及Prol-AFW和Prol-BRV的引物组进行SOE-PCR，从而制备其中两个片段相互连接的0.9-kb片段(G)。上述AProl::cat-upp株通过感受态方法使用片段(G)进行转化。因此，获得能够在补充有1i^g/mL5FU的Cg+葡萄糖琼脂培养基中生长的菌株。确认由此获得的菌株对氯霉素易感，以及在基因组上缺少Prol区和cat-upp盒DNA片段。该菌株命名为AProl株。此外，在图5中，AProl::cat-upp株和AProl株被分别标为"A缺失靶区::cat-upp株"和"A缺失靶区株"。<单区缺陷株的制备1>根据上述制备AProl株的方法，通过图4中所解释的方法，制备APro2::cat-upp株、APro3::cat画upp株、APro4::cat-upp株、APro5::cat隱upp株、APro6::cat画upp株、APro7::cat-upp株、APBSX::cat-upp株、ASP卩:cat画upp株、ASKIN::cat-upp株、Apks::cat-upp株禾口Apps::cat-upp株。而且，通过图5中所解释的方法，制备APro2株、APro3株、APro4株、APro5株、APro6株、APro7株、APBSX株、ASP卩株、ASKIN株、Apks株和Apps株。制备这些各个菌株的步骤中用于扩增片段(A)至(G)的引物组列在下面的表3中。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><多缺陷株(MGB01株至MGB07株)的构建>接下来，使用APro7株(也称为MGB01株)，构建了缺少多个区的菌株(多缺陷株)。首先，如下构建缺少Pro6和Pro7区域的双缺陷株。具体地，使用APro6::cat-upp株的基因组DNA通过感受态法转化APro7株，在上述APro6::cat-upp株中Pro6区己经被cat-upp盒片段置换。将已经在含有10ppm氯霉素的LB琼脂培养基上生长的集落分离作为转化体。接下来，将由此得到的氯霉素抗性转化体使用APro6株的基因组DNA通过感受态法进行转化。由此，获得能够在补充有l吗/mL5FU的Cg+葡萄糖琼脂培养基中生长的菌株。确认由此获得的菌株对氯霉素易感，并缺少Pro6和Pro7区。而且，分离出缺少cat-upp盒片段的双缺陷株。该菌株命名为MGB02株。重复类似过程，从而构建MGB03株，在该菌株中Pro7区、Pro6区和Prol区已经以该顺序被缺失。重复类似过程，从而构建MGB04株，在该菌株中Pro7区、Pro6区、Prol区和Pro4区已经以该顺序被缺失。重复类似过程，从而构建MGB05株，在该菌株中Pro7区、Pro6区、Prol区、Pro4区和PBSX区已经以该顺序被缺失。重复类似过程，从而构建MGB06株，在该菌株中Pro7区、Pro6区、Prol区、Pro4区、PBSX区和ProS区已经以该顺序被缺失。重复类似过程，从而构建MGB07株，在该菌株中Pro7区、Pro6区、Prol区、Pro4区、PBSX区、Pro5区和Pro3区已经以该顺序被缺失。<各种单区缺陷株的制备例2>使用与上述<单区缺陷株的制备1>所用方法不同的方法，构建SP卩区缺陷株、pks区缺陷株、SKIN区缺陷株、pps区缺陷株、Pro2区缺陷株、Pro5区缺陷株、NED0302区缺陷(ydcL-ydhU区缺陷)株、NED0803区缺陷(yisB-yitD区缺陷)株、NED3200区缺陷(yunA-yurt区缺陷)株、NED1902区缺陷(cgeE-ypmQ区缺陷)株、NED0501区缺陷(yeeK-yesX区缺陷)株、NED0400区缺陷(ydiM-yebA区缺陷)株、NED1100区(ykuS-ykqB区)缺陷株、NED4002区缺陷(pdp-rocR区缺陷)株、NED02021区缺陷(ycxB-sipU区缺陷)株、SKIN-Pro7区缺陷(spoIVCB-yraK区缺陷)株、NED3701区缺陷(sbo-ywhH区缺陷)株、NED0600区缺陷(cspB-yhcT区缺陷)株、NED4100区缺陷(yybP-yyaJ区缺陷)株、NED2702区缺陷(ytxK-braB区缺陷)株和NED1602区缺陷(yncM-fosB区缺陷)株。构建单独缺少SPP区的菌株的实例描述如下。如图6中所示，使用spB-AFW和spB-ARV2的引物组、spB-BFW2和spB-BRV的引物组，以及168株基因组作为模板，通过PCR制备靠近SP(3区上游的0.6-kb片段(H)和靠近该区下游的0.3-kb片段(1)。另外，在图6中，SPP被标为"缺失靶区"。使用tet-FW和tet-RV的引物组对四环素抗性基因区片段(J)进行扩增。随后，使用由此获得的PCR扩增片段(H)、(I)和(J)作为模板，使用引物spB-AFW和spB-BRV进行SOE-PCR，使得这三个片段以(H)、(J)和(I)的顺序连接。使用由此获得的DNA片段(K)通过感受态法转化上述的168Aupp株。由此，分离出能够在含有15ppm四环素的LB琼脂培养基中生长的转化体。根据PCR的结果，确认在由此获得的转化体中，SPp区已经从基因组中被缺失，并被四环素抗性基因片段置换。该菌株被称为ASP(3::tet株。另夕卜，在图6中，ASP卩::tet株被标为"A缺失靶区::tet株"。类似地，制备各个缺少上述区域的菌株。每种由此制备的菌株都以与ASP(3::tet株相同的方式被称为"A缺失靶区::tet株"。<从MGB07株缺失SP|3区〉使用上面制备的ASPP::tet株的基因组DNA转化APro7株，获得四环素抗性的MGB07ASPP::tet株。同时，如下所述从基因组中去除四环素抗性基因片段。如图7中所示，使用spB-AFW和spB-ERV的引物组以及spB-FFW和spB-BRV的引物组，以168株基因组作为模板，通过PCR制备靠近SP(3区上游的0.6-kb片段(L)和靠近该区下游的0.3-kb片段(M)。另外，在图7中，SP(3被标为"缺失靶区"。随后，使用由此获得的PCR扩增片段(L)和(M)作为模板以及引物spB-AFW和spB-BRV进行SOE-PCR，使两个片段以(L)和(M)的顺序连接。将由此获得的DNA片段(N)插入至上述pBRcatupp的坚H。"I限制性内切酶位点(切割后平端(blunt-endedaftercleavage))，从而构建用于去除四环素抗性基因片段的质粒pBRcatuppASP卩。另外，在图7中，pBRcatuppASP卩被标为"pBRcatuppA缺失耙区"。用构建的pBRcatuppASPp转化MGB07ASPP::tet株。质粒上SP卩的上游或下游区和基因组上SPp的上游或下游区之间发生单交换重组，使得该质粒被导入至基因组上，并获得表现出氯霉素抗性的MGB07ASP(3(pBR)株。将由此获得的转化体MGB07ASPP(pBR)株接种在50mL含有1.5jig/mL四环素的LB培养基(500-mLSakaguchi瓶)中，至达到OD600=0.3，然后在37'C下震荡培养。震荡培养l小时后，加入15mg氨苄青霉素(300pg/mL)，然后继续培养，同时在加入后每2小时添加15mg氨苄青霉素。培养8.5小时后，将培养溶液用2%氯化钠水溶液洗涤，然后将无药物的LB琼脂培养基涂以该溶液。在已生长的集落当中，选择对氯霉素易感并缺失了质粒区的集落。使用所选择的细菌菌株的基因组DNA作为模板进行PCR，从而确认了SP(3区和四环素抗性基因片段的缺失。由此，获得MGB08株。〈从MGB08株缺失pks区和Pro5区的回复(reversion)>根据上述方法(图7)，使用Apks::tet株从上面制备的MGB08株中缺失pks区。通过从MGB08株中缺失pks区制备的菌株被命名为MGB09株。通过PCR确认由此获得的MGB09株的基因组DNA。pks区已经被缺失，但证实在基因组上存在有位置靠近pks区的Pro5区内的序列，表明有Pro5区的回复。这可能由下列原因造成当使用Apks::tet株的基因组DNA转化MGB08株时，在Apks::tet株基因组上pks区的上游区和该基因组上Pro5区的下游区；以及MGB08株基因组上的相应区域之间发生了同源重组，同时导入有四环素抗性基因并且缺失了pks区。<从MGB09株缺失SKIN区和Pro7区的回复>根据上述方法(图7)，使用ASKIN::tet株从上面制备的MGB09株中缺失SKIN区。通过从MGB09株中缺失SKIN区制备的菌株被命名为MGB10株。通过PCR确认由此获得的MGB10株的基因组DNA。SKIN区已经被缺失，但证实在基因组上存在有位置靠近SKIN区的Pro7区内的序列，表明有Pro7区的回复。这可能由下列原因造成当使用ASKIN::tet株的基因组DNA转化MGB09株时，在ASKIN::tet株基因组上SKIN区的上游区和该基因组上Pro7区的下游区；以及MGB09株基因组上的相应区域之间发生了同源重组，同时导入有四环素抗性基因并且缺失了SKIN区。<从MGB10株缺失pps区>根据上述方法(图7)使用Apps::tet株从上面制备的MGB10株中缺失pps区。通过从MGB10株中缺失pps区制备的菌株被命名为MGB11株。通过PCR确认由此获得的MGBll株的基因组DNA，pps区已经被缺失，没有其它区的回复。<从MGB11株缺失Pro2区>根据上述方法(图7)使用APro2::tet株从上面制备的MGB11株中缺失Pro2区。通过从MGBll株中缺失Pro2区制备的菌株被命名为MGB12株。通过PCR确认由此获得的MGB12株的基因组DNA，Pro2区已经被缺失，没有其它区的回复。<从MGB12株缺失Pro5区>为了再次缺失在制备MGB09株时经历回复的Pro5区，根据上述方法(图7)使用APro5::tet株从上面制备的MGB12株中缺失Pro5区。通过从MGB12株中缺失Pro5区制备的菌株被命名为MGBlld株。通过PCR确认由此获得的MGBlld株的基因组DNA，Pro5区已经被缺失，没有其它区的回复。如上所述制备的MGBlld株具有的基因组结构中已经缺失了枯草杆菌168株的Pro6(yoaV-yobO)区、Prol(ybbU-ybdE)区、Pro4(yjcM國yjdJ)区、PBSX(ykdA-xlyA)区、Pro5(ynxB-dut)区、Pro3(ydiM國ydjC)区、SP卩(yodU画ypqP)区、pks(pksA-ymaC)区、SKIN(spoIVCB-spoIIIC)区、pps(ppsE-ppsA)区和Pro2(ydcL國ydeJ)区。<构建根据本发明的枯草杆菌突变株>从如上所述制备的MGBlld株制备根据本发明的枯草杆菌突变株(见图8)。具体地，根据上述方法(图7)使用ANED0302::tet株从MGBlld株缺失NED0302区。通过从MGBlld株缺失NED0302区制备的菌株被命名为MGB533株。由此获得的MGB533株具有的基因组结构中，除MGBlld株中的缺失区以外，还已经缺失了NED0302区。随后，以下列的顺序缺失NED0803区、NED3200区、NED1902区、NED0501区、NED0400区、NED1100区和NED4002区，从而构建突变株。由此构建的突变株分别命名为MGB559株、MGB592株、MGB604株、MGB625株、MGB653株、MGB683株和MGB781株。此夕卜，NED3200区含有Pro2区。在构建MGB592株时ydeK-ydhU区实际上已经从MGB559株中被缺失。而且，NED1902区含有SPP区。在构建MGB604株时实际上已经从MGB592株中缺失的区域是cgeE-phy和yppQ-ypmQ区。类似地，NED0400区含有Pro3区。在构建MGB653株时gutR-yebA区实际上已经从MGB625株中被缺失。接下来，根据上述方法(图7)使用ANED40002::tet株从构建的MGB625株中缺失NED40002区。通过从MGB625株中缺失NED40002区制备的菌株被命名为MGB723株。随后，以下列顺序缺失NED02021区、SKIN-Pro7区、NED3701区、NED0600区、NED4100区、NED2702区、NED0400区和NED1100区，从而构建突变株。由此构建的突变株分别命名为MGB773株、MGB822株、MGB834株、MGB846株、MGB872株、MGB885株、MGB913株和MGB943株。另夕卜，SKIN-Pro7区含有SKIN区。在构建MGB822株时yrkS-yraK区实际上已经从MGB773株中被缺失。类似地，在构建MGB913株时gutR-yebA区实际上己经从MGB885株中被缺失。接下来，根据上述方法(图7)使用ANED4100::tet株从构建的MGB834株中缺失NED4100区。通过从MGB834株中缺失NED4100区制备的菌株被命名为MGB860株。随后，通过以下列顺序缺失NED1602区和NED2702区构建突变株。由此构建的突变株分别命名为MGB874株和MGB887株。在制备这些菌株中每一个的步骤中用于扩增片段(H)至(N)的引物组列在下表4中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>[实施例2]各自缺少单个区域的突变株在该实施例中，枯草杆菌168株的各个特定区域用cat-upp盒或氯霉素抗性基因置换，从而制备各个缺少特定区域的突变株。<通过用cat-upp盒置换构建单区域缺陷株>用cat-upp盒进行置换的区域列在下表5中。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>另外，NEDO100区含有Pro1区。MED0302区含有Pro2区，NED1500区含有沐s区，NED1802区含有Pro6区，NED2500区含有SKIN-Pro7区。在该实施例中，根据图4中所述的方法，通过用实施例1中制备的cat-upp盒片段置换特定区域而构建突变株。而且，在该实施例中，图4中的片段(A)、片段(B)、片段(C)和(D)分别称为片段(O)、片段(P)、片段(Q)和片段(R)。在制备这些菌株的每一个的步骤中用于扩增片段(P)至(R)的引物组列在下表6中。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>200680045245.X转溢齿被31/42:K<通过用氯霉素抗性基因置换构建单区域缺陷株>通过用四环素抗性基因置换靶区，然后用氯霉素抗性基因置换四环素抗性基因的中央部分，从而进行用氯霉素抗性基因对区域的置换。用氯霉素抗性基因进行置换的区域列在下表7中。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>另夕卜，NED0400区含有Pro3区，NED1002区含有Pro4区，NED1003区含有PBSX区，NED1902区含有SP卩区。首先，缺失NED0301区的方法解释如下。使用NED0301-AFW和NED0301-ARV的引物组、NED0301-BFW和NED0301-BRV的引物组，以168株基因组作为模板，通过PCR扩增靠近NED0301区上游的0.6-kb片段(S)和靠近该区下游的0.3-kb片段(T)。而且，使用tet-FW和tet-RV的引物组扩增四环素抗性基因区片段(U)。随后，使用由此获得的PCR扩增片段(S)、(T)和(U)作为模板，使用引物NED0301-AFW和NED0301-BRV进行SOE-PCR。由此，获得的片段(V)中，三个片段以(S)、(U)和(T)的顺序连接。使用由此获得的片段(V)通过感受态法转化实施例1中制备的168Aupp株。分离出能够在含有15ppm四环素的LB琼脂培养基中生长的转化体。根据PCR的结果，确认在由此获得的转化体中，NED0301区己经从基因组中被缺失，并被四环素抗性基因片段置换。接下来，使用tet-FW和tet-ARV的引物组和tet-BFW和tet-RV的引物组扩增四环素抗性基因上游侧上的0.5-kb片段(W)和该基因下游侧上的0.5-kb片段(X)。而且，使用质粒pSM5022(在实施例1中使用)作为模板，使用cat-FW和cat-RV扩增含有氯霉素抗性基因的1.3-kb片段(Y)。随后，使用由此获得的PCR扩增片段(W)、(X)和(Y)作为模板，使用引物tet-FW和tet-RV进行SOE-PCR。由此，获得片段(Z)，其中三个片段以(W)、(Y)和(X)的顺序连接。使用由此获得的片段(Z)通过感受态法转化上述四环素抗性株。因此，分离出能够在含有10ppm氯霉素的LB琼脂培养基上生长的转化体。根据PCR的结果，确认在由此获得的转化体中，一部分四环素抗性基因已经被缺失，并被氯霉素抗性基因置换。缺少NED0301区的菌株被命名为NED0301株。类似地，制备缺少表7所列区域的各个突变株。每个由此制备的菌株以与NED0301株相同的方式命名。在制备每个这些菌株的步骤中用于扩增片段(S)至(V)的引物组列在下表8中。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>在实施例3中，评价在实施例1和2中制备的根据本发明的枯草杆菌突变株的分泌生产率。在该实施例中，使用碱性纤维素酶、碱性蛋白酶和碱性淀粉酶作为要导入进枯草杆菌突变株中的靶蛋白。<分泌和产生碱性纤维素酶的评价>如下所述进行碱性纤维素酶的分泌生产率的评价。具体地，将重组质粒pHY-S237通过原生质体转化法导入每个细菌菌株，在上述重组质粒中来源于芽孢杆菌属KSM-S237株(FERMBP-7875)的碱性纤维素酶基因(JP专利公开(Kokai)第2000-210081A号)片段(3.1kb)已经插入到穿梭载体pHY300PLK的I限制性内切酶切割位点中。将每种由此获得的重组细菌菌株在37'C下在10mLLB培养基中震荡培养过夜。而且，将0.05mL培养溶液接种在50mL2xL-麦芽糖培养基(2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、l%NaCl、7.5%麦芽糖、7.5ppm硫酸锰4-5水合物和15ppm四环素)中，然后在3(TC下震荡培养3天。通过离心从培养溶液的上清液中去除菌体。测定每种此上清液中的碱性纤维素酶活性，从而获得已经通过培养而分泌并在菌体外产生的碱性纤维素酶的量。纤维素酶活性测定如下。加入500.4mM对硝基苯基-(3-D-纤维三糖苷(SeikagakuCorporation),然后与50已用1〃.5M磷酸盐缓冲溶液(pH7.4WakoPureChemicalIndustries、Ltd.)适当稀释的样品溶液混合，在3(TC下反应。基于420nm处测量的吸光度(OD420nm)变化对反应释放的对硝基苯酚的量进行定量。使得每分钟释放1!imol对硝基苯酚的酶量确定为1U。<分泌和产生碱性蛋白酶的评价>如下所述进行碱性蛋白酶的分泌生产率的评价。具体地，使用从克劳氏芽孢杆菌KSM-K16株(FERMBP-3376)提取的基因组DNA作为模板，使用S237pKAPpp-F和KAPter-R(BglII)的引物组进行PCR。由此，扩增编码具有氨基酸序列的碱性蛋白酶(Appl.Microbiol.Biotechnol.、43、473，(1995))的1.3-kbDNA片段。而且，使用从(芽孢杆菌属)KSM-S237株(FERMBP-7875)提取的基因组DNA作为模板，使用S237ppp-F2(&mHI)和S237pKAPpp-R的引物组进行PCR。扩增含有碱性纤维素酶基因启动子区的0.6-kbDNA片段(JP专利公开(Kokai)第2000-210081A号)。随后，使用两种由此获得的片段的混合物作为模板，使用S237ppp-F2(BamHI)和KAPter-RII)的引物组进行SOE-PCR。由此，获得1.8-kbDNA片段，其中碱性蛋白酶基因连接在碱性纤维素酶基因启动子区的下游。将由此获得的1.8-kbDNA片段插入到穿梭载体pHY300PLK(YakultHonshaCo.、Ltd.)的万amHI-Sg/II限制性内切酶切割位点，从而构建用于评价碱性蛋白酶生产率的质粒pHYKAP(S237p)。将由此构建的质粒pHYKAP(S237p)通过原生质体转化法导入各个细菌菌株。将由此获得的重组细菌菌株在与上文<分泌和产生碱性纤维素酶的评价>中所用条件相同的条件下震荡培养3天。培养后，通过离心从培养溶液的上清液中去除菌体。测定上清液中的碱性蛋白酶活性。获得通过培养已经分泌并在菌体外产生的碱性蛋白酶的量。培养上清液中的蛋白酶活性测定如下。具体地，将100^iL含有7.5mM琥珀酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酸对硝基苯胺(STANAPEPTIDEINSTITUTE、INC.)作为底物的75mM硼酸-KCl缓冲溶液(pH10.5)加入到50jul已经用2mMCaCl2溶液适当稀释的培养上清液中并与其混合，然后在3(TC下反应。基于420nm处测量的吸光度(OD420nm)的变化，对由反应所释放的对硝基苯胺的量进行定量。使得每分钟释放1pmol对硝基苯胺的酶量确定为1U。<分泌和产生碱性淀粉酶的评价>如下评价碱性淀粉酶的分泌生产率。具体地，使用从芽孢杆菌属KSM-K38株(FERMBP-6946)提取的基因组DNA作为模板，使用K38matu-F2(ALAA)和SP64K38-RC^aI)的引物组进行PCR，从而扩增编码碱性淀粉酶(Appl.Environ.Microbiol..67、1744，(2001))的1.5-kbDNA片段。而且，使用从芽孢杆菌属KSM-S237株(FERMBP-7875)提取的基因组DNA作为模板，以及S237ppp-F2(SamHI)和S237ppp-R2(ALAA)的引物组进行PCR，从而扩增含有启动子区和编码碱性纤维素酶基因分泌信号序列的区域的0.6-kbDNA片段(JP专利公开(Kokai)第2000-210081A号)。随后，使用将由此获得的两种片段混合而获得的混合物作为模板，以及S237ppp-F2(B"mHI)和SP64K38-RCaal)的引物组进行SOE-PCR。由此，获得2.1-kbDNA片段，其中碱性淀粉酶基因连接在启动子和编码碱性纤维素酶基因分泌信号序列的区域的下游。将由此获得的2.1-kbDNA片段插入至穿梭载体pHY300PLK(YakultHonshaCo.、Ltd.)的BamHI限制性内切酶切割位点，从而构建用于评价碱性淀粉酶生产率的质粒pHYK38(S237ps)。将由此构建的质粒pHYK38(S237ps)通过原生质体转化法导入各个细菌菌株。将由此获得的重组细菌菌株在与上文<分泌和产生碱性纤维素酶的评价>中所用条件相同的条件下震荡培养5天。培养后，通过离心从培养溶液的上清液中去除菌体。测定上清液中的碱性淀粉酶活性，从而得到通过培养已经分泌并在菌体外产生的碱性淀粉酶的量。使用LiquitechAmyEPS(RocheDiagnostics)测定培养上清液中的淀粉酶活性。具体地，将100^iLRLR2混合物(Rl(连接酶)R2(淀粉酶底物)=5:1(Vol.))加入到50pl已经用1。/。NaCl-l/7.5M磷酸盐缓冲溶液(pH7.4;WakoPureChemicalIndustries、Ltd.)适当稀释的样品溶液中并与其混合，然后在3(TC下反应。基于405nm处测量的吸光度(OD405nm)的变化，对由反应所释放的对硝基苯酚的量进行定量。使得每分钟释放1^imol对硝基苯酚的酶量确定为1U。<结果>分泌和产生碱性纤维素酶、碱性蛋白酶和碱性淀粉酶的能力总结在表9中。另外，在表9中，分泌和产生每种酶的能力表示成相对于标有数值100的相关酶的量(由其中类似地导入有各个基因的枯草杆菌168株所产生)的相对值。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表10<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>序列表本文引用的所有出版物、专利和专利申请均全文并入作为参考。权利要求1.一种枯草杆菌(Bacillussubtilis)突变株，其具有通过使表1所示的缺失区域栏中列举的区域缺失而制备的基因组结构；表1<tablesid="tabl0001"num="0001"></tables><tablesid="tabl0002"num="0002"></tables><tablesid="tabl0003"num="0003"></tables><tablesid="tabl0004"num="0004"></tables><tablesid="tabl0005"num="0005"></tables><tablesid="tabl0006"num="0006"></tables>2.根据权利要求1所述的枯草杆菌突变株，其中，当其中导入有编码耙蛋白的基因使得所述基因得以表达时，与相同基因导入野生株的情况相比，靶蛋白的分泌生产率显著提高。3.根据权利要求1或2所述的枯草杆菌突变株，其中导入有编码耙蛋白的基因，使得所述基因得以表达。4.根据权利要求2或3所述的枯草杆菌突变株，其中所述编码靶蛋白的基因含有编码对应于分泌信号的区域的核苷酸序列，或者所述基因适当地连接在含有编码对应于分泌信号的区域的核苷酸序列的DNA上游。5.根据权利要求2-4中任意一项所述的枯草杆菌突变株，其中所述耙蛋白是选自纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶的至少一种酶。6.根据权利要求1-5中任意一项所述的枯草杆菌突变株，其中所述野生株是枯草杆菌168株。7.根据权利要求1-6中任意一项所述的枯草杆菌突变株，其中在表1中的缺失区域栏所述的基因组区域含有位于形成表2中的组的寡核苷酸之间的区域。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>全文摘要通过对来源于枯草杆菌的经基因破坏的菌株进行广泛的分析，本发明提供了各种酶的生产率非常优异的新型枯草杆菌突变株。根据本发明的枯草杆菌突变株具有通过使缺失区域栏中列举的区域缺失而制备的基因组结构。当导入有编码这些分泌性靶蛋白的基因使其得以表达时，与相同基因导入野生株的情况相比，这些枯草杆菌突变株的每种表现出的蛋白分泌生产率均有显著提高。文档编号C12N1/21GK101321866SQ20068004524公开日2008年12月10日申请日期2006年9月25日优先权日2005年10月13日发明者东畑正敏,小笠原直毅,荒胜俊,远藤圭二,门屋亨介申请人:花王株式会社;国立大学法人奈良先端科学技术大学院大学