感染性丙型肝炎病毒颗粒高效生产体系的制作方法

专利名称：感染性丙型肝炎病毒颗粒高效生产体系的制作方法
技术领域：
本发明涉及感染性人丙型肝炎病毒颗粒的高效生产方法。
背景技术：
人丙型肝炎病毒(HCV)是通过持续性地感染引发慢性肝炎的单链 RNA病毒。目前，在世界范围得到承认的慢性肝炎的主要原因是HCV 持续感染。实际上，持续感染者的50%左右均患慢性肝炎，其中约20% 的患者经过10年 20年转化为肝硬化，并且其中一部分进展为肝癌这样 的致死病态。
妨碍上述重大疾病治疗方法的开发研究的主要原因在于没有在 HCV增殖方面高效的细胞培养体系；没有适当的HCV感染的小动物模 型；低水平的病毒复制；以及病毒基因组的遗传异质性。
因此，期待细胞培养系中的HCV基因组的复制系统的开发，以了 解病毒的复制、病毒与细胞的相互作用，提供由HCV引发的疾病治疗 药的评价体系。
最近，作为来自HCV的具有自主复制能力的RNA,制作了 HCV 亚基因组RNA复制子(专利文献1、专利文献2和非专利文献1-3),使 用培养细胞分析HCV的复制机理成为可能。这些HCV亚基因组RNA 复制子是将存在于HCV基因组RNA的5'非翻译区中的HCV IRES的下 游的结构蛋白用新霉素抗性基因和与其下游连接的EMCV-IRES置换所 得。将该RNA复制子导入到人肝癌细胞Huh7中，在新霉素的存在下进 行培养，则可证明在Huh7细胞内RNA复制子自主复制。但是，该实验 体系是只能对HCV病毒增殖复制过程中的病毒RNA复制进行评价的实 验体系，不产生病毒颗粒，因此无法对HCV颗粒在感染细胞内的形成 和向细胞外的释放、还有对新的细胞的感染的过程进行评价。
针对该课题，有人报道了通过培养细胞系生产病毒颗粒的方法。这 是不使用RNA复制子而利用HCV全基因组RNA的cDNA的系统。
Lim等人尝试将在四环素应答启动子的下游连接基因型lb的 HCV-S1抹基因组RNA的cDNA得到的表达载体导入Huh7细胞中，将所得细胞抹用四环素进行处理，尝试生产HCV颗粒。他们确认了在该 培养上清中有1 6xl()S拷贝/mL的HCV颗粒存在，但记载该HCV颗粒 的感染性低(非专利文献4)。
但是，使HCV cDNA在CMV等RNA聚合酶II型启动子控制下表 达，则在被转录的RNA的5，末端附加有帽结构，3'末端附加有PolyA 链，因此在核糖体被利用作蛋白质合成的模板，所转录的RNA不会发 生复制。
为解决该问题，Heller等人制备了下述构成在HCV基因组的5， 末端和3'末端连接核酶序列，在细胞内用RNA聚合酶II进行转录，然 后用核酶切断，由此可在细胞内合成未附加帽和PolyA的HCVRNA(非 专利文献5)。通过核酶使5'末端不附加帽的方法可用于在细胞内合成发 夹型RNA的方法(非专利文献6)。实际上，将具有由两个核酶夹持的 HCV构成的表达栽体在Huh7中表达，显示由此生成lxlO卩拷贝/mL的 HCV颗粒。但对于该颗粒是否具有感染性则未进行研究。
并且最近的研究显示可由HCV全基因组RNA在细胞培养体系生 产具有感染能力的HCV颗粒(专利文献3、非专利文献7、非专利文献 8)。该系统的HCV颗粒的生产量约为lxiO 拷贝/mL。另夕卜，对于将HCV 的基因型lb的conl林非结构蛋白区置换为基因型2a的病毒抹的基因所 得的嵌合病毒RNA，显示可通过细胞培养体系生产具有感染能力的 HCV颗粒(非专利文献9)。并未公开该体系的HCV颗粒生产量的具体数 值。
由以上结果可知，可以建立对HCV颗粒在感染细胞内的形成、向 细胞外的释放、以及进一 步感染新的细胞的过程进行评价的实验体系。
但是，Lim等人的体系产率低、Heller等人的体系的感染性不明确， 在使用HCV全基因组RNA的体系中，可能在RNA复制时发生变异。 已知如果HCV基因组发生变异，则可能不再发生复制。实际上已显示 如果HCV非结构蛋白NS5B蛋白质中的GDD氨基酸序列变异为GND, 则不再发生复制。另一方面，关于HCV颗粒的生产量，两者均为约lx107 拷贝/mL,人们期待能够更进一步提高生产量。
作为提高HCV病毒颗粒生产量的方法，研究了制做复制子生产量 高的细胞。HCV病毒的复制中使用来自人肝脏的Huh7细胞，由该抹派 生的细胞有几种克隆。其中，命名为Huh7.5的细胞显示可复制亲林约3倍的HCVRNA复制子(非专利文献10)。
鉴于以上状况，可以想象使用HCV全基因组RNA的cDNA开发感 染性HCV颗粒的高效生产体系是很重要的。
使用与RNA病毒的基因组RNA对应的cDNA生产病毒颗粒的体系 已知有使用在流感病毒(负链的RNA病毒)动物细胞系内生产中所使用 的RNA聚合酶I启动子和终止子的体系(非专利文献11)。但是，上述的 使用RNA聚合酶I启动子和终止子的流感病毒颗粒的生产体系;f艮难说 在生产量方面比以往的流感病毒颗粒生产体系更优异。另外，非专利文 献11中对于作为正链RNA病毒的HCV生产体系没有任何记载。
专利文献1:日本特开2001-17187号公报
专利文献2: WO2004/104198A1
专利文献3: WO05080575A1
非专利文献1: Blight等人.，Science, 290 (2000) 1972-1974页 非专利文献2: FrieBe等人.,J. Virol.,75 (2001) 12047-12057页 非专利文献3: Kato, T.等人.gastroenterology, 125(2003) 1808-1817
页
非专利文献4: Lim SP.等人.，Virology., 303 (2002) 79-99页 非专利文献5:Heller， T.等人.Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 102 (2005) 2579-83页
非专利文献6: Sinagawa， T.和Ishii, S., Gene Dev., 17 (2003) 1340-45
页
非专利文献7: Wakita等人，Nature Med. 11 (2005) 791-96页 非专利文献8: Lindenbach BD.等人.，Science. 309 (2005) 623-26页 非专利文献9: Pietschmann T.等人.，11th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses, (2004)
非专利文献10: Blight, KJ.等人.，J. Virol., 76 (2002) 13001-14页 非专利文献11: Neumann, G.等人.，Virology, 202 (1994) 477-479页

发明内容
本发明的目的在于提供在培养细胞系中由重组DNA高效生产感染 性丙型肝炎病毒颗粒的方法。
本发明人为了构建在细胞内由HCV基因组cDNA合成具有复制能力的HCV基因组RNA的方法，对基因型不同的HCV基因组、用于使 其表达的启动子/终止子进行了研究，发现了复制HCV基因组RNA的新 型的组合。接着，培养了合成该HCV基因组RNA的细胞，确认可比以 往报道的产率高地生产感染性HCV颗粒，从而完成了本发明。 即，本发明涉及以下的(a) (c)。
(a) 生产感染性HCV颗粒的方法，该方法是生产感染性丙型肝炎病 毒(HCV)颗粒的方法，该方法包含以下步骤将含有下述DNA的表达载 体导入可接受HCV增殖的细胞中的步骤，其中，所述DNA是在来自核 糖体RNA基因的RNA聚合酶I识别的启动子下游含有来自JFH1林的 HCV基因组cDNA,且在其下游进一步含有来自核糖体RNA基因的 RNA聚合酶I识别的终止子的DNA。
(b) (a)的生产感染性HCV颗粒的方法，其中，可接受HCV增殖的 细胞选自Huh7、 RCYM1RC、 5-15RC、 HepG2以及由这些细胞所派生 的细胞才木(株化細胞)。
(c) 表达载体，该表达载体用于生产感染性丙型肝炎病毒(HCV)颗 粒，该表达载体含有下述DNA:在来自核糖体RNA基因的RNA聚合 酶I识别的启动子的下游含有来自JFH1抹的HCV基因组cDNA,且在 其下游进一步含有来自核糖体RNA基因的RNA聚合酶I识别的终止子 的DNA。
本发明还涉及生产感染性丙型肝炎病毒(HCV)颗粒的方法，该方法 包含以下步骤将含有下述DNA的表达栽体导入可接受HCV增殖的细 胞的步骤，其中所述DNA是在RNA聚合酶I启动子的下游含有编码 HCV的5，非翻译区和结构蛋白以及任意的非结构蛋白的DNA序列，和 编码来自HCV JFH1林的非结构蛋白和3'非翻译区的DNA序列，并且 在其下游进一步含有RNA聚合酶I终止子。
更具体地说，本发明涉及以下(l)-(4)的方法。
(1)生产感染性丙型肝炎病毒(HCV)颗粒的方法，该方法包含将以 下的i)或ii)的表达载体导入由Huh7、 RCYM1RC、 5-15RC、 HepG2以 及由这些细胞派生的细胞抹中选择的细胞中的步骤
i)含有下述DNA的表达栽体，该DNA在RNA聚合酶I启动子的 下游含有编码来自HCV林的5'非翻译区、核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、 p7蛋白、NS2蛋白的DNA序列，和编码来自HCV JFH1抹的NS3、NS4A、NS4B、 NS5A和NS5B蛋白以及3，非翻译区的DNA序列，并且在其下 游进一步含有RNA聚合酶I终止子；或者
ii)含有下述DNA的表达载体，该DNA在RNA聚合酶I启动子的 下游含有编码来自HCV抹的5，非翻译区、核心蛋白、El蛋白、E2蛋白、 p7蛋白的DNA序列，和编码来自HCVJFH1抹的NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A和NS5B蛋白以及3，非翻译区的DNA序列，并且在其下 游进一步含有RNA聚合酶I终止子。
(2) 上述(l)的方法，其中，上述HCV抹是基因型1或基因型2的 HCV林。
(3) 上述(2)的方法，其中，基因型1的HCV林选自H77c林、l抹、 H抹、HC-J1林、Jl林、conl抹、TH林、J抹、JT抹、BK抹。
(4) 上述(2)的方法，其中，基因型2的HCV抹选自J6CF林、JFH1 林、JCH1林、HC-J8抹。
根据本发明，在培养细胞系中由重组DNA生产感染性丙型肝炎病 毒颗粒的方法中，与以往的方法相对，可以以约60倍的高密度高产率 生产具有感染性的HCV颗粒。


图1A表示使用RNA聚合酶I启动子/终止子系的HCV表达载体的
构建图。
图1B表示pHHH77c、 pHHJFHl、 pHH JFH1/GND的图语。
图1C表示pHH H77c(C-p7)/JFHl 、 p朋J6(C-p7)/JFHl 、 pHH Jl(C-p7)/JFHl和p朋J1(C-NS2)/JFH1的图谱。
图2是在导入了 RNA聚合酶I启动子/终止子系的HCV表达载体的 细胞中，确认HCVRNA被转录的实验结果的照片。泳道l、 3是将pHH JFH1分别导入到Huh7和HepG2中时的结果，泳道2、 4是将pHH JFH1/GND分别导入到Huh7和HepG2中的结果。
图3表示通过聚合酶I启动子/终止子系的表达载体转录的HCV RNA的5，末端的序列。在导入了 PHHJFH1和pHHJFHl/GND的细胞中 转录的HCVRNA的5'末端与JFH1基因组RNA的序列相同。
图4是在导入了 RNA聚合酶I启动子/终止子系的HCV表达栽体的 细胞中，对于HCV蛋白质是否被翻译进行确认的实验结果照片。在导入了 pHH JFH1的细胞中，显示核心蛋白和NS5A蛋白被翻译。在导入 了 pHHH77c和pHHJFHl/GND的细胞中，HCV蛋白质未被翻译。
图5是将pHH JFH1和pHH JFH1/GND与GFP表达栽体一起导入到 Huh7、 RCYM1RC、 5-15RC、 HepG2和293T细胞中后，通过GFP的表 达显示这些细胞中HCV蛋白的表达和载体的导入效率的照片。pHH JFH1在293T以外的细胞中表达核心蛋白。pHH JFH1/GND在任何细胞 中都未表达核心蛋白。
图6B表示通过蔗糖密度离心将导入了 pHH JFH1的HepG2细胞培养液 进行分级得到的试样的核心蛋白质量。发现了 pHH JFH1培养上清O) 的核心蛋白的比重为1.15 g/mL的级分，显示核心蛋白以病毒颗粒的形 式分泌。另一方面，表达核心、El、 E2、 p7的细胞的培养上清(x)成为 宽峰。
图7是表示在将导入了 pHH JFH1的HepG2细胞培养液进行NP40 处理时，与未处理进行比较，核心蛋白的峰发生变动。与NP40未处理(令) 进行比较，如果用NP40进行处理(B),则核心蛋白的峰位移至比重1.20 g/mL。显示比重轻的表面膜通过NP40从病毒颗粒上剥离。
图8是表示将导入了用超滤膜浓缩的pHH JFH1的HepG2细胞培养 液(A)或Huh7细胞培养液(B)接种于Huh7.5.1中，4天后用抗NS5A抗体 进行染色的结果照片。表示检测出抗NS5A抗体阳性细胞(感染细胞)。
图9是表示在pHH JFH1中插入了在SV40启动子控制下表达Zeocin 抗性基因的盒的载体的图语。
图10A中，图10是表示插入片段J6(C-p7)JFHl的DNA序列的图， 图10A是其最靠近5，末端一侧的序列。
图10B中，图IO是表示插入片段J6(C-p7)JFHl的DNA序列的图， 图IOB表示与图IOA的序列的3'—側连接的序列。
图10C中，图10是表示插入片段J6(C-p7)JFHl的DNA序列的图， 图IOC表示与图10B的序列的3'—側连接的序列。
图10D中，图10是表示插入片段J6(C-p7)JFHl的DNA序列的图， 图IOD表示与图IOC的序列的3'—侧连接的最靠近3，末端的序列。
图11A中，图11是表示插入片段H77c(C-p7)JFHl的DNA序列的 图，图11A是其最靠近5，末端一侧的序列。图11B中，图11是表示插入片段H77c(C-p7)JFHl的DNA序列的 图，图IIB表示与图IIA的序列的3'—侧连接的序列。
图11C中，图10是表示插入片段H77c(C-p7)JFHl的DNA序列的 图，图IIC表示与图11B的序列的3，一側连接的序列。
图11D中，图11是表示插入片段H77c(C-p7)JFHl的DNA序列的 图，图IID表示与图11C的序列的3，一侧连接的最靠近3，末端的序列。
图12A中，图12是表示插入片段Jl(C-p7)JFHl的DNA序列的图， 图12A是其最靠近5，末端一侧的序列。
图UB中，图12是表示插入片段Jl(C-p7)JFHl的DNA序列的图， 图12B表示与图12A的序列的3'—侧连接的序列。
图12C中，图12是表示插入片段Jl(C-p7)JFHl的DNA序列的图， 图12C表示与图12B的序列的3，一侧连接的序列。
图12D中，图12是表示插入片段Jl(C-p7)JFHl的DNA序列的图， 图12D表示与图12C的序列的3'—侧连接的最靠近3，末端的序列。
图13A中，图13是表示插入片段J1(C-NS2)JFH1的DNA序列的图， 图13A是其最靠近5'末端一侧的序列。
图13B中，图13是表示插入片段J1(C-NS2)JFH1的DNA序列的图， 图13B表示与图13A的序列的3'—侧连接的序列。
图13C中，图13是表示插入片段J1(C-NS2)JFH1的DNA序列的图， 图13C表示与图13B的序列的3'—侧连接的序列。
图13D中，图13是表示插入片段J1(C-NS2)JFH1的DNA序列的图， 图13D表示与图13C的序列的3'—侧连接的最靠近3，末端的序列。
具体实施例方式
1.使用RNA聚合酶I启动子/终止子体系的HCV表达栽体的构建 已知转录RNA的RNA聚合酶有三种。RNA聚合酶I由核糖体RNA
基因转录rRNA, RNA聚合酶II由编码蛋白质的基因转录mRNA, RNA
聚合酶III由tRNA基因转录tRNA。
通过该终止子序列终止转录。而在利用RNA聚合酶II的转录中无需终 止子序列。该转录终止的方式尚未明确，但可以认为对于mRNA的3， 末端的形成，重要的并不是转录终止本身，而是初次转录产物的切断反应。
与RNA聚合酶I和m启动子下游连接的基因的转录产物中，与在 RNA聚合酶II启动子下游的基因转录产物不同，其5，和3'末端并未分 别附加帽、polyA。天然的HCV基因组RNA的5，和3，末端未附加帽和 polyA。由此显示，通过RNA聚合酶I或III启动子使HCV基因组DNA 表达，可以转录与HCV病毒基因组RNA同样的RNA。
可利用的启动子只要是在被转录的RNA的5，和3，末端未分别附加 帽、polyA即可，优选RNA聚合酶I启动子，进一步优选来自rRNA基 因的启动子。另外，启动子的来源只要是来自动物即可，但优选来自小 鼠、人。特别优选的RNA聚合酶I启动子是人核糖体RNA (rRNA)基因 的启动子。
并且，终止子序列可以是RNA聚合酶I终止子，优选来自rRNA基 因的终止子。终止子的来源只要是来自动物即可，但优选来自小鼠、人。 特别优选的RNA聚合酶I终止子是小鼠核糖体RNA (rRNA)基因的终止子。
RNA聚合酶I启动子/终止子体系用于流感病毒颗粒的再构成 (Neumann, G.等人.，Virology, 202 (1994) 477-479页、Neumann, G.和 Kawaoka, Y., Virology, 287 (2001) 243-250页、日本特表2003-520573)。 本发明的方法中，可以使用作为RNA聚合酶I启动子/终止子体系载体 的pHH21 (Neumann, G.等人.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (1999) 9345-9350页)。pHH21是含有人RNA聚合酶I启动子作为启动子、含 有小鼠RNA聚合酶I终止子作为终止子的表达载体。
使用PCR在HCV基因组cDNA的5，端和3'端分别附加限制酶 BsmBI识别序列，然后用BsmBI消化，将HCV基因组插入到pHH21的 BsmBI位点，则在启动子/终止子与HCV基因组cDNA之间不含有多余 的碱基序列地将它们连接。
通过将上述启动子、HCV基因组cDNA和终止子适当连接，可以新 构建本发明的方法中使用的表达栽体。
使用HCV抹的碱基序列的系统分析法中，HCV被分为基因型la、 基因型lb、基因型2a、基因型2b、基因型3a、基因型3b共六个类型， 并且各类型均分成几个亚型。关于HCV的多种基因型，其基因组全长 碱基序列已得到确定(Simmonds， P.等人.,Hepatology, 10 (1994)1321-1324页、和Choo, Q. L等人.,Science, 244 (1989) 359-362页、 Okamoto, H等人.,J. Gen. Virol., 73 (1992) 673-679页、Mori, S.等人 Biochem. Biophis. Res. Commun. 183 (1992) 334-342页)。
本发明中，作为HCV林，具体可使用基因型1 (包含基因型la和 lb)的H77c (H77株的共有序列GenBank登录号AF011751)、 1抹 (GenBank登录号M62321)、 H林(GenBank登录号M67463)、 HC-J1林 (GenBank登录号D10749)、 Jl抹(GenBank登录号D89815)、 conl林 (GenBank登录号AJ238799)、TH株(Wakita,T.等人.，J. Biol. Chem., (1994) 269, 14205-14210页)、J林(GenBank登录号D90208)、 JT林(GenBank 登录号D01171)、 BK抹(GenBank登录号M58335)等，基因型2(包含基 因型2a和2b)的J6CF抹(GenBank登录号AF177036)、 JFH1抹(GenBank 登录号AB047639,也称为JFH-1抹)、JCH1林(GenBank登录号 AB047640)、 HC-J8株(GenBank登录号D01221)等。关于其它的抹也已 在GenBank登录号的清单中有报告(Tokita,T.等人.，J. Gen. Virol. (1998)79, 1847-1857页、Cristina J.&Colina R. Virolgy Journal, (2006) 3, 1-8页)，可以获得。
插入到RNA聚合酶I启动子/终止子系载体中的、来自HCV基因组 RNA的cDNA可以利用上述基因型的任何类型，并且可以利用含有它们 的嵌合型的基因型。优选来自在导入到Huh7等可接受HCV的细胞中时 发生HCV基因组RNA的自主复制的基因型的(Wakita,T.等人.，Nat. Med.， 11, (2005), 791-796页、Lindenbach BD.，等人.，Science, 309 (2005) 623-626页)，进一步优选与基因型2a的JFH1抹(日本特开2002-171978 号公报)的基因组RNA对应的基因组cDNA序列(GenBank登录号 AB047639, Kato,T等人.，Gastroenterology, 125 (2003) 1808-1817页，SEQ ID N0.27)。
丙型肝炎病毒(HCV)的基因组是含有约9600个核苷酸的(+)链单链 RNA。该基因组RNA含有5，非翻译区(也表示为5，NTR或5'UTR)、由 结构区和非结构区构成的翻译区以及3，非翻译区(也表示为3'NTR或 3'UTR)。在该结构区中编码HCV的结构蛋白，在非结构区中编码多种 非结构蛋白。
上述HCV的结构蛋白(核心、E1、E2和p7)和非结构蛋白(NS2、NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 NS5B)是在被从翻译区翻译成一系列多蛋白后，通过蛋白酶进行限定分解(限定滤)，使其游离并生成。这些结构蛋白和非结构蛋白(即HCV的病毒蛋白)中，Core是核心蛋白，E1和E2是包 膜蛋白。已知非结构蛋白是与病毒自身复制有关的蛋白质，NS2具有金 属蛋白酶活性，NS3具有丝氨酸蛋白酶活性(N末端一侧的3分之l)和解 旋酶活性(C末端一侧的3分之2)。并且，NS4A是NS3的蛋白酶活性的 辅因子，NS5B具有依赖于RNA的RNA聚合酶活性。本发明的生产HCV颗粒的方法中使用的表达栽体具有下述DNA， 所述DNA含有在RNA聚合酶I所识别的启动子(RNA聚合酶I启动子) 的下游依次排列HCV基因组cDNA的5'非翻译区、核心蛋白编码序列、 El、 E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2、 NS3、 NS4(包含NS4A 和NS4B)、 NS5A和NS5B蛋白编码序列以及3，非翻译区的序列，并且 在其下游可以含有RNA聚合酶I所识别的终止子(RNA聚合酶I终止子)。 这些序列被翻译成一系列的多蛋白后，通过蛋白酶进行限定分解，使其 游离并生成，生产HCV颗粒。生产本发明的HCV颗粒的方法中，使用含有下述DNA片段的表达 载体，该DNA片段是在RNA聚合酶I启动子的下游连接由来自任意的 HCV抹的HCV基因组RNA合成的cDNA,再在其下游连接RNA聚合 酶I终止子所得。与RNA聚合酶I启动子的下游和RNA聚合酶I终止 子的上游连接的上述HCV cDNA可以是与来自一种HCV抹(优选为 JFH1抹)的基因组RNA对应的基因组cDNA，也可以是由来自两种以上 HCV林(优选至少其中一种为JFH1林)的基因组RNA合成的cDNA所衍 生的嵌合核酸。在RNA聚合酶I启动子和RNA聚合酶I终止子之间连 接的上述HCV cDNA优选为将编码HCV的5'非翻译区、结构蛋白(核心、 El、 E2和p7)、非结构蛋白(NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A和NS5B) 以及3，非翻译区的DNA序列按此顺序含有各一个的HCV全基因组样 cDNA序列。特别是，含有下述DNA片段的嵌合HCV表达载体的感梁性HCV 生产能力高，因而非常优选，其中所述DNA片段在RNA聚合酶I启动 子的下游依次含有分别编码来自HCV林(优选基因型1或2的HCV林) 的5'非翻译区和结构蛋白的DNA序列，以及根据需要编码来自HCV林 的非结构蛋白的DNA序列，接着是分别编码来自HCV JFH1抹的非结 构蛋白和3，非翻译区的DNA序列，并且在其下游进一步含有RNA聚合酶I终止子。
本发明的更优选的表达栽体是含有下述DNA的表达栽体，其中所 述DNA是在RNA聚合酶I启动子的下游含有HCV基因组cDNA序列， 在其下游进一步含有RNA聚合酶I终止子，其中所述HCV基因组cDNA 包含来自任意的HCV株的HCV基因组cDNA (即，编码HCV基因组 RNA全长的DNA)的5，非翻译区编码序列、核心蛋白编码序列、El、 E2 蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列，以及来自JFH1 抹的HCV基因组cDNA的NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A和NS5B蛋白编 码序列以及3，非翻译区编码序列。另外，其它优选的表达栽体含有以下 DNA:在RNA聚合酶I启动子的下游含有HCV基因组cDNA序列，在 其下游进一步含有RNA聚合酶I终止子的DNA，其中所述HCV基因組 cDNA序列包含来自任意的HCV抹的HCV基因组cDNA的5，非翻译 区、核心蛋白编码序列、El、 E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列，以 及来自JFH1抹的HCV基因组cDNA的NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、 NS5B蛋白编码序列以及3'非翻译区编码序列。
上述表达载体中，任意的HCV抹优选为基因型1或2的HCV抹。 上述表达载体中的5'非翻译区编码序列优选为来自JFH1抹的序列或来 自选自基因型1和基因型2的HCV抹中的两种以上HCV林的嵌合序列， 为嵌合序列时，进一步优选含有来自JFH1抹的序列。作为基因型1的 HCV林，例如可使用H77c抹、l抹、H抹、HC-J1株、Jl抹、conl抹、 TH林、J株、JT抹、BK林等。作为基因型2的HCV抹，例如可使用 J6CF株、JFH1抹、JCH1抹、HC-J8抹等。更优选的HCV林有JFH1抹、 J6CF株、Jl抹、H77c林。
作为一个例子，在来自JFH1林的全长基因组cDNA中，可整合到 本发明的表达载体中的、编码由5，非翻译区至NS2蛋白的区域在SEQ ID
基编号1-3430,编码°由NS3蛋白至3'非翻译区的区^是碱基编号 3431-9678。同样，在来自JFH1林的全长基因组cDNA中，编码由5，
编号1-2779,编码由NS2蛋白至3，非翻译区的区域是碱基编号 2780-9678。对于其它的来自HCV株的基因組cDNA上的各区的位置， 也可以以该JFH1林的基因组cDNA序列为基准确定。本发明的特别优选的表达载体的例子是含有后述实施例所示的DNA片段J6(C-p7)JFHl (SEQ ID N0.29)、 H77c(C-p7)JFHl (SEQ ID NO.30)、 Jl(C-p7)JFHl(SEQIDN0.31)、 J1(C-NS2)JFH1 (SEQ ID N0.32) 中的任意序列的表达载体。优选这些DNA片段在载体中的表达启动子 的控制下插入。如果HCV非结构蛋白NS5B中的GDD氨基酸序列突变为GND， 则无法发生自主复制(Kato，T. 等人.，Gastroenterology, 125 (2003)1808-1817页)，因此作为实验的对照，可以使用氨基酸序列突变 为GND的NS5B蛋白。2. 细胞内HCVRNA的合成的确认可将上述制备的本发明的表达载体导入细胞内，转录HCV RNA。 DNA向细胞的导入可使用电穿孔法、脂转染法、磷酸钙法等常规方法进行。由表达载体DNA转录的HCV RNA的分析可通过通常的分子生物 学方法(Molecular Cloning 3rd Edition Sambrook & Russell Cold Spring Harbor Laboratory Press 200l)分析。具体来说，可使用RNA印迹法、核 糖核酸酶保护测定法、RT-PCR法和RACE法等，对所转录的RNA的量 或序列进行分析。对RNA进行定量时，可以采用RNA印迹法、RT-PCR 法，对RNA的序列进行分析时可以采用RACE法。对在细胞内转录的HCVRNA的5'末端的序列进行分析时，可使用 RNA连接酶将特定序列的合成RNA接头与HCV RNA连接，以此为模 板，使用与HCV RNA互补的合成DNA引物，通过反转录酶合成cDNA。 接着，由接头内的序列和之前使用的引物5，侧的引物进行PCR,扩增与 HCVRNA互补的片段，克隆到质粒载体中，然后确定碱基序列，由此 可以对在细胞内转录的HCVRNA的序列进行分析。最初的PCR未扩增 DNA片段时，通过嵌套式PCR法进行也可以进行分析。3. 细胞内HCV蛋白表达的确认在感染了HCV、并有HCV基因组RNA复制的细胞中，上述HCV 蛋白表达。因此，如果从由HCV基因组RNA复制细胞中提取的蛋白质 中检测出HCV蛋白质，则可以判断该细胞正在复制HCV基因组RNA。HCV蛋白质的检测可按照公知的任意蛋白质检测方法进行，例如，可将
蛋白反应来进行:更^具体地说，例如将由细胞^取的蛋i质试样转印在 硝基纤维素膜上，使抗HCV蛋白抗体(例如抗NS3特异性抗体、或由丙 型肝炎患者采集的抗血清)与其反应，再检测该抗HCV蛋白抗体来进行。 表达HCV蛋白质的宿主细胞只要是可继代培养的细胞即可，没有 特别限定，优选为真核细胞，更优选为人细胞，进一步优选来自人肝脏 的细胞、来自人子宫颈的细胞、或来自人胎儿肾的细胞。细胞优选含有 癌细胞抹、干细胞抹等的增殖性细胞，更优选Huh7细胞(ATCC CCL-185)、 HepG2细胞(ATCC HB 8065)、 IMY-N9细胞(Date，T.等人., J.Biol. Chem.， (2004) 279, 22371-22376页)、HeLa细胞(ECACC 93021013)、 RCYM1RC细胞(Mumkami, K.，等人.，Virology， 351, 381-392, 2006)、 5-15RC细胞(Pietschmann T.,等.,J Virol. (2001) 75, 1252-1264页) 以及由这些细胞所派生的细胞抹等。特别优选的细胞有Huh7细胞、 RCYM1RC细胞、5-15RC细胞、HepG2细胞以及由这些细胞派生的细 胞抹。这些细胞可以利用市售的商品，也可以由细胞保藏机构获得并使 用，可以使用由任意的细胞(例如癌细胞或干细胞)抹化的细胞。由Huh7 细胞派生的细胞抹有Huh7.5细胞(Blight, KJ.等人.,Virol.， (2002) 76, 13001-13014页)和Huh7.5.1细胞(Zhong， J.等人.，Proc. Natl. Acad. Sci USA, (2005) 102, 9294-9299页)。前者是在Huh7细胞中基因导入复制子， 然后建立复制子复制细胞、将其用干扰素处理、排除复制子、由此得到 的hcv复制能力高的细胞，后者是通过干扰素y处理，从用Huh7.5细 胞制备的复制子复制细胞中排除复制子而得到的复制效率好的细胞。
4. HCV颗粒产生的确认
将本发明的表达栽体导入HCV可接受性细胞(可接受HCV增殖的 细胞)，培养该细胞，由此可产生具有由本发明的表达载体转录的HCV 基因组RNA的丙型肝炎病毒(HCV)颗粒。HCV可接受性细胞优选使用 Huh7细胞、RCYM1RC细胞、5-15RC细胞、HepG2细胞以及由这些细 胞所派生的细胞抹等。上述生成的丙型肝炎病毒(HCV)颗粒保持对其它 细胞的感染性。本发明涉及上述感染性丙型肝炎病毒颗粒的生产方法。
细胞的病毒颗粒生产能力可使用公知的任意的病毒检测法确认。例:i口， 3t 反Vv刀it咎广王辨母颗 分级，测定各级分的密度、HCV核心蛋白浓度以及HCV基因组RNA 的量，如果HCV核心蛋白与HCV基因组RNA的峰一致，并且检测出 该峰的级分的密度比将培养上清用0.25% NP40 (聚氧乙烯(9)辛基苯基醚，Polyoxyethylene(9)Octylphenyl Ether)处理之后分级时的相同级分的密度轻， 则可以判定该细胞具有病毒颗粒产生能力。有报道称，游离的HCV颗 粒的比重是1.14-1.16 g/mL (Kaito, M.等人.，J. Gen. Virol. 75 (1994) 1755-1760页)，也可以与该值进行比较。释放到培养液中的HCV病毒颗粒例如可使用核心蛋白、El蛋白或 E2蛋白的抗体检测。培养液中的HCV病毒颗粒所含有的HCV基因组 RNA可以通过使用特异性引物的RT-PCR法扩增并检测，由此可以间接 检测HCV病毒颗粒的存在。5.本发明的HCV颗粒对其它细胞的感染通过本发明的方法生产的HCV病毒颗粒对细胞(优选HCV可接受 性(感受性)细胞)具有感染能力。本发明提供丙型肝炎病毒感染细胞的制 备方法，该方法包含将导入了使用RNA聚合酶I启动子/终止子体系的 HCV表达载体的细胞进行培养，将所得培养物(优选培养液)中的病毒颗 粒感染其它细胞(优选HCV感受性细胞)。这里，HCV可接受性细胞是 指具有HCV基因组RNA的复制能力和/或被HCV感染的能力的细胞。 HCV可接受性细胞优选为肝脏细胞或淋巴细胞系细胞，但并不限于此。 具体来说，作为肝脏细胞，可列举原代肝脏细胞、Huh7细胞、HepG2 细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞、293细胞等，作为淋巴细胞系细胞， 可列举Molt4细胞、HPB-Ma细胞、Daudi细胞等，但并不限于这些。 作为特别优选的HCV可接受性细胞，可列举Huh7细胞、RCYM1RC细 胞、:5-15RC细胞、HepG2细胞以及由这些细胞所派生的(制备的)细胞株。 作为由Huh7细胞派生的细胞中优选的细胞，可列举Huh7.5细胞和 Huh7.5.1细胞。导入到细胞中，用该细胞中产生的HCV颗粒感染细胞(例如HCV可接 受性细胞)，则在该感染细胞中，HCV基因组RNA被复制，进而形成病 毒颗粒。导入到细胞中，将该细胞中产生的HCV病毒颗粒感染黑猩猩等可感染 HCV病毒的动物，可引发HCV引起的肝炎。
导入到细胞中，该细胞中产生的HCV颗粒是否具有感染性，可以如下 判断将导入了本发明的使用RNA聚合酶I启动子/终止子系的HCV表 达栽体的细胞进行培养，将所得的上清对HCV可接受性细胞(例如Huh7) 进行处理，例如在48小时后用细胞抗核心抗体进行免疫染色，对感染 细胞数进行计数，或者通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶对细胞提取物进行电 泳，通过蛋白质印迹法^r测核心蛋白。
6.感染性HCV颗粒产生细胞株的获得
稳定地导入了本发明的使用RNA聚合酶I启动子/终止子系的HCV 表达载体的细胞可持续地生产感染性HCV颗粒。为了获得稳定地表达 本发明的使用RNA聚合酶I启动子/终止子系的HCV表达载体的细胞 抹，优选将抗药性基因整合到该栽体中。作为抗药性基因，可列举G418 抗性基因、潮霉素抗性基因、噪呤霉素抗性基因、2eocin抗性基因、杀 稻痘素抗性基因等。以抗药性为指标筛选的克隆的HCV颗粒生产能力 可通过采用RNA印迹、定量RT-PCR检测这些克隆的培养上清中的核 心蛋白质量或由克隆复制的HCV RNA的量来推定。
本说明书包含作为本申请的优先权主张基础的日本特许出愿 2005-287646号说明书和/或附图所记载的内容》
本说明书中所引用的所有刊物、专利和专利申请全体均作为参照可I 用到本说明书中。
实施例
以下给出实施例更具体地说明本发明。但这些实施例只是用于说 明，并不限制本发明的技术范围。 [实施例1]
使用RNA聚合酶I启动子/终止子系的HCV表达载体的构建 作为HCV基因组RNA的cDNA，使用来自基因型2a的JFH1株的 基因组RNA的cDNA (GenBank登录号AB047639、 Kato, T.等人,Gastroenterology, 125(2003) 1808-1817页)、来自发生了 DNA序列变 换的JFHl林的基因组RNA的cDNA,其中JFHl林的NS5B中的GDD 氨基酸序列变异为GND(Wakita等人，Nat Med.， 11 (200》791-796页)、 来自J6CF抹的基因组RNA的cDNA (GenBank登录号AF 177036、Yanagi, M.等人.，Virology, 262(1999) 250-263页)、来自基因型la的H77c林的 基因组RNA的cDNA(GenBank登录号AF011751 、 Yanagi， M.等人.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (1997) 8738-8743页)、以及来自基因型lb的Jl 林的基因组RNA的cDNA (GenBank登录号D89815、 Aizaki， H.等人. Hepatology, 27 (1998) 621-627页)。
使用PCR，分别在上述HCV基因组cDNA (JFHl 、 JFH1/GND和H77c) 的5'端和3'端附加限制酶BsmBI识别序列。利用BsmBI的切断位点与 该酶的识别位点有一定距离的性质，在启动子/终止子与HCV基因组之 间没有多余碱基序列地将HCV基因组插入到具有人RNA聚合酶I启动 子和小鼠RNA聚合酶I终止子序列的p腦l载体(Neumann， G.等人， Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 96 (1999) 9345-9350页)的BsmBI位点(图 1A)。另夕卜，各克隆的图谱如图1B所示。所得的含有HCV基因组cDNA 的载体分别称为pHH JFHl 、 pHH JFH1/GND和pHH H77c。
并且，分别来自J6CF和JFH1、 H77c和JFHl、 Jl和JFHl的基因 组cDNA的嵌合HCV表达载体的制备按以下方法进行。
PHH J6(C-p7)/JFHl的制备
将与来自JFHl株的基因组RNA全部区域对应的cDNA克隆到 pUC19质粒中，由此构建作为质粒DNA的pJFHl (Wakita,T.等人.，Nat. Med, 11 (2005), 791-796页、国际公开WO2004/104198),将其用Agel 消化后，再用Bcll进行部分消化，纯化由Agel位点至最初的Bell位点 的片段(2672 bp)被除去的质粒DNA片段。另夕卜，将来自J6CF抹的基因 组cDNA用Agel和Bell部分消化，将所得的2672 bp片段与上述片段 连接，得到pUC J6/JFH1。
接着，将pHH JFHl用Noel消化，得到约4.3 kb的片段；将pUC J6/JFH1用Noel消化，得到约8.2 kb的片段，将它们用连接酶连接，得 到表达栽体pHH J6(C-p7)/JFHl 。该pHH J6(C-p7)/JFHl的插入片段 (J6(C-p7)JFHl， SEQIDN0.29,图10A-D)含有分别编码来自JFHl抹和 J6CF林的嵌合的5，非翻译区、来自J6CF林的核心蛋白、El蛋白、E2蛋白、以及p7蛋白的DNA序列，以及分别编码来自JFH1林的NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A和NS5B蛋白以及3'非翻译区的DNA序歹U 。
dHHH77c〖C-d7VJFH1的制备
以上述JFH1基因组cDNA为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(夕力 ，六4才社)所附带的10x緩冲液5 pL、 2.5 mM dNTP混合液5 ^L、 10pM引物5-JFH-S (SEQ ID NO. 10: GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT)和 5-JFH-A (SEQ ID NO. 11: TCGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC)各1 pL， 最后加入去离子水，使总量为49 ^L。接着加入1 |aL Takara LA Taq (夕 力，户xf才社)，然后进行PCR反应。PCR反应是以含有94°C1分钟、 64。C2分钟、72。C3分钟的步骤作为一个循环，进行30个循环。将所得 PCR产物作为PCR产物no丄接着，以JFHl基因组cDNA为模板，分 别加入LA-PCR试剂盒(夕力才制备)所附带的10x緩冲液5 pL、 2.5 mM dNTP混合液5 ^L、 10 pM引物3-JFH-S (SEQ ID NO.12: GGCATACGCA丁ATGACGCACC丁GTGCACGG)和3JFH-A(SEQ ID NO. 13: GCTCTGACGAAGTACGGCACATGTGTC)各1 ^L,最后力口入去离子水，使总量 为49iiL。接着加入lpLTakamLAT叫(夕力才公司)，然后进行 PCR反应。PCR反应是以含有94°C1分钟、64。C2分钟、72°C3分钟的 步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产物 no.2。再以上述H77c基因组cDNA为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(夕 力，"、4才社)所附带的10x緩沖液5 pL、 2.5 mM dNTP混合液5 pL、 10 j^M引物5-H77-S (SEQ ID NO. 14 ACCGTGCACCATGAGCACGAATCCTAAACC) 和5誦H77-A (SEQ ID NO. 15: GMGCCGCACGTMGGGTATCGA丁G:)各1 pL， 最后加入去离子水，使总量为49 nL。接着加入lpL Takara LA Taq (夕 力，A4才社)，然后进行PCR反应。PCR反应是以含有94°C1分钟、 64匸2分钟、72。C3分钟的步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得 PCR产物作为PCR产物no丄再以上述H77c基因组cDNA为模板，分 别加入LA-PCR试剂盒(夕力，"4才社)所附带的10x緩沖液5 nL、 2.5 mM dNTP混合液5 ^L、 10 pM引物3-H77-S (SEQ ID N0.16: CATTGTGCCCGCAAAGAGCGTGTGT )和 3-H77-A (SEQ ID NO. 17 : GTGCGTCATATGCGTATGCCCGCTGAGGCA)各1 ，最后加入去离子7JC， 使总量为49pL。接着加入lpLTakaraLAT叫(夕力才社)，然后进行PCR反应。PCR反应是以含有94°C1分钟、64。C2分钟、72°C3分 钟的步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产 物no.4。
接着，将各PCR产物进行纯化，溶解于50 ^L水中。将PCR产物 no.l和PCR产物no.3的DNA稀释100倍，各取1 混合。以该混合 液为模板，不加入引物，在上述条件下进行5个循环的PCR。然后添加 引物5-JFH-S (SEQ ID NO.10)和5-H77-A (SEQ ID NO. 15)，再进行25个 循环的PCR，由此纯化扩增的嵌合DNA片段。将该片段克隆到质粒载 体pCRII上，确定该DNA片段的碱基序列，确认碱基序列正确。将嵌 合DNA片段克隆到pCRII上，将所得的该质粒命名为pCR5HJ。接着， 将PCR产物no.2和PCR产物no.4的DNA稀释100倍，各取1 pL混合。 以该混合液为;f莫板，不加入引物，在上述条件下进行5个循环的PCR。 然后添加引物3-H77-S (SEQ ID N0.16)和3-JFH-A (SEQ ID NO.13),再 进行25个循环的PCR，由此纯化扩增的嵌合DNA片段。将该片段克隆 到质粒载体pCRII上，确定该DNA片段的碱基序列，确认碱基序列正 确。将嵌合DNA片段克隆到pCRII上，将所得的该质粒命名为pCR3HJ。
接着，将pCR5HJ用限制酶Agel和Kpnl 、将H77c基因组cDNA用 限制酶Kpnl和Ascl、将pCR3HJ用限制酶Ascl和Notl消化，将各HCV cDNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，纯化。将该三个DNA片段 与将pHH JFH1用Agel和Notl消化得到的载体连接。将该载体命名为 pHH H77c(C-p7)/JFH。该表达载体pHH H77c(C-p7)/JFH的插入片段 (H77c(C-p7)/JFH; SEQIDNO.30,图11A-D)含有分别编码来自JFH1抹 和H77c抹的嵌合的5'非翻译区、来自H77c株的核心蛋白、El蛋白、 E2蛋白和p7蛋白的DNA序列，以及分别编码来自JFH1抹的NS2、NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A和NS5B蛋白和3，非翻译区的DNA序列。
PHH Jl〖C-p7)/JFHl的制备
以上迷JFH1基因组cDNA为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(夕力 ，八4才社)中所附带的10x緩冲液5pL、 2.5 mM dNTP混合液5 nL、 10|iM引物5曙JFH-S (SEQ ID NO. 10: GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT)和 5-JFH-A2 (SEQ ID N0.1& TTGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC)各1 pL, 最后加入去离子水，使总量为49 ^L。接着加入1 pL Takara LA T叫(夕
20力，^4才社)，然后进行PCR反应。PCR反应是以含有94°C1分钟、 64。C2分钟、72。C3分钟的步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得 PCR产物作为PCR产物no.5。
接着，以JFHl基因组cDNA为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(夕 力，乂《4才社)中所附带的10x緩冲液5 nL、 2.5 mM dNTP混合液5 pL、 10pM 引 物 3陽JFH-S2 (SEQ ID N0.19 : AGCTTACGCCTATGACGCACCTGTGCACGG )和3-JFH-A (SEQ ID NO. 13: GCTCTGACGAAGTACGGCACATGTGTC )各1 ,最后加入去离子水，{吏总量 为49 ^L。接着加入1 nL Takam LA Taq (夕力，,才社)，然后进行PCR 反应。PCR反应是以含有94°C1分钟、64。C2分钟、72°C3分钟的步骤 作为一个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.6。
接着，以与来自基因型lb的Jl抹的基因组RNA对应的cDNA (GenBank登录号D89815、 Aizaki, H.等人,Hepatology, 27 (1998) 621-627 页)为才莫板，分别加入LA-PCR试剂盒(夕力，六4才社)中所附带的10x 緩冲液5 pL、 2.5 mM dNTP混合液5 ^L、 10 引物3-J1-S (SEQ ID NO.20 : ACCGTGCACCATGAGCACAAATCCTAAACC )和 5J1-A (SEQ ID N0.21: AAGCGGGATGTACCCCATGAG)各1 最后加入去离子水，使总
量为49piL。接着加入1 ]iLTakaraLATaq(夕力，乂、M才社)，然后进行 PCR反应。PCR反应是以含有94°C1分钟、64。C2分钟、72°C3分钟的 步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产物 no.7。
接着，以来自上述Jl抹的基因组cDNA为模板，分别加入LA-PCR 试剂盒(夕力，"4才社)中所附带的10x緩沖液5 iaL、 2.5mMdNTP混 合液 5 nL 、10 pM 引物 3-J1-S (SEQ ID N0.22 : CGGCTGTACATGGATGAATAGCAC丁GGGTT )和 3-J1-A (SEQ ID N0.23 : GTGCGTCATAGGCGTMGCTCGTGGTGGTA )各1 ^,最后力口入去离子水，使
总量为49^iL。接着加入lpLTakaraLATaq(夕力，戸4才社)，然后进 行PCR反应。PCR反应是以含有94°C1分钟、64。C2分钟、72°C3分钟 的步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产物 no. 8。
接着，将各PCR产物进行纯化，溶解于50 nL水中。将PCR产物 no.5和PCR产物no.7的DNA稀释100倍，各取1 混合。以该混合液为模板，不加入引物，在上迷条件下进行5个循环的PCR。然后添加 引物5-JFH-S (SEQ ID NO.10)和5-J1-A (SEQ ID N0.21),再进行25个循 环的PCR,由此纯化扩增的嵌合DNA片段。将该片段克隆到质粒载体 pCRII上，确定该DNA片段的碱基序列，确认碱基序列正确。将嵌合 DNA片段克隆到pCRII上，将所得的该质粒命名为pCR5JJ。
再将PCR产物no.6和PCR产物no. 8的DNA稀释100倍，各取1 pL 混合。以该混合液为模板，不加入引物，在上述条件下进行5个循环的 PCR。然后添加引物3-J1-S (SEQ IDN0.22)和3-JFH-A (SEQ IDN0.13), 再进行25个循环的PCR，由此纯化扩增的嵌合DNA片段。将该片段克 隆到质粒载体pCRII上，确定该DNA片段的碱基序列，确认碱基序列 正确。将嵌合DNA片段克隆到pCRII上，将所得的该质粒命名为pCR3JJ。
接着，将pCR5JJ用限制酶Agel和Clal、将Jl基因组cDNA用限 制酶Clal和AvrII、将pCR3JJ用限制酶AvII和Kpnl消化，将各HCV cDNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，纯化。将该三个DNA片段 与将pHH JFH1用Agel和Kpnl消化得到的载体连接。将该载体命名为 pHH Jl(C-p7)/JFH 。该表达载体pHH Jl(C-p7)/JFH的插入片段 (Jl(C-p7)/JFH; SEQIDN0.31,图12A-D)含有分别编码来自JFH1抹和 Jl抹的嵌合的5，非翻译区、来自Jl抹的核心蛋白、El蛋白、E2蛋白和 p7蛋白的DNA序列，以及分别编码来自JFH1林的NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A和NS5B蛋白和3'非翻译区的DNA序列。
pHH J1〖C-NS2VJFH1的制备
以上述JFH1基因组cDNA为模板，分別加入LA-PCR试剂盒(夕力 ，乂《^f才社)中所附带的10x緩冲液5iiL、 2.5mMdNTP混合液5^iL、 10 pM引物5-JFH曙S (SEQ ID NO.10: GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT)和 5-JFH國A2 (SEQ ID N0.1& TTGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC)各1 pL， 最后加入去离子水，使总量为49pL。接着加入1 nLTakaraLATaq(夕 力，^J才社)，然后进行PCR反应。PCR反应是以含有94°C1分钟、 64。C2分钟、72。C3分钟的步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得 PCR产物作为PCR产物no.9。
接着，以JFHl基因组cDNA为模板，分别加入LA-PCR试剂盒(夕 力，,《4才社)中所附带的10x緩冲液5nL、 2.5 mM dNTP混合液5 ^L、lOpM 引 物 3-JFH-NS3曙S (SEQ ID N0.24 : GCGAC丁CCTTGCTCCCATCACTGCTTATGC)和3-JFH-NS3-A (SEQ ID N0.25: TGGGAGACCTTGTAACAACGTCGAGTGT)各1 最后加入去离子水，使总
量为49 pL。接着加入1 nL Takara LA Taq (夕力，乂《4才社)，然后进行 PCR反应。PCR反应是以含有94。Cl分钟、64。C2分钟、72°C3分钟的 步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产物 no.10。
接着，以来自基因型lb的Jl抹的基因组RNA的cDNA (GenBank 登录号D89815、 Aizaki, H.等人.Hepatology, 27 (1998) 621-627页)为模板， 分别加入LA-PCR试剂盒(夕力，^4才社)中所附带的10x緩冲液5 nL、 2.5 mM dNTP混合液5 ^L、 10 |iM引物5-J1-S (SEQ ID N0.2(h ACCGTGCACCATGAGCACAAATCCTAAACC)和5-J1-A (SEQ ID NO.21 : AAGCGGGATGTACCCCATGAG)各1 ^L,最后加入去离子水，使总量为49 |iL。 接着加入1 pL Takara LA Taq (夕力，"、4才社)，然后进行PCR反应。 PCR反应是以含有94。C1分钟、64°C2分钟、72°C3分钟的步骤作为一 个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产物no.ll。
接着，以来自Jl林的基因组cDNA为模板，分别加入LA-PCR试 剂盒(夕力，乂《4才社)中所附带的10x緩冲液5 piL、 2.5 mM dNTP混合 液 5 pL 、 10 pM 引物 3-J1-S (SEQ ID N0.22 : CGGCTGTACATGGATGAATAGCACTGGGTT)和3-Jl-NS3國A (SEQ ID N0.26: CATAAGCAGTGATGGGAGCAAGGAGTCGCC )各1 jiL,最后力口入去离子水，使 总量为49pL。接着加入l 1iLTakaraLATaq(夕力，^M才社)，然后进 行PCR反应。PCR反应是以含有94°C1分钟、64。C2分钟、72°C3分钟 的步骤作为一个循环，进行25个循环。将所得PCR产物作为PCR产物 no. 12。
将各PCR产物进行纯化，溶解于50pL水中。将PCR产物no.9和 PCR产物no.ll的DNA稀释100倍，各取1 pL混合。以该混合液为才莫 板，不加入引物，在上述条件下进行5个循环的PCR。然后添加5-JFH-S (SEQ ID NO.10)和5-J1-A (SEQ ID N0.21)作为引物，再进行25个循环的 PCR，由此纯化扩增的嵌合DNA片段。将该片段克隆到质粒栽体pCRII 上，确定该DNA片段的碱基序列，确认碱基序列正确。将嵌合DNA片 革殳克隆到pCRII上，将所得的该质粒命名为pCR5JJ。再将PCR产物no.lO和PCR产物no.12的DNA稀释100倍，各取 lliL混合。以该混合液为模板，不加入引物，在上述条件下进行5个循 环的PCR。然后添加3-J1-S (SEQ ID N0.22)和3-JFH-NS3-A (SEQ ID N0.25)作为引物，再进行25个循环的PCR,由此纯化扩增的嵌合DNA 片段。将该片段克隆到质粒载体pCRII上，确定该DNA片段的碱基序 列，确认碱基序列正确。将嵌合DNA片段克隆到pCRII上，将所得的 该质粒命名为pCR3JJNS3。
接着，将pCR5JJ用限制酶Agel和Clal、将Jl基因组cDNA用限 制酶Clal和AvrII、将pCR3JJNS3用限制酶AvII和BspDI消化，将各 HCV cDNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分级，纯化。将该三个DNA 片段与将pHH JFH1用Agel和BspDI消化得到的载体连接。将该载体命 名为pHH J1(C-NS2)/JFH。该表达载体pHH J1(C-NS2)/JFH的插入片段 (J1(C-NS2)/JFH; SEQ ID N0.32,图13A-D)含有分别编码来自JFH1 抹和Jl抹的嵌合的5，非翻译区、来自Jl抹的核心蛋白、El蛋白、E2 蛋白、p7蛋白和NS2蛋白的DNA序列，以及分别编码来自JFH1抹的 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A和NS5B蛋白以及3，非翻译区的DNA序列。
各表达载体克隆的图谱如图1C所示。
细胞内HCV RNA合成的确认
使用Fugene6 (口 〉二社)，按照所附说明书，将实施例1中制备的 pHH JFH1和pHH JFH1/GND导入到Huh7和HepG2细胞中。24小时后， 通过Isogen(日本^一7社)，按照所附说明书，由各细胞制备RNA。
以这些RNA为模板，如下通过RACE法确认是否由pHH JFH1和 pHH JFH1/GND合成了 HCV RNA。
通过T4RNA连接酶(Takara社)，使用所附緩沖液，将2pg上述制 备的RNA 和2.5pM RNA 接头(SEQ ID NO.l : GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA )连接。接着， 以连接有RNA接头的RNA为模板，使用与HCV RNA互补的引物(SEQ ID N0.2: gtaccccatgaggtcggcaaag)，通过反碑争录酶Superscript III (^f》匕'卜 口r工7社)，按照所附说明书合成cDNA。
接着，以合成的上述cDNA为模板，使用5，末端RNA接头的正义引物(SEQ ID N0.3: GCTGATGGCGATGAATGAACACTG)和3'末端的反义引物 (SEQIDN0.4: gaccgctccgaagttttccttg)两种引物，通过PCR扩增DNA。再 以扩增的DNA为模板，使用含有扩增的DNA内侧序列的5'末端的引物 (SEQ ID N0.5: GMCACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG)和3'末端的引物(SEQ ID N0.6: cgccctatcaggcagtaccacaag)的引物对进行第二次PCR。该PCR是使 用市售的试剂盒Ex Taq (Takara)，在96。C加热处理5分钟，然后以96°C 1 分钟、55"C1分钟、72。C2分钟的反应循环进行35个循环，之后在4°C 下保存。接着，为了确认是否得到了上述第二次的PCR产物，将反应液 的一部分通过琼脂糖凝胶电泳确认。结果(图2),在Huh7细胞和HepG2
况。并且，将第二次的PCR产物克隆到pGEM-TE:sy (Promega社)载体 中。在所得质粒DNA中克隆的DNA碱基序列用DNA测序仪(ABI PRISM 377)确定。结果，由pHH JFH1和pHH JFH1/GND转录的HCV RNA的5， 末端序列与HCV基因组的5'末端相同。图3中给出了由pHHJFHl转录 的HCV RNA的5，末端和接头序列。
细胞内的HCV蛋白质表达的确认
在导入了 pHHJFHl、 pHHH77c和pHHJFHl/GND的细胞中，确认 转录之后是否发生了 HCV蛋白质的翻译。
使用Fugene6 (口 i>工社)，按照所附说明书，将pHH JFH1 、pHH H77c 和pHH JFHl/GND导入到Huh7细胞中。培养4天后，按照常规方法制 备细胞提取液。接着，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法对这些提取液中 的蛋白质进行分析。分析时，将含有核心基因的表达质粒DNA瞬时转 染Huh7细胞，以所得细胞提取液作为阳性对照。并且，将由未转染的 Huh7细胞得到的细胞提取液作为阴性对照。将由各细胞克隆提取的试 样进行SDS-PAGE后，转印PVDF膜(Immobilon-P, Millipore社制)，使 用抗核心特异性抗体(兔多克隆抗体)、以及小鼠单克隆抗体(Austral社) 和识别这些抗体的HRP标记二次抗体作为抗NS5A抗体，通过ECL(7
t ^厶7 7Vk7 、:> 7社)检测在细胞内被翻译的核心蛋白和NS5A蛋 白。
结果如图4所示，在导入了 pHHJFHl的细胞中，可见核心和NS5A蛋白的表达。但在导入pHH H77c和pHH JFH1/GND的细胞中未检测出 这些蛋白质的表达。由该结果可认为，在导入了 pHH JFH1的细胞中， 由pHH JFH1转录为RNA之后，该RNA在细胞内复制，然后发生蛋白 质的翻译，达到了蛋白质可检测的水平，而在导入了 pHHJFHl/GND的 细胞中，由pHH JFH1/GND转录RNA后，该RNA变异为NS5B,因此 在细胞内无法复制，未达到可检测蛋白质的水平。另一方面，HCV基因 组RNA虽然在培养细胞中自主复制(">1& Lemon ST.， J. Virol" 78 (2004) 7904-7915页)，但在pHHH77c中未能检测HCV蛋白的表达的原 因尚不明确。
下面，对于在什么样的细胞林中表达HCV蛋白进行研究。使用 Fugen6 (口 、〉 -社)，按照所附说明书，将pHH JFH1和pHH JFH1/GND 与GFP表达载体(pGreenLantern:Life Technologies Inc.)—起导入到Huh7、 RCYM1RC、 5-15RC、 HepG2和293T细胞中。导入4天后，通过焚光 显微镜观察GFP的表达，确认导入到各载体中后，由各细胞制备细胞提 取液。接着，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法对这些提取液中的核心蛋 白进行分析。核心蛋白的检测是使用抗核心特异性兔多克隆抗体和识别 该抗体的HRP标记二次抗体，通过ECL (7* "T 、〉々厶7 7 i> 7*社) 进行。结果如图5所示，在Huh7、 RCYM1RC、 5-15RC、 HepG2细胞中 ^r测出了核心蛋白。 HCV颗粒的生成
接着，为了确认是否由pHHJFHl导入细胞生成了 HCV颗粒，对培 养上清中的核心蛋白进行分析。作为pHH JFH1和对照，使用Fugene6, 向HepG2细胞中导入表达核心、El、 E2和p7的载体pCAG327JFHl， 2 天后除去培养上清，加入新鲜的培养基，再培养两天。接着回收细胞和 培养液，由细胞提取蛋白质，按照实施例3所示的方法对细胞中的核心 蛋白的表达进行分析。结果确认了核心蛋白的表达(图6A)。为了确认培 养液中HCV颗粒的存在，通过蔗糖密度梯度对培养液进行分级。在 10-60% (重量/重量)的密度梯度蔗糖溶液(溶解于50 mM Tris pH 7.5/0.1 M NaCl/1 mM EDTA中)再铺0.2 mL样品的培养上清。将其用《少夕t 7口一夕一SW41E、以35,000 RPM、 4。C离心16小时，离心结束后，从离心管底将各级分回收0.5 mL。对各级分的密度、HCV核心蛋白浓 度进行定量。HCV核心蛋白的测定是使用才一y HCV抗原IRMA测试仪 进行(Aoyagi等人.，J. Clin. Microbiol., 37 (1999) 1802-1808页)。
如图6B所示，在1.15 U8mg/mL的级分中可见核心蛋白的峰。与 此相对，在表达核心、El、 E2和p7的细胞中未观察到核心蛋白的峰。
存在于1.15-1.18 mg/mL级分中的核心蛋白和HCV RNA如果形成 HCV颗粒，则应该对表面活性NP40的处理具有感受性。因此，将pHH JFH1导入HepG2中，将2~4天的培养液用0.2%的NP40处理20分钟， 然后通过蔗糖密度梯度分级。如图7所示，通过进行NP40处理，在1.20 mg/mL的级分中可见核心蛋白的峰。即，含有脂质的比重轻的表面膜由 于NP40而从病毒颗粒上剥离，形成未保持类病毒结构的核酸和只有核 心蛋白的核心颗;险，比重变重。
由以上结果可以确认，通过将pHHJFHl导入HepG2细胞，由HCV 基因组cDNA转录病毒RNA后，发生病毒蛋白的合成和病毒RNA的复 制，形成病毒颗粒，分泌到培养液中。
HCV颗粒的感染性确认
对实施例4所得的HCV颗粒是否具有感染性进行研究。使用 Fugene6将pHH JFH1导入到Huh7细胞和HepG2细胞中，将培养3 5 天的培养上清用超滤膜(截留分子量lxl05Da)浓缩30倍。接着，在IOO 浓缩的含有HCV颗粒的培养液中将Huh7.5.1细胞在15 mm盖玻片上 培养，4天后，将细胞用抗NS5A抗体焚光染色。记数抗NS5A抗体染 色阳性，即感染细胞数，结果如图8所示，可见部分感染细胞。由这些 结果可知，通过将pHH JFH1导入到Huh7或HepG2细胞中，分泌到培 养液中的HCV颗粒具有感染的能力。
感染性HCV颗粒产生细胞抹的获得
利用上述实施例所示的系统，尝试建立持续生产感染性HCV颗粒 的细胞株。
将pHH JFH1用Nhel消化，将pSV40/Zeo2 (Invitrogen)用Nhe I和Xbal消化，获得SV40启动子，在SV40启动子下游连接Zeocin抗性基 因，再在其下游连接附加有SV40 polyA的信号，将所得的表达单元(SV40 启动子/Zeo/polyA)整合到上述pHH JFH1用Nhel消化的位点，制备栽体。 将该载体命名为pHH/ZeoJFHl (图9)。
通过Fugene6,将pHH/ZeoJFHl导入到HepG2细胞中。用含有Zeocin 的培养基培养。然后每周更换两次培养液，用含有Zeocin的培养基继续 培养。上述培养21天后，由培养皿克隆存活细胞的细胞集落，继续培 养。通过上述集落的克隆获得了 100个细胞克隆。这些克隆的培养上清 中的核心蛋白质量是使用才一乂 HCV抗原IRMA测试仪进行(Aoyagi等 人.，J. Clin. Microbiol., 37 (1999) 1802-1808页)，筛选出核心蛋白表达量 多的克隆HepG2/No59细胞。
使用10cm的培养皿，用8mL的培养基培养2xl()6个HepG2/No59 细胞。48小时后回收培养上清。
测定培养上清中的核心蛋白，结果可以确认HepG2/No59细胞产 生了 1，400 fmol/L的核心蛋白。
由培养上清制备RNA,由该RNA进行HCV基因组RNA量的测定。 HCV RNA的定量RT-PCR检测是按照Takeuchi等人的方法(Takeuchi T 等人.，Gastroenterology, 116(1999) 636-642页)，检测HCV RNA的5，非 翻译区的RNA来进行。具体来说，使用以下的合成引物和EZrTthRNA PCR试剂盒(Applied Biosystems),对由细胞提取的RNA中所含的HCV RNA进行PCR扩增，通过ABI Prism 7700测序系统(Applied Biosystems) 检测。探针
R6—130—S17:5，—CGGGAGAGCCATAGTGG—3'(SEQ ID No. 7 )
R6-290-R19:5'-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3， (SEQ ID No. 8 )
TaqMan探针，R6-148-S21FT:5,-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (SEQ ID No. 9 )
结果可知，HepG2/No59细胞培养上清中的HCV RNA为6.^108拷 贝/mL。该产生量比目前报道的量高约60倍。
进一步使用超滤膜(截留分子量lx105 Da)，将HepG2/No59细胞培 养上清浓缩30倍，用100nL浓缩的含有HCV颗粒的培养液，在15mm 盖玻片上培养Huh7.5.1细胞，4天后，将细胞用抗NS5A抗体免疫染色。结果，可检测出抗NS5A抗体染色阳性、即感染细胞。由以上可以确认， 分泌到HepG2/No59细胞培养液中的HCV颗粒具有感染能力。
表达栽体导入栽体3天后的核心蛋白质量
(fmol/L)
未导入0
p冊JFH1252.164
pHH J6(C-p7)/JFHl2272. 878
p朋H77c(C-p7)/JFHl29. 555
p朋Jl(C-p7)/JFHl0.403
pHH J1(C-NS2)/JFH111,004
法导入到Huh7.5.1细胞中，将导入3天后的培养上清用超滤膜(截留分 子量lxl()SDa)浓缩。加入100^L浓缩的含有HCV颗粒的培养上清，将 Huh7.5.1细胞在15mm盖玻片上培养，4天后用抗NS5A抗体进行免疫染色。结果，用由导入了 pHH J6(C-p7)/JFHl的细胞得到的培养上清处 理的细胞中可见被抗NS5A抗体强烈染色的细胞。另一方面，用由导入 了 pHH Jl(C-p7)/JFHl的细胞得到的培养上清处理的细胞中，与pHH J6(C-p7)/JFHl比较，抗NS5A抗体染色强度弱，但与对照细胞比较则明 显被染色。以上表明，导入了 pHH J6(C-p7)/JFHl和pHHJl(C-p7)/JFHl 的细胞中产生了感染性HCV。
4妄照实施例6所示的方法，向pHH Jl(C-p7)/JFHl中插入Zeocin抗 性基因表达单元，制备pHH/Zeo Jl(C-p7)/JFHl。接着，将pHH/Zeo Jl(C-p7)/JFHl导入Huh7.5.1，得到在含有Zeocin的培养基中增殖、可 稳定表达病毒颗粒的细胞。将8mL该细胞的培养上清用超滤膜(截留分 子量lxl()SDa)浓缩。该浓缩的培养上清中的HCV核心蛋白质量是2365 fmol/L。使用100pL该浓缩培养上清，使Huh7.5.1感染，4天后将细胞 用抗NS5A抗体免疫染色。结果，由导入了 pHH/Zeo Jl(C-p7)/JFHl的稳 定表达性细胞得到培养上清，在用该培养细胞处理的细胞中可见被抗 NS5A抗体强烈染色的细胞。由此表明由本细胞产生了感染性HCV。
HCV。
序列表自由文本
SEQ ID NO. 1的序列表示合成RNA。
SEQ ID N0.2 SEQ ID N0.9的序列表示合成DNA。
SEQ ID NO. 10~26的序列表示引物。
SEQ ID N0.29~32的序列表示嵌合DNA。
SEQ ID N0.33 45的序列表示合成DNA。
权利要求
1.生产感染性丙型肝炎病毒(HCV)颗粒的方法，该方法包含将以下的i)或ii)的表达载体导入由Huh7、RCYM1RC、5-15RC、HepG2以及由这些细胞派生的细胞株中选择的细胞中的步骤i)含有下述DNA的表达载体，该DNA在RNA聚合酶I启动子的下游含有编码来自HCV株的5’非翻译区、核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白的DNA序列，和编码来自HCV JFH1株的NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白以及3’非翻译区的DNA序列，并且在其下游含有RNA聚合酶I终止子；或者ii)含有下述DNA的表达载体，该DNA在RNA聚合酶I启动子的下游含有编码来自HCV株的5’非翻译区、核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白的DNA序列，和编码来自HCV JFH1株的NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白以及3’非翻译区的DNA序列，并且在其下游含有RNA聚合酶I终止子。
2. 权利要求l所述的方法，其中，上述HCV抹是基因型1或基因 型2的HCV株。
3. 权利要求2所述的方法，其中，上述基因型1的HCV抹选自 H77c林、l抹、H抹、HC-J1抹、Jl株、conl抹、TH株、J抹、JT株、 BK林。
4. 权利要求2所述的方法，其中，上述基因型2的HCV株选自J6CF 抹、JFH1株、JCH1林、HC-J8抹。
全文摘要
本发明涉及生产感染性丙型肝炎病毒(HCV)颗粒的方法，该方法包含将含有以下DNA片段的表达载体导入到可接受HCV增殖的细胞中的步骤，其中所述DNA片段在RNA聚合酶I启动子的下游含有编码HCV的5’非翻译区和结构蛋白以及任意非结构蛋白的DNA序列、以及编码来自HCV JFH1株的非结构蛋白和3’非翻译区的DNA序列，并且在其下游含有RNA聚合酶I终止子。
文档编号C12N15/09GK101321865SQ200680044939
公开日2008年12月10日 申请日期2006年9月29日 优先权日2005年9月30日
发明者宫村达男, 曾根三郎, 田边纯一, 石井孝司, 胁田隆字, 铃木亮介, 铃木哲朗 申请人:日本国立感染症研究所;财团法人东京都医学研究机构;东丽株式会社