专利名称：：抑制人类免疫缺陷病毒(hiv)感染的方法和组合物的制作方法
技术领域：
：本发明一般涉及HIV感染的抑制。更具体地，本发明涉及新的HIV相互作用宿主因子的鉴定，并涉及使用这些宿主因子鉴定抑制HIV感染的新化合物的方法。
背景技术：
：人类免疫缺陷病毒(HIV)是属于逆转录病毒科的慢病毒。据估计，世界上有多达90%的艾滋病例是通过性接触和怀孕途径传播HIV的。当接触到传染性体液(如精液、阴道分泌物或血液)时，这种传播通过穿过性器官或胎盘粘膜屏障引发。其余的艾滋病例是由于输入HIV污染的血液、静脉注射吸毒者共用针头、在侵入性的过程中意外接触到HIV污染的体液以及传染性病毒能够直接接触易感性人组织的其它情况。目前用来治疗HIV感染和艾滋病的药物不能令人满意。当以有效药用浓度使用治疗HIV感染的普通药物(如AZT或HIV蛋白酶抑制剂)时，它们的毒性或不良副作用与其抗病毒活性是不相容的。由于病毒基因组的高突变能力，病毒^f艮快就会产生对当前药物的抵抗性并且在群体中扩散。因此，在本领域中仍然需要更好的用于预防和治疗艾滋病和HIV感染的备选化合物和新的治疗靶标。本发明解决了这种需要以及其它需要。发明概述在一方面，本发明提供了抑制HIV感染的试剂的鉴定方法。这些方法包括筛选受试化合物以鉴定一种或多种调节化合物，所述调节化合物下调由选自表2-4中所列的多核苷酸编码的HIV相互作用宿主因子的生物学活性或表达水平，然后检查鉴定到的调节化合物抑制HIV感染的能力。在一些方法中，所使用的HIV相互作用宿主因子是三十四肽重复序列1(IFIT1)、磷脂酰肌醇转移蛋白oc(PITPNot)或者混合语系激酶3(MLK3)。一些方法使用MLK3，并筛选受试化合物抑制MLK3激酶活性或其表达的能力。在一些方法中，通过监测报道基因在HIVLTR启动子控制下在HIV感染细胞中的表达来检查调节化合物抑制HIV感染的能力。例如，HIV感染的细胞可以是表达l3-半乳糖苷酶报道基因的Hela-CD4-0gal细胞。在一些方法中通过HIV-IIIb病毒林感染细胞。在一些其它方法中，通过比较接触调节化合物的人工改造的HIV允许细胞和没有接触调节化合物的对照细胞中的HIV复制来检查调节化合物抑制HIV-1感染的能力。在一些方法中，所使用的HIV允许细胞是Hela-T4-PGalHIV细胞。在一些方法中，通过p24抗原酶联免疫吸附测定或反转录酶活性测定来监测HIV复制。在一些其它方法中，通过比较使用化合物处理的宿主细胞和不使用化合物处理的对照宿主细胞中的假病毒产生来检查化合物抑制HIV感染的能力。在一些方法中，所使用的宿主细胞是293THEK细胞。在一些方法中，使用能够在细胞中产生HIV假病毒的假病毒质粒转染宿主细胞。一些筛选方法使用的HIV相互作用宿主因子是酶。在这些方法中，所测定的生物学活性通常是酶活性。一些方法使用的HIV相互作用宿主因子是激酶，如MLK3。在另一方面，本发明提供了抑制受试者体内HIV感染的方法。这些方法包括对受试者施用包含抑制HIV相互作用宿主因子的生物学活性或表达有效量的化合物的药物组合物。HIV相互作用因子由选自表2-4中所列的多核苷酸编码。一些方法中使用抑制三十四肽重复序列l(IFITl)、磷脂酰肌醇转移蛋白oc(PITPNoc)或者混合i瞽系激酶3(MLK3)的生物学活性或表达的化合物。一些方法中使用的治疗化合物抑制MLK3的激酶活性，如K252a或CEP1347。通过参考说明书和权利要求书的其余部分可以进一步理解本发明的性质和优点。附图简述图1显示无激酶活性的MLK3(K144R)对HIV感染HeLaCD40gal细月包的影响。4吏用编码野生型MLK3、无、激酶活性的MLK3(K144R)的cDNA，或者对照质粒以及HIV-LTR控制下的萤光素酶报道基因共转染细胞，24小时后以HIV-IIIb感染。3天后通过^f吏用BriteGlo测量萤光素酶活性来评估感染。无激酶活性的突变体不能增加感染，这突出显示出激酶功能对于从野生型MLK3中观察到的增加是必需的。数据显示为相对于阴性对照质粒的增加倍数，并且是四个独立测定的概括，每种测定重复两次。图2显示MLK3过表达对HIV转录的影响。以作为对照，使用编码野生型MLK3的cDNA或对照质粒(pcDNA3)以及HIV-LTR控制下的萤光素酶报道基因(LTRLuc)和Tat表达载体(Tat)或对照载体Sport6-GFP(S6G)共转染HeLaCD4|3gal细胞，以评估依赖或不依赖于Tat的转录。2天后通过使用BriteGlo测量萤光素酶活性来评估转录。MLK3的表达增加了荄光素i^农赖于Tat的转录，但是对不依赖于Tat的转录影响极小。数据显示为MLK3(如MLK3/Tat/LTRLuc)相对于阴性对照质粒(如pcDNA3/Tat/LTRLuc)的平均增加倍数，并且是两种独立测定的概括，每种测定重复两次。图3A-3D显示针对MLK3的siRNA抵抗HIV感染的效力。A:转染入HeLaCD4Pgal细胞的单个MLK3siRNA对HIV感染的影响；B:靶定MLK3的siRNA引起的HeLaCD4Pgal细胞内源性MLK3水平的显著耗尽；C:通过电穿孔入Jurkat细胞的单个MLK3siRNA对HIV感染的影响；D:针对MLK3的siRNA引起的Jurkat细胞中内源性MLK3水平的耗尽。数据显示为相对于对照GL2siRNA偏差的感染抑制或细胞毒性百分比，是至少三个独立实验(每个实验有12个重复孔)的平均值+/-标准差。详述I.概述下文的实施例中所详细描述，本发明人使用Hela-CD4-egal细胞和HIV-IIIb筛选了集中的siRNA文库(Qiagen)和代表15,000个独特基因的cDNA文库(Origene)。选择来自siRNA筛选命中的96个基因(其击倒能抑制HIV感染)进行后续研究。这些包括两种已知的HIV相互作用宿主因子Furin和Rad23。另一个通过筛选鉴定的命中是Pak3，它在美国临时专利申请号60/650,789中被公开。几乎所有选中的siRNA命中在最初的测定中被重新证实，但是62.5%具有严重毒性。在最初的96个命中中，36个被重新证实，并且显示出比它们在HeLa-CD4-Pgal细胞中的毒性效应更强的抗HIV的效力。这些命中如表2所示。在cDNA筛选中，选择HIV感染的89个增强子进行后续研究，包括检查额外的cDNA制备物以及序列确认。在这89个命中中，13个在重新确认过程中都继续显示出HIV感染的增强。这些确认的命中如表3所示。本发明人还通过酵母双杂交筛选鉴定到了另外一些可能在HIV感染过程中起作用的宿主因子。如下文的实施例4所详细描述，本发明人^f吏用HIV-1HXB2Vpr作为诱斜，篩选了克隆入GAL4表达载体(Clontech)的人白细胞cDNA文库，以鉴定新的相互作用宿主细胞因子。Vpr是一种HIV辅助蛋白质，它对于在单核细胞和巨噬细胞中的病毒复制是必需的，并增加在T细胞和T细胞系中的病毒复制。使用滤器举起测定法(filterliftassay)测定来自筛选的阳性集落的P-半乳糖苷酶活性以进一步证实蛋白质_蛋白质相互作用。从筛选中鉴定到的一种Vpr相互作用配偶体为异肽酶T(IsoT)，其详细信息公布于美国临时专利申请号60/673,623。其它的筛选7命中如本文表4所示。通过siRNA筛选、cDNA筛选和酵母双杂交筛选所鉴定的宿主分子在本文称为"HIV相互作用宿主因子"。这些宿主因子可以在HIV感染的各个阶段起非常重要的作用。它们还可以提供能够用于筛选抑制HIV感染的化合物的新靶标。接下来的部分提供使用这些宿主因子鉴定新的抗-HIV试剂的进一步指南。II.定义除非另有定义，本文所用的技术和科学术语和本发明所属领域的一般技术人员通常的理解具有相同的含义。下面的参考文献给技术人员提供了本发明所使用的4艮多术语的一般定义OxfordDictionaryofBiochemistryandMolecularBiology,Smithetal.(eds.)，OxfordUniversityPress(修订版,2000);DictionaryofMicroBiologyandMolecularBiology,Singletonetal.(Eds.)，JohnWiley&Sons(第三版，2002);和ADictionaryofBiology(OxfordPaperbackReference),MartinandHine(Eds.)，OxfordUniversityPress(第四版，2000)。此外，提供如下定义以帮助读者实施本发明。术语"试剂"包括任何物质、分子、元素、化合物、实体或其组合。它包括但不限于，例如蛋白质、多肽、小有机分子、多糖、多核苷酸等等。它可以是天然产物、合成化合物，或者化合物，或者两种或多种物质的组合。除非另有说明，术语"试剂"、"物质"和"化合物，，可以互换使用。本文所用的术语"类似物，，指在结构上与参考分子类似，但是通过用备选取代团取代参考分子中的特定取代基，以定向和可控制的方式修饰的分子。本领域中的技术人员期望类似物与参考分子相比表现出相同、类似或改良的用途。为了鉴定具有改良特征(如对目标分子的更高的结合亲和性)的已知化合物的变体，类似物的合成与篩选是制药化学中的一种公知的方法。如本文所使用地，"接触"有其普通含义，指组合两种或多种分子(例如，试剂和多肽)，或者种分子与细胞(例如试剂和细胞)。接触可以在体外发生，例如在试管或其它容器中组合两种或多种试剂，或者组合试剂和细胞或细胞裂解物。接触还可以发生在细胞内或原位，例如通过在细胞内共表达编码两种多肽的重组多核苷酸，在细胞内或细胞裂解物中接触这两种多肽。本文所用的"异源序列"或"异源多核苷酸"是来自特定宿主细胞外源的序列，或者来自同源但是与初始形式相比受到改变的序列。因此，宿主细胞内的异源多核苷酸包括宿主细胞内源的被改变的多核苷酸。异源序列的改变可以通过诸如如下方式产生使用限制酶处理多核苷酸从而产生能够有效连接到启动子上的多核苷酸片段。诸如定点诱变的技术也可用于改变异源多核苷酸。当提及蛋白质和/或蛋白质序列时，术语"同源，，指它们天然或人工地来源于共同的祖先蛋白质或蛋白质序列。类似地，当核酸和/或核酸序列天然或人工地来源于共同的祖先核酸或核酸序列时，它们是同源的。通常由两个或多个核酸或蛋白质(或其序列)之间的序列相似性来推断同源性。用不同而不同，但是常规仅仅使用25%序列相似性来建立同源性。也可以用更高水平的序列相似性(例如，30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%或更高)来建立同源性。本文所用的"宿主细胞"指异源多核苷酸(例如表达载体)导入的原核或真核细胞。异源多核苷酸可以通过任何方式(例如，转染、电穿孔、磷酸钓沉淀、微注射、转化、病毒感染等等)导入宿主细胞。术语"HIV相互作用宿主因子"指本发明人所鉴定的在促进HIV感染或生命周期中起作用的宿主基因或它们编码的多肽。如表2-4所示，这些因子包括其击倒导致抑制HIV复制的宿主分子和其过表达导致增强HIV感染的分子。此外，此术语还包括在物理上与HIV病毒感染必需的HIV辅助蛋白质Vpr相互作用的宿主因子。两个核酸序列或氨基酸序列背景下的术语"序列同一性"指当在特定的比较窗口中比对产生最大一致性时这两个序列中相同的残基。"比较窗口"指至少大约20个、通常大约50到约200个、更通常大约100到150个连续位置的区段，在其中可以最优比对两个序列后将一个序列与参考序列的相同数目的连续位置相比较。序列比对方法在本领域中是众所周知的。可以通过Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.8:443的比对算法、Pearson和Lipman(1988)Proc,Nat.Acad.SciU.S.A.85:2444的相似性搜索方法、这些算法的计算机实现(包括但不限于Intelligentics，MountainView，CA的PC/Gene程序中的CLUSTAL，以及WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup(GCG)，575ScienceMadison博士,Wis.，U.S.A.中GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA或TFASTA)进行序列的最优比对。还可以通过检视和手动比对进行比对。"实质同一的"核酸或氨基酸序列指使用上文所描述的程序(例如BLAST)用标准参数计算得到的与参考序列具有至少90%序列同一性的核酸或氨基酸序列。序列同一性优选至少95%，更优选至少98%，最优选至少99%。优选地，实质同一性存在于至少大约50个残基长的序列区域，更优选至少大约100个残基长的区域，最优选地，序列的至少大约150个残基是实质同一的。在最优选的实施方案中，序列在编码区全长上是实质同一的。关于参考蛋白质或其片段的生物学活性的术语"调节"是指此蛋白质的表达水平或其它生物学活性的改变。例如，调节可以引起参考蛋白质表达水平、蛋白质的酶促修饰(例如磷酸化)、结合特性(例如，与靶标多核苷酸的结合)或者参考蛋白质的其它任何生物学、功能性或免疫性质的增加或减小。例如，活性的改变可以由编码参考蛋白质的一个或多个基因表达的增加或减小引起，或者由编码此蛋白质的mRNA的稳定性引起，或者由参考蛋白质的翻译效率或其它生物学活性的改变引起。这种改变还可以是由于调控参考蛋白质的另一分子(例如，使参考蛋白质磷酸化的激酶)的活性引起。对参考蛋白质的调节可以是上调(即激活或刺激)或下调(即抑制或阻抑)。参考蛋白质的调节子作用方式可以是直接的，例如通过与这个蛋白质或编码它的基因结合，也可以是间接的，例如通过结合和/或修饰(例如，酶促修饰)调节参考蛋白质的另一个分子。术语"受试者"包括哺乳动物，尤其是人。此外它还包括其它非人类动物，如奶牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴子。参考分子的"变体"指在结构和生物学活性上与整个参考分子或其片段基本类似的分子。因此，假如两个分子具有类似的活性，那么即使其中一个分子与另一个分子的组成或二级、三级或四级结构不同，或者氨基酸残基序列不同，也可以把它们认为是如此处所用的术语变体。ffl,筛选HIV感染的新调节子-一般方案本发明人鉴定的HIV相互作用宿主因子为筛选抑制HIV感染的化合物提供了新的靶标。可以使用本领域中各种众所周知的生物化学与分子生物学技术或测定来实施本发明。这些技术描述于，例如，HandbookofDrugScreening,Seethala等人(编辑)，MarcelDekker(第一版，2001);HighThroughputScreening:MethodsandProtocols(MethodsinMolecularBiology,190)，Janzen(编辑)，HumanaPress(第一版，2002);CurrentProtocolsinImmunology,Coligan等人(编辑)，JohnWiley&SonsInc(2002);Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress(第三版，2001);以及Brent等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons公司(ringbou编辑，2003)。一般地，首先筛选试剂对表2-4中所示的多核苷酸编码的HIV相互作用宿主因子的生物学活性的调节能力("笫一步测定步骤")。然后通常在存在HIV相互作用宿主因子的情况下，进一步筛选鉴定到的调节剂抑制HIV感染的能力("第二步检查步骤，，)。取决于方法中所使用的HIV相互作用宿主因子，可以在第一步中测定HIV相互作用宿主因子不同生物学活性的调控。例如，可以测定试剂与HIV相互作用宿主因子的结合。可以测定试剂调节HIV相互作用宿主因子表达，例如，转录或翻译的活性。还可以测定试剂调节HIV相互作用宿主因子的表达或细胞内水平，例如，翻译后4务饰或蛋白酶解的活性。在第一步测定步骤中可以筛选试剂对HIV相互作用宿主因子的生物学活性的上调或下调能力。一旦鉴定到抑制HIV相互作用宿主因子的试剂，通常要进一步检查其抑制HIV感染的能力。经常需要这种进一步的检查步骤以证实它们对HIV相互作用宿主因子的调节作用确实会引起对HIV感染的抑制。例如，需要进一步检查抑制表2-4所示的HIV相互作用宿主因子生物学活性的试剂，以确定这种调节可以导致抑制或降低HIV感染。在第一步测定步骤和第二步检查步骤中，可以使用完整的HIV相互作用宿主因子或其片段。还可以使用具有与HIV相互作用宿主因子实质同一的序列的分子。在篩选中还可以类似地使用HIV相互作用宿主因子的类似物或功能衍生物。在这些测定中可以使用的片段或类似物通常保留HIV相互作用宿主因子的一种或多种生物学活性(例如，如果在第一步测定步骤中使用的HIV相互作用宿主因子是激酶，那么保留激酶活性)。还可以使用包含这些片段或类似物的融合蛋白来筛选试剂。HIV相互作用宿主因子的功能衍生物通常会有氨基酸缺失和/或插入和/或置换，但是保持一种或多种生物活性，因此它们也可用于实践本发明的筛选方法。可以通过对HIV相互作用宿主因子进行蛋白酶解裂解，然后使用本领域的技术人员所周知的常规纯化程序制备功能衍生物。备选地，可以通过只表达保留HIV相互作用宿主因子一种或多种生物活性的HIV相互作用宿主因子片段的重組DNA技术来制备功能衍生物。IV.受试化合物使用本发明的方法可以筛选的试剂或化合物包括多肽、P-转角模拟物、多糖、磷脂、激素、前列腺素、类固醇、芳香族化合物、杂环化合物、苯并二氮杂萆、寡聚N-取代的甘氨酸、寡聚氨基甲酸酯、多肽、糖、脂肪酸、类固醇、噤呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合。一些试剂是成分子，其余为天然分子。试剂取自多种来源，包括合成或天然化合物文库。可以以逐步方式合成，为多种类型^:合物产生组合文库。可以通过WO95/12608、WO93/06121、WO94/08051、WO95/35503和WO95/30642中所描述的编码合成文库(ESL)方法构建化合物大的组合文库。也可以通过噬菌体展示方法(参见，例如，Devlin,WO91/18980)产生肽文库。可以从商业来源获取或者在本领域收集得到细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库。已知的药学试剂可以进行直接或随机化学修饰，如酰化、烷基化、酯化、酰胺化，从而制备结构类似物。肽或其它化合物的组合文库可以是完全随机的，在任何位置都没有序列偏好性或恒定的。或者组合文库可以是有偏向性的，即序列内的一些位置保持不变或者选自有限数目的可能性。例如，在一些情况下，核苷酸或氨基酸残基在一个确定的类(如疏水性氨基酸、亲水性残基、立体偏好性(小的或大的)残基、倾向于形成用于交联的半胱氨酸、用于SH-3结构域的脯氨酸、用于磷酸化位点的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或组氨酸，或者嘌呤)中是随机化的。试剂可以是天然产生的蛋白质或其片段。可以从天然来源(例如细胞或组织裂解物)获得这种试剂。还可以通过诸如商品途径或常规方法产生的cDNA文库制备多肽试剂文库。试剂还可以是肽，例如大约5到大约30个氨基酸的多肽，优选5大约到大约20个氨基酸，尤其优选大约7到大约15个氨基酸。肽可以是天然产生的蛋白质的消化产物、随机肽或"偏向性"随机肽。在一些方法中，试剂是多肽或蛋白质。试剂还可以是核酸。核酸试剂可以是天然产生的核酸、随机核酸或"偏向性"随机核酸。例如，可以像上文描述蛋白质时那样类似地使用原核或真核基因组的消化产物。在一些优选的方法中，试剂是小分子有机化合物，如分子量不大于大约1000或不大于大约500的化合物。优选地，改造并使用高通量测定来筛选这种小分子。在一些方法中，可以容易地使用上文所描述的小分子试剂的组合文库来筛选抑制HIV感染的小分子化合物。许多测定可用于这种篩选，例如描述于Schultx(1998)BioorgMedChemLett8:2409-2414;Weller(1997)Mo1Divers3:61-70;Fernandes(1998)CurrOpinChemBiol2:597-603;以及Sittampalam(1997)CurrOpinChemBiol1:384-91。还可以基于上文讨论的HIV相互作用宿主因子或其片段的结构研究产生将要使用要求保护的方法筛选的试剂文库。这种结构研究容许鉴定更可能与HIV相互作用宿主因子相结合的试剂。可以通过多种方式(例如，晶体结构和分子建模)研究HIV相互作用宿主因子的三维结构。使用X射线晶体学研究蛋白质结构的方法是本领域公知的。参见PhysicalBio-chemistry,VanHolde，K.E.(Prentice-Hall，新泽西1971)，221-239页,以及PhysicalChemistrywithApplicationstotheLifeSciences,D.Eisenberg&D.C.Crothers(BenjaminCummings，MenloPark1979)。HIV相互作用宿主因子结构的计算机建模提供了设计筛选HIV感染调节子的试剂的另一种方法。分子建模的方法在文献中有所描述，例如，标题为"Systemandmethodformolecularmodelingutilizingasensitivityfactor"的美国专利号5,612,894，以及标题为"Molecularmodelingmethodandsystem"的美国专利号5,583,973。此外，还可以通过中子衍射和核磁共振(NMR)确定蛋白质结构。参见，例如，PhysicalChemistry,第四版Moore，W.J.(Prentice-Hall，新泽西1972)，以及NMRofProteinsandNucleicAcids,K.Wuthrich(Wiley-Interscience，纽约1986)。本发明的调节子还包括与表2-4中的HIV相互作用宿主因子特异性结合的抗体。这些抗体可以是单克隆或多克隆抗体。这些抗体可以使用本领域众所周知的方法产生。例如，非人单克隆抗体(如小鼠或大鼠源)可以通过使用表2-4中的HIV相互作用宿主因子或其片段免疫动物产生(参见Harlow和Lane,Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,第三版，2000)。可以从天然来源、通过肽合成或重组表达获得这种免疫原。可以通过重组DNA技术将非人抗体的CDR区连接到人抗体的恒定区产生小鼠抗体的人源化形式。参见Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，10029-10033(1989)和WO90/07861。可以4吏用噬菌体展示方法获得人抗体。参见，例如，Dower等人，WO91/17271;McCafferty等人，WO92/01047。在这些方法中，制备噬菌体文库，其中成员在其外表面展示不同的抗体。抗体通常展示为Fv或Fab片段。通过表2-4种HIV相互作用宿主因子的亲和富集选择具有期望特异性的噬菌体展示抗体。还可以从具有编码人免疫球蛋白基因座的至少一个区段和失活的内源性免疫球蛋白基因座的转基因的非人转基因哺乳动物制备抗HIV相互作用宿主因子的人抗体。参见，例如，Lonberg等人，W093/12227(1993);Kucherlapati，WO91/10741(1991)。可以通过竟争性结合实验选择人抗体，或相反，人抗体与特定小鼠抗体具有相同的表位特异性。这种抗体特别可能具有小鼠抗体的有用的功能性质。还可以用免疫原性试剂免疫的人血清的形式提供人多克隆抗体。任选地，可以使用HIV相互作用宿主因子或其片段通过亲和纯化来浓缩这种多克隆抗体。V.筛选HIV相互作用宿主因子的调节子一般地，首先筛选试剂对本发明人所鉴定的HIV相互作用宿主因子的生物活性的调节能力。在这一筛选步骤中可以使用许多测定系统。这种篩选可以使用体外测定系统或基于细胞的测定系统。在这一筛选步骤中，可以才艮据其与HIV相互作用宿主因子的结合、其改变HIV相互作用宿主因子的表达水平或其调节HIV相互作用宿主因子的其它生物活性(如，酶活)来筛选试剂。1.调节HIV相互作用宿主因子的结合活性在一些方法中，第一个筛选步骤中确定试剂和HIV相互作用宿主因子的结合。可以通过多种方法测定试剂和HIV相互作用宿主因子的结合，这些方法包括，例如，体外标记的蛋白质-蛋白质结合测定、电泳迁移率变动分析、蛋白质结合的免疫测定、功能测定(磷酸化测定，等)，或其他类似方法。参见，如美国专利4,366,241;4,376,110;4,517,288和4,837,168;此外还有Bevan等人，TrendsinBiotechnology13:115-122，1995;Ecker等人，Bio/Technology13:351-360,1995;以及Hodgson,Bio/Technology10:973-980，1992。可以通过检测与HIV相互作用宿主因子的直接结合来鉴定试剂，如，通过针对HIV相互作用宿主因子的抗体与HIV相互作用宿主因子免疫共沉淀。也可以通过检测指示试剂和HIV相互作用宿主因子相结合的信号(如，荧光淬灭或FRET)来鉴定试剂。竟争测定提供了鉴定与HIV相互作用宿主因子特异性结合的试剂的合适形式。在这种形式中，通过和已知与HIV相互作用宿主因子相结合的化合物进行竟争而筛选试剂。已知的结合化合物可以是合成化合物。它也可以是特异识别HIV相互作用宿主因子的抗体，例如，针对HIV相互作用宿主因子的单克隆抗体。如果试剂抑制已知结合HIV相互作用宿主因子的结合，那么试剂也可以和HIV相互作用宿主因子结合。已知许多类型的竟争结合测定，例如固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹层竟争测定(参见Stahli等人，MethodsinEnzymology9:242-253，1983)、固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirkland等人，J.Imminol.137:3614-3619，1986)、固相直接标记测定、固相直才妄标记夹层测定(参见，Harlow和Lane,Antibodies,ALaboratoryMannual，冷泉港出版社，第三版，2000)、使用125I的固相直接标记RIA(参见Morel等人，Mol.Immunol.25(1):7-15,1988)、固相直接生物素-亲和素EIA(Cheuang等人，Virolody176:546-552，19卯)，以及直接标记RIA(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32:77-82,19卯)。一般地，这类测定涉及使用结合于固体表面的纯化多肽或具有未标记的试剂或标记的参考化合物之一的细胞。通过确定试剂存在情况下固体表面或细胞中结合的标记物的量来测定竟争性抑制。通常试剂是过量的。通过竟争测定鉴定的调节试剂包括与参考化合物结合相同表位的试剂和与参考化合物结合的表位足够接近以发生空间位阻的邻近表位相结合的试剂。通常，当竟争试剂过量存在时，它可以将参考化合物与共同的靶标多肽特异性结合抑制至少50%或75%。筛选测定可以是不可溶或可溶形式。一个不可溶测定的例子是将HIV相互作用宿主因子或其片段固定在固相基质上。接着将固相基质与试剂接触足够允许试剂结合的时间。从固相基质上洗去未结合的物质后，在固相上结合的试剂的存在允许鉴定该试剂。该方法可以进一步包括将结合的试剂从固相基质上洗脱，从而分离出试剂的步骤。或者，不固定细胞宿主因子外，将试剂结合到固相基质然后加入HIV相互作用宿主因子。可溶测定包括上文所述的一些组合文库筛选法。在可溶测定形式下，试剂和HIV相互作用宿主因子均不与固相支持体结合。可以通过如HIV相互作用宿主因子或试剂或两者的荧光变化来测定HIV相互作用宿主因子或其片段与试剂的结合。荧光可以是固有的或通过荧光团标记任一组分而赋予。在一些结合测定中，可以以标记的实体提供HIV相互作用宿主因子、试剂或第三种分子(例如，抗HIV相互作用宿主因子的抗体)，即，共价结合或连接到可检测的标记或基团，或可交联的基团，以方便在特定情况下多肽的鉴定、检测和定量。这些可检测基团可以包含可检测的多肽基团，例如，可测定的酶或抗原表位。备选地，该可检测基团可以选自许多其它可检测基团或标记，例如放射性标记(如，125I、32P、"S)或化学发光或荧光基团。类似地，可检测基团可以是底物、辅因子、抑制剂或亲和配体。2.调节HIV相互作用宿主因子的其它活性试剂和HIV相互作用宿主因子的结合表明该试剂可以是HIV相互作用宿主因子的调节子。它还表明该试剂可以通过作用于HIV相互作用宿主因子抑制HIV感染。因此，可以检查与HIV相互作用宿主因子结合的试剂调节HIV感染相关活性的能力(即上文概述的第二步检查步骤)。备选地，可以进一步检查与HIV相互作用宿主因子相结合的试剂，以确定它是否确实调节HIV相互作用宿主因子的生物学活性(例如，酶活)。可以通过活性测定检查测这种调节的存在、性质和程度。更常见的是，可以独立使用这种活性测定来鉴定调节HIV相互作用宿主因子活性的试剂(即不用首先测定它们与HIV相互作用宿主因子结合的能力)。一般而言，该方法涉及向含有HIV相互作用宿主因子样品中加入试剂，该样品存在或不存在测定HIV相互作用宿主因子生物学活性(例如，如果HIV相互作用宿主因子是酶，则为酶学活性)所必需的其它分子或试剂，并确定HIV相互作用宿主因子的生物活性变化。如果HIV相互作用宿主因子具有已知的生物学或酶学功能(如，激酶活性或蛋白酶活性)，那么在第一步篩选步骤中所监测的生物学活性也可以是该HIV相互作用宿主因子的特定生物化学或酶学活性。这些包括激酶(如，NTRK1、CCRK、PAK7、MAP3K14、MARK14、TYK2和MLK3)，蛋白酶(如CTSO)，鳞酸酶(如，LOC91443)，或表2-4中所示的其它酶(如，NMT1、ALDH3A1、PDE1B和CAT)。在笫一步篩选步骤中可以使用这些分子的任一种。这些分子的酶活测定方法在本领域中众所周知，并常规地实践。篩选中所使用的底物可以是已知可以被酶(如激酶)进行酶促修饰的分子，或者可从给定类的酶的候选底物中容易被鉴定的分子。在一个典型的实施方案中，用于筛选的HIV相互作用宿主因子是MLK3激酶，首先筛选试剂调节MLK3激酶自身磷酸化或其对底物进行磷酸化的能力。可以通过监测在化合物存在时MLK3的自身磷酸化来检查受试化合物对MLK3激酶活性的影响，使用如Gallo等人，JBiolChem.269:15092-100，1994;Leung等人，JBiolChem.273:32408-15，1998;Zhang等人，JBiolChem.276:45598-603，2001和Durkin等人，Biochemistry43:16348-55，2004中所述的方法。也可以通过监测在受试化合物存在时MLK3对底物的磷酸化来鉴定抑制MLK3激酶活性的化合物。例如，通过体外测定(如Cha等人，JCellSci.117:751-60，2004中所述)可以检查化合物对golgin-160的MLK3磷酸化的影响。许多其他监测蛋白激酶活性的方法在本领域中也有描述。这些包括如，Chedid等人，J.Immunol.147:867-73，1991;Kontny等人，EurJPharmacol.227:333-8,1992;Wang等人，Oncogene13:2639-47，1996;Murakami等人，Oncogene14:2435-44，1997;Pyrzynska等人，JNeurochem.74:42-51,2000;Berry等人，BiochemPharmacol.62:581-91，2001;Cai等人，ChinMedJ(Engl)l14:248-52,2001中所报道的方法。可以使用和修改这些方法中任何一种来测定试剂对为激酶的HIV相互作用宿主因子如NTRK1、CCRK、PAK7、MAP3K14、MARK14、TYK2和MLK3的调节作用。此外，本领域中可获得许多激酶的底物。参见，如www.emdbiosciences.com和www.proteinkinase.de。jt匕夕卜，^T以寸吏用高i量形式筛选激酶的适当底物。例如，可以使用Kinase-Glo⑧发光激酶测定(Promega)或其它激酶底物篩选试剂盒(如CellSignalingTechnology,Beverly,Massachusetts所开发的)鉴定激酶底物。除了用于筛选调节HIV相互作用宿主因子酶活或其它生物学活性的试剂的测定外，活性测定还包含在体内和体外筛选HIV相互作用宿主因子的表达水平的变化。可以通过在培养细胞系中瞬时或稳定转染表达载体在基于细胞的系统中检查HIV相互作用宿主因子表达的调节。例如，可以测定受试化合物抑制处于HIV相互作用宿主因子的转录调控元件(如，启动子序歹'j)控制下的报道基因(如，萤光素酶基因)表达的能力。编码表2-4中所示的HIV相互作用宿主因子的基因在本领域中均已表征。许多这些基因的转录调控元件(如启动子序列)均已^皮描述。哺乳动物细胞系，以测定启动子活性。报道基因通常编码具有易于测定酶活性的多肽，所述活性在宿主细胞中天然缺乏。真核生物启动子典型的报道多肽包括，例如，氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤火虫或海肾(reniUa)萤光素酶、p-半乳糖苦酶、P-葡糖醛酸糖苷酶、碱性磷酸酶和绿色荧光蛋白(GFP)。可以只使用常身见实践技术和分子生物学方法(参见，例如，Samrbook等人，同上；Brent等，同上)制备表达处于HIV相互作用宿主因子的转录调控元件控制下的报道基因的载体。除了报道基因外，载体还可包含宿主细胞繁殖或维持所必需的元件，以及诸如多腺苷酸化序列和转录终止子等元件。典型的测定载体包括含有萤光素酶基因5'多接头序列的pGL3系列载体(Promega，Madison,WI;美国专利号5,670,356)。细胞培养、转染和报道基因测定的一般方法在本领域中已有描述，例如，Samrbool等人，同上；和TransfectionGuide,PromegaCorporation,Madision,WI(1998)。任何易于转染的哺乳动物细胞系(例如，HCT116、HEK293、MCF-7和HepG2细胞)都可以用于测定载体中报道基因的表达。VI.检测调节化合物对HIV感染的抑制活性为了鉴定新的HIV感染抑制剂，通常进一步检查上文所描述的调节HIV相互作用宿主因子的化合物，以确定它们对HIV感染的抑制作用。通常筛选化合物对可指示HIV感染或HIV复制的活性的调节能力。在存在调节化合物作用于的HIV相互作用宿主因子的情况下进行筛选。可以通过细胞内源性表达或由第二表达栽体表达在第一步筛选步骤中鉴定的调节试剂所针对的HIV相互作用宿主因子。优选地，使用内源性表达HIV相互作用宿主因子的细胞在体内进行这种筛选步骤。作为对照，还可以检查调节化合物对不表达HIV相互作用宿主因子的细胞的影响。例如，如果在第一步筛选步骤中使用的HIV相互作用宿主因子(例如，由小鼠基因编码)在细胞系(例如，人细胞系)中无内源性表达，那么可以将表达这种多肽的另一种载体引入细胞。通过比较在调节化物存在或缺乏时HIV感染的相关活性，可以鉴定化合物对HIV感染的活性。有许多测定和方法能检查化合物的HIV-抑制活性。这些通常涉及测试化合物体外抑制HIV病毒复制的能力或指示HIV感染的生物化学活性。在一些方法中，可以通过使用本领域的常规实践方法检查调节化合物对体外培养的细胞的HIV感染的影响来检测它们对HIV感染的潜在抑制活性。例如，可以通过Seddiki等人，AIDSResHumRetroviruses.15:381-卯，1999所描述的原代巨噬细胞的HIV感染来检查这些化合物。也可以通过Fujii等人，JVetMedSci.66:115-21，2004所报道的其他T细胞和单核细胞系的HIV感染来检查它们。监测HIV感染的其它体外系统在本领域已经有所描述。参见，如，Li等人，PediatrRes.54:282-8,2003;Steinberg等人，Virol.193:524-7,1993;Hansen等人，AntiviralRes.16:233-42，1991和Piedimonte等人，AIDSResHumRetroviruses.6:251-60，1990。在这些测定中，可以通过形态学监测细胞的HIV感染，例如，通过显微致细胞病变测定(参见，如Fujii等人，JVetMedSci.66:115-21,2004)。也可以通过酶法对其进行评估，例如，通过测定细胞培养物上清液中的HIV逆转录酶(RT)活性。这种测定在本领域中已有描述，例如，Reynolds等人，ProcNatlAcadSciUSA.100:1615-20，2003和Li等人，PediatrRes.54:282-8，2003。其他测定通过对病毒核酸或病毒抗原积累的定量来检测HIV感染。例如，Winters等人(PCRMethodsAppl.1:257-62，1992)描述了从感染HIV的细胞培养物中测定HIVgagRNA和DNA的方法。Vanitharani等人描述了测定病毒p24抗原的产生的HIV感染测定(Virology289:334-42，2001)。还可以通过p24抗原酶联免疫吸附测定在体外监测病毒复制，如在Chargelegue等人，JVirolMethods.38(3):323画32，1992和Klein等人，JVirolMethods,107(2):169-75，2003中所述。可以使在一些方法中，可以在允许HIV复制的人工改造的报道细胞中来检测调节化合物对HIV感染的潜在抑制作用。在这些细胞中，通过检查在HIV转录调控元件(例如，HIV-LTR)控制下报道基因的表达来监测HIV感染和复制。这类细月包的一个实例是HeLa-T4-PGalHIV净艮道细胞。如下文实施例所述，使用调节化合物处理可以后可以用HIV-IIIb感染HeLa-T4-PGal报道细胞。如通过测定P-半乳糖苷酶活性监测的化合物处理后的细胞中的病毒感染力可以与未用所述化合物处理过的对照细胞中的病毒感染力进行比较。调节化合物处理后的细胞中病毒滴度或感染力的减少可以证实该化合物确实能够抑制HIV感染或病毒复制。除了此处所例举的HeLa-T4-PGal细胞外，许多类似的报道基因测定也在本领域中已经有所描述。例如，Gervaix等人(ProcNatlAcadSciUSA.94:4653-8，1997)开发了表达编码在HIV-ILTR启动子控制下的人绿色荧光蛋白(GFP)的质粒的稳定T细胞系。经HIV-I感染后，与未感染细胞相比，可以观察到感染细胞中的荧光增加了100-l,000倍。在本发明中可以使用这些测定系统的任一种来实时监测调节化合物对HIV感染的影响。这些体外系统还允许随时间对感染细胞进行定量，并确定它们对化合物的敏感性。在一些其它方法中，可以通过检查经该化合物处理后细胞中HIV-1假病毒的产生来检查调节化合物对HIV复制的影响。细胞可以内源性或外源性表达HIV相互作用宿主因子。例如，可以将编码HIV相互作用宿主因子的构建体转染入不内源性表达该HIV相互作用宿主因子的宿主细胞中。如美国临时专利申请号60/673,623中所详述的，可以使用报道基因质粒转染生产细胞(如293THEK细胞)而产生HIV-1假病毒，这种质粒表达编码报道基因(例如，萤光素酶基因)的psi-阳性RNA、编码各种结构蛋白和调控或辅助蛋白的deltapsi包装构建体，如Tat、Rev、Vpr和Vif以及VSV-g被膜表达质粒。生产细胞中产生的假病毒只编码报道基因。在使用生产细胞上清液中的假病毒感染靶细胞后，报道基因在逆转录并整合入靶细胞基因组后表达。为了筛选HIV复制抑制物，可以在假病毒质粒转染之前、同时或之后使用调节化合物处理生产宿主细胞。优选地，该化合物在假病毒质粒转染之前施用于宿主细胞，并且存在于整个测定过程中。可以使用生产细胞上清液中的假病毒感染靶细胞并测定靶细胞中报道基因(如，萤光素酶活性)活性来监测产生的假病毒滴度。作为对照，也对未经该化合物处理的生产细胞上清液感染的靶细胞中报道基因的活性进行测定。如果调节化合物具有抑制病毒出芽的作用，那么相对于对照细胞来说，与使用该化合物处理的生产细胞的上清液相接触的靶细胞将具有降低的报道基因活性。VII.治疗应用通过抑制HIV感染，上文所描述的HIV抑制化合物提供了本发明的有用的治疗应用。它们容易用于预防或治疗多种受试者中HIV感染以及与HIV感染相关的疾病或状况(如，艾滋病)。此外，本领域中已知的抑制本发明人所鉴定的任何HIV相互作用宿主因子的化合物也可用于治疗应用。实例包括抑制MLK3激酶活性的K252a和CEP1347(Roux等人，J.Biol.Chem.277:49473-80，2002)。适合用此处所公开的HIV抑制化合物进行治疗的HIV感染包括被任何逆转录病毒的HIV家族(例如，HIV-I、HIV-II、HIV-III)感染的受试者，尤其是人类受试者。HIV-抑制化合物可用于治疗携带任何逆转录病毒HIV家族成员的受试者。它们可以用于治疗被诊断为活性艾滋病的受试者。这些化合物还可用于治疗或预防这些受试者中艾滋病相关状况。未被诊断出被HIV感染但是被认为具有HIV感染风险的受试者也适合用本发明的HIV抑制化合物进行治疗。患有任何艾滋病相关疾病的受试者都适合用这些HIV抑制化合物进行治疗。这些疾病包括艾滋病相关性综合征(ARC)、进行性全身淋巴结病(PGL)、抗-HIV抗体阳性状况、HIV阳性状况、艾滋病相关神经状况(例如痴呆和热带下身截瘫)、卡波西肉瘤、血小板减少性紫癜和相关的机会性感染，如卡氏肺嚢虫肺炎、结核分枝杆菌感染、食道念珠菌感染、脑弓形体病、CMV视网膜炎、HIV-相关脑病、HIV-相关消耗综合征，等等。测定体内HIV感染和进展为艾滋病的标准方法可用于确定受试者是否对本发明中的HIV抑制化合物治疗为阳性反应。例如，在^f吏用本发明的HIV抑制化合物治疗后，可以监测受试者的CD4+T细胞数量。CD4+T细胞数量的增加表明受试者从抗病毒治疗给药中受益。该方法和本领域中已知的其它方法可用于确定本发明中的化合物对于治疗受试者中HIV感染和艾滋病的有效程度。本发明中的HIV抑制化合物可以在无菌条件下直接施用于待治疗的受试者。可以单独或作为药物组合物的活性成分施用调节剂。本发明中的治疗組合物也可以与其他治疗剂组合或联合^f吏用。在一些应用中，将第一种HIV抑制化合物和另一种HIV抑制化合物组合使用，以达到单独使用一种HIV抑制化合物所不能实现的对HIV感染的更广泛抑制。在一些其他应用中，本发明中的HIV-抑制化合物可以与已知的抗HIV药物(例如AZT)联合使用。本发明中的药物组合物一般包含至少一种活性成分及其一种或多种可接受的载体。可药用的载体可以增强或稳定该组合物，或方便组合物的制备。可药用载体部分由施用的特定组合物决定(例如，核酸、蛋白质或调节化合物)，以及由施用组合物的特定方法决定。它们还应当在药学和生理学上都是可接受的，意思是说它们能够与其它活性成分相容，并且对受试者无害。这些载体可以根据施用所需的制剂形式而具有多种形式，如，口服的、舌下的、直肠的、鼻的、静脉内的、或肠胃外的。例如，HIV-抑制化合物可以与例如卵白蛋白或血清白蛋白等载体蛋白在施用前复合，以增强稳定性和药理学性质。可以以多种形式，例如粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶嚢剂等制备药物组合物。制剂中治疗活性化合物的浓度按重量占0.1-100%。可通过药学领域中任何公知的方法制备治疗制剂。可以通过任何可用于治疗的有效手段递送治疗制剂。参见，如，Goodman&Gilman的ThePharmacologicalBasesofTherapeutics,Hardman等编辑，McGraw-HillProfessional(第10版，2001);Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,Gennaro编辑，LippincottWilliams和Wilkins(第20版，2003);和PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,Ansel等编辑，LippincottWilliams和Wmkins(第7版，1999)。治疗制剂可以以单位剂型方便地给予，并以合适的治疗剂量施用。合适的治疗剂量可以通过任何众所周知的方法进行确定，如对哺乳动物物种进行临床研究以确定最大耐受剂量和对正常人类受试者进行临床研究以确定安全剂量。除了可能需要较高剂量的特定情况之外，HIV抑制化合物的优选剂量一般在每天约0.001至约lOOOmg的范围之间，更常见在约0.01至约500mg之间。HIV-抑制化合物的优选剂量和施用方式可根据受试者不同而改变，取决于治疗医师评论的个体因素，例如待治疗疾病、待施用组合物的选择，包括特定的HIV抑制化合物、个体受试者年龄、体重和应答、受试者症状的严重性以及选择的施用途径。通常，HIV抑制化合物的施用量是可以有效和可靠地防止或减轻受试者状况的最小剂量。因此，上述剂量范围旨在为此处的教导提供一般指导和支持，而非旨在限制本发明的范围。实施例提供以下实施例来阐明而不是限制本发明。实施例1.一般材料和方法细胞系及维持通过NIH,NIAID艾滋病部门的艾滋病研究与参考试剂计划(Kimpton，J.Virol.66:2232-9,1992),从MichaelEmerman博士处获得HeLaCD4Pgal细胞。细胞在补充10%胎牛血清，1x青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺，0.2mg/mLG418和0.1mg/mL潮霉素B的DMEM培养基中培养。Jurkat细胞培养于补充10%胎牛血清和1x青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中。所有的细胞培养试剂均购自Invitrogen。在HeLaCD4Pgal细胞中筛选cDNA:基本上根据Chanda等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:12153-8，2003中所描述的方法进行HeLaCD4Pgal细胞的高通量cDNA逆转染。简言之，将包含15，000个基因的子基因组文库的个体cDNA(详细信息见http:〃function.gnf.org)、阴性对照Sport6GFPcDNA和阳性对照Sport6-Tat质粒以40ng/孔点在55个白色不透明384孔板(Greiner)中。使用Multidrop装置(Titertek)在每孔(10juL)中加入无血清Opti-MEM培养基(Invitrogen)中含有1Mg/mLHIV-LTR曙萤光素酶报道基因质粒(通过HxB2林的LTR序列PCR扩增获得)的1%GeneJuice(Novagen)溶液，允许形成复合体10分钟。接着加入HeLaCD4Pgal细胞(IOOO个细胞/30|aL/孔，在DMEM/10。/。胎牛血清中)，将板温育过夜，接着加入20jaL含有200ng/mLHIV-IIIb的p24(AdvancedBiotechnologies公司)的DMEM/10。/。胎牛血清。72小时后，使用BriteGlo(Promega),在CLIPR仪器(MolecularDevices)上读数测量萤光素酶的产生对感染进行评估。对整个文库以一式两份进行测定。比较每种cDNA的数据和整个板的平均信号，表示为afa/mfa比值，其是平均激活倍数(afa)除以激活倍数的校正标准差(mfa)。如果重复测定之间的标准差高，那么mfa使激活倍数值降低。逐渐增加额外cDNA后通过在初始测定中测试确25认命中，并测序证实其身份(EtonBioscience)。激酶失活MLK3的cDNA测试在12孔板中使用筛选测定的放大形式沿着MLK3Origene收集命中测试pcDNA3.1载体中MLK3和MLK3的激酶失活突变体(K144R)(Xu等，Mol.Cell.Biol.21:4713-24，2001)。简言之，在每孔中加入1.28|agcDNA/0.32|JgLTR-Luc/32ML，随后加入320juL1%genejuice/Optimen，接着加入lmLDMEM/10。/o胎牛血清中的6x104HeLaCD4卩gal细胞。24小时后，使用90ngHIV-IIIb的p24感染培养物，在培育3天，使用BriteGIo(Promega)并在CLIPR仪器(MolecularDevices)上读数，评估感染水平。siRNA:从Dharmacon获得GL2萤光素酶siRNA(目录号D-001100-01-20)、PITPNot(检索号NM—006224)、TRIM28(检索号NM_005762)、IFITl(检索号NM—001548)、LYZ(检索号NM—000239)、COROIA(检索号NM—0t)7074)和DnaJC14(检索号NM—032364)SmartpoolsiRNA。就GL2siRNA而言，也从Qiagen获得了额外量的相同序列。合成并合并针对Tat的两种siRNA，用作HIV感染抑制的阳性对照。设计并合成MLK3-1和MLK3-2siRNA，从Dharmacon(目录号D-003577-03)获得MLK3-3siRNA。在HeLaCD4Pgal细胞中筛选siRNA:siRNA文库针对最可能是潜在药物耙标的5000种不同基因，每种基因用两个不同的siRNA代表。基本上根据Aza-Blanc等，MolecularCell12:627-37，2003所述的方法进行HeLaCD4egal细胞的siRNA逆转染。简言之，在白色不透明或白色透明底的384孔板(Greiner)中以14ng/孔加入各siRNA，每孔含有一种siRNA序列。在每孔中加入10|aL无血清Opti-MEM培养基(Invitrogen)中的2%oligofectamine(Invitrogen)溶液，允许复合体形成15-20分钟。使用Multidrop装置(Titertek)进行所有384孔的加样。然后加入HeLaCD4Pgal细胞(1000个细胞/30pL/孔，在无血清Opti-MEM中)，将板温育过夜，然后加入20pL含有200ng/mLHIV-IIIb(AdvancedBiotechnologies7>司.)的30。/。胎牛血清/DMEM。72小时后，使用等体积的GalScreen(AppliedBiosystems)测量P-半乳糖苷酶的产生来评估感染。使用CLIPR仪器(MolecularDevices)对所有384孔板读数。每个384孔板平行测定十二次，数据表示为与阴性对照GL12siRNA相比的抑制百分比。在转染后96小时测定siRNA的细胞毒性，通过加入等体积的1:4稀释的CellTiterGlo(Promega)并使用CLIPR仪器对荧光读数进行所述测定，数据仍然以与GL2相比的抑制百分比表示。通过蛋白质印迹验证siRNA:在6孔板中的250/aL无血清Opti-MEM(Invitrogen)中点样siRNA(800ng)，随后加入250juL无血清Opti-MEM中的1.5%Lipofectamin2000(Invitrogen)。将板在室温温育20分钟以允许形成复合体。加入HeLaCD4卩gal细胞(3x105个细胞，在1.5mL无血清Opti-MEM中)，温育过夜后加入lmL30。/。胎牛血清/DMEM。转染后72小时后刮下细胞，并用细胞裂解緩冲液(20mMHEPESpH7.2/10mMKC1/1mMEDTA/1%TritonX-100/1x蛋白酶抑制剂，SigmaChemical公司)在冰上裂解1小时。使用Micro-BCA试剂盒(Promega)测定裂解物的总蛋白质浓度，将相同量的蛋白质装入4-12%NuPageBis-Tris凝胶(Invitrogen)，按制造商的说明进行电泳。转移至硝酸纤维素膜后，使用含5%脱脂奶的PBST(含0.05%吐温-20的磷酸盐緩沖盐水)封闭印迹，接着使用如下抗体进行免疫印迹来自SantaCruzBiotechnology的兔多克隆抗-MLK3抗体和山羊抗-微管蛋白抗体、SigmaChemical公司的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔二级抗体，Promega的辣根过氧化物酶缀合的驴抗山羊二级抗体。所有的抗体根据制造商所建议的稀释比稀释于含5%脱脂奶的PBST后使用。使用ECL-plus检测试剂(Amersham)显示条带。JurkatT-细月包的siRNA转染将JurkatT-细月包用PBS洗涤一次，以高密度(2.4x1()8/mL)重悬于无血清Opti-MEM(Invitrogen)中，取50|aL力口入含有lnmolsiRNA(50|aL,20|uM)的0.2cm间隙杯(gapcuvette)中。使用BioRadGenePulserXcell模块按照制造商建议的条件(140V，lOOOuF,指数衰减)对混合物进行电穿孔，然后转移至12mL补充10。/。胎牛血清的不含抗生素的RPMI中培养24小时。沉淀细胞，使用锥虫蓝排阻法对活细胞计数，并以1.7x106/mL密度重悬于补充10%胎牛血清和1x青霉素/链霉素/谷氨酰胺的RPMI中。对于转染研究，在48孔板的每孔中加入300liLsiRNA处理后的细胞，并加入2ng或0.5ngHIV-nib,基于制造商所提供的病毒滴度分别对应于0.0005和0.000125。额外的三天后，收获细胞，用PBS洗涤三次，裂解细胞，通过细胞裂解物的p24ELISA测定感染。对于细胞毒性，将300jLiLsiRNA处理后的细胞加入48孔板的每孔中，三天后，使用CellTiterGlo(Prmega)在CLIPR仪器(MolecularDevices)上读数来测定细胞活力，或者用AlarnarBlue(TREKsystems)在Acquest(LJLBiosystems)上读数测定细胞活力。为了确定siRNA的功效，在电穿孔72小时后按照HeLaCD40galsiRNA验证研究中的方法的制备和分析细胞裂实施例2.从siRNA筛选中鉴定新的HIV相互作用宿主因子我们通过监测HeLaCD4Bgal细胞中在HIVLTR启动子控制下的报道基因的表达对参与HIV感染的宿主蛋白质进行了子基因组siRNA筛选(Kimpton等人，JVirol66:2232-2239，1992)。通过NIH，NIAID艾滋病部门的艾滋病研究与参考试剂计划从MichaelEmerman博士处获得HeLa-CD4-Bgal细胞。使用逆转染方案用作为阳性对照的针对Tat的siRNA转染细胞，并在转染24小时后用HIV-IIIb攻击细胞(Huang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:3456-61，2004)。为了能够观察到对感染的所有阶段(从进入到释放，到在细胞培养物中扩散)的影响，感染持续三天。通过监测HeLaCD4Pgal细胞中报道基因的表达，该系统可以检测siRNA对HIV感染的任何调节作用。通过使用化学发光底物测定在病毒LTR启动子下产生的P-半乳糖苷酶的量，对感染进行评估。整个筛选以一式两份进行，数据表示为平均激活倍数(afa)与激活倍数的校正标准差(mfa)之比，该值既考虑到了每个siRNA的影响，又考虑到了一式两份之间的偏差。对于那些afa小于l的基因(感染抑制剂)，将值转换为负激活倍数。实施例3从cDNA筛选中鉴定和表征HIV相互作用宿主因子我们进行了含有15，000个独特基因的cDNA文库的高通量筛选，以寻找其过量表达将导致HIV-IIIb感染增强的新的原病毒因子。由于HeLaCD4Pgal细胞易于转染，我们使用它们进行筛选，并使用复制感受态HIV-IIIb对其攻击。在含有文库cDNA的384孔板的孔中(每孔一种基因)加入阴性对照(Sport6-gfp)和阳性对照(Tat-Sport6)cDNA，随后加入包含应答HIVTat的LTR-萤光素酶报道基因构建体的转染试剂溶液。形成复合体后加入细胞，24小时后，每孔使用HIV-fflb感染。为了能够观察到对感染的所有阶段(从进入到释放，到在细胞培养物中扩散)的影响，感染持续三天。然后通过测定经由病毒LTR启动子产生的萤光素酶的量来评估感染。与阴性对照孔和空白孔相比，大多数的阳性对照TatcDNA孔表现出荧光增强。整个筛选以一式两份进行，数据表示为平均激活倍数(afa)与激活倍数的校正标准差(mfa)之比，该值既考虑到了每个siRNA的影响，又考虑到了一式两份之间的偏差。在整个文库中，315(2.1%)个基因使感染增加，其afa.mfa》2,这是为随后实验所选的截断值。通过筛选鉴定一些已知参与HIV感染的基因(例如增强子S100A12、PP2A调节亚基B和核输出蛋白CRM1)为增强子，它们作为内部验证。按照筛选实验和文献综述确定的前89个感染增强子用于后续实验。所选增强子来自多种基因家族，大多数可以作为潜在的药物靶标，包括激酶、其它酶和转录因子，以及已知来自在HIV感染中重要的途径，包括泛蛋白途径和RNA加工因子。用小量制备规模再生长每种cDNA命中，并使用最初测定法测试，其中再次证实19个命中。接着将它们大规模生长，使用最初测定法测试，并测序以确保正确的命中身份。在这一阶段，13个测序证实的命中与阴性对照相比继续表现出活性增强，相对于Sport6-GFP阴性对照增强1.7倍至8.8倍(表1)。我们接着通过使用siRNA耗尽内源性蛋白质来研究最强的cDNA增强子对于HIV复制是否是必需的。对于表现出对照的约3倍或更大的6种基因，我们获得了已验证的siRNA的Smartpools，并在HeLaCD4Pgal细胞中评估了它们对HIV-IIIb感染的影响。在测试的siRNA中，针对分子伴侣DnaJC14、含有三十四肽重复序列1的干扰素诱导蛋白质(IFIT1)和磷脂酰肌醇转移蛋白a(PITPNcc)的siRNA降低了HIV感染而无明显的毒性，这进一步增强了它们在感染中的作用，而其它siRNA对于病毒复制或细胞存活力无明显影响(数据未显示)。有趣的是，在这些基因中，过表达时增强感染、耗尽时阻断感染的是千扰素诱导蛋白质IFIT1,它在多种病毒感染(包括丙型肝炎(HCV)和星形M细胞的HIV感染)中被上调。虽然IFIT1的生物功能尚不清楚，但是有报道它能够和Rho/Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子作用，并可能因此帮助Rho蛋白激活。HIV可能使用干扰素诱导的蛋白促使其复制这一想法是吸引人的并值得进一步研究。其它两个具有双重活性的两种基因，即分子伴侣蛋白DnaJC14和参与嚢泡运输的脂转运蛋白质PITPNa，对于进一步洞察病毒生物学也是有希望的。由于其清楚的生理学作用和作为治疗靶标的高潜力，接下来我们将关注强cDNA增强子混合谱系激酶3(MLK3)。这种丝氨^/苏氨酸激酶参与激活下游Map激酶(包括JNK、p38和ERK)，并已证实在包括HIVgpl20介导的神经元调亡的神经元调亡中起重要作用。MLK3的化合物抑制剂CEP-1347已用于神经变性疾病治疗的临床试验，这突出显示了它在神经元细胞死亡中的作用以及作为药物耙标的适用性(Bodner等人，ExperimentalNeurology188:246-53，2004)。为了说明MLK3激酶活性是否是引起使用cDNA所观测到的感染增强的原因，我们获得了一种激酶失活突变体(MLK3KI)，并检测了它对HIV感染的影响。与野生型蛋白质不同，MLK3KI不能增加感染，表明MLK3的功能对于感染增强至关重要(图1)。由于MLK3在通过激活JNK后激活AP-1复合体中的作用，我们假设它可能通过定位在HIVLTR中的AP-1位点增强HIV转录。为了证明这种假设，将MLK3用LTR萤光素酶构建体与Tat表达载体或对照质粒共转染，以评估对LTR介导的转录的Tat-依赖性或Tat-独立的影响。与对照相比，MLK3的表达使Tat-依赖的转录增强大约3倍，但对于Tat-独立的转录无显著影响(图2)，表明MLK3通过病毒特异转录增强感染。根据过表达数据，我们最终研究了针对MLK3的siRNA是否会抑制HIV感染。我们获得了靶定MLK3的3个独特的siRNA序列，并在HeLa-CD4-13gal细胞或Jurkat细胞中评估了它们抗HIV的效力。将各个MLK3siRNA转染至HeLaCD4(3gal细胞或电穿孔至Jurkat细胞中。24小时后，使用HIV-IIIb攻击细胞。对于HeLaCD4Pgal细胞，3天后使用化学发光底物(GalScreen)测定细胞中从稳定的LTR-13gal报道基因产生的P-半乳糖苷酶来评估感染。对于Jurkat细胞，感染24小时后将加入的病毒移除，再过48小时后收集上清液，使用ELISA测试p24水平。还通过在平行的未感染培养物中使用CellTiterGlo测定每个siRNA的细胞毒性。这些结果显示，所有三种siRNA都能够有效耗尽MLK3蛋白质(图.3B)，并降低HeLaCD4|3gal细胞中HIV感染大约40%(图.3A)。与提出的影响Tat-依赖的转录机制相吻合，MLK3的耗尽对于早期逆转录物或整合的原病毒的水平无影响(数据未显示)。此外，MLK3siRNA还降低了Jurkat细胞中的HIV-IIIb感染，虽然其程度低于HeLa-CD4-Bgal细胞中所观察到的(图.3C)。蛋白质印迹分析显示Jurkat细胞中蛋白质耗尽的量比HeLaCD4Bgal细胞中低，因此解释了观察到的较低抑制水平(图.3D)。表1.HIV-IIIbHeLaCD4卩gal筛选一般结果命中范围-8.9到+4.9倍afa.mfa原病毒因子(用siRNA抑制抑制了感^态库命^#(7傲，#义岸)-8.9到-561(0.6%)-5到隱3280(2.8%)-3到-2741(7.41%)抗病毒因子(用siRNA抑制促进了感染)fl/fl,附/fl龙風命^弁(70A:,惑X岸)+2到+3365(3,65%)+3到+4.953(0.53%)表2.经证实的通过siRNA篩选所鉴定的HIV相互作用宿主因子<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>a平均激活倍数(afa)除以激活倍数的校正的标准差(mfa)，其考虑每种cDNA的影响和一式两份之间的偏差。b阴性对照Sport6g印，与筛选中使用的相同。实施例4通过酵母双杂交筛选鉴定的HIV相互作用宿主因子进行酵母双杂交筛选以鉴定在人白细胞cDNA文库中编码的新的相互作用宿主细胞因子。用GAL4和LexA融合蛋白完成在酵母中蛋白质-蛋白质相互作用的测定。使用Vpr特异引物通过PCR扩增VprcDNA。将该cDNA插入LexADBD表达栽体pSLANS中。pSLANS是pBTM116的修饰形式(Bartel等人Biotechiques14:920-924，1993)。它经修改后接受NotI插入片段并将gly4-ser-gly4-ser放置在LexA和诱何之间。将编码LexADBD-Vpr融合蛋白的cDNA转化到酵母林L40MATa中。将编码Gal4AD-白细胞cDNA融合蛋白的cDNA转化到540MAToc酵母林中。将两种酵母林杂交，并在THUKL-缺乏的合成培养基中选择含有两种质粒的转化体，通过P-半乳糖苷酶滤膜测定分析蛋白质相互作用。筛选大约两百万个二倍体转化体，分离出大量阳性候选者。使用提取升高测定法(filterliftassay)测定阳性菌落的P-半乳糖苷酶活性，以进一步验证蛋白质-蛋白质相互作用。通过对候选的cDNA克隆进行测序并与Genbank数据库相比较来鉴定如表4所列出的筛选命中表4通过酵母双杂交筛选鉴定的HIV相互作用宿主因子检索号<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>M31951.1PRF1匪012227.1GTPBP6结构域2(EFTUD2)人穿孔蛋白(PRF1)基因，完整cds人GTP结合蛋白6(假想的)(GTPBP6)应当理解此处所描述的实施例和实施方案只是为了说明的目的，本领域的技术人员可以想到多种修饰和修改，这也应包括在本申请的宗旨和范围内以及附录的权利要求的范围内。虽然在实践中或对本发明的检查中可以使用与此处所述类似或等同的任何方法和材料，但是本发明描述了最优选的方法和材料。此处所引用的所有出版物、GenBank序列、ATCC保藏物、专利和专利申请为了所有目的在此处明确的整体引入作为参考，如同它们每一个被单独指出引入一样。权利要求1.鉴定抑制HIV感染的物质的方法，该方法包括(a)筛选受试化合物以鉴定一种或多种调节化合物，所述调节化合物下调选自表2-4中所列成员的多核苷酸编码的HIV相互作用宿主因子的生物活性或表达水平；和(b)测试所述调节化合物抑制HIV感染的能力。2.权利要求l的方法，其中所述HIV相互作用宿主因子选自三十四肽重复序列l(IFITl)、磷脂酰肌醇转移蛋白oc(PITPNoc)和混合谱系激酶3(MLK3)。3.权利要求2的方法，其中所述HIV相互作用宿主因子是MLK3，并且篩选受试化合物抑制MLK3的激酶活性或其表达的能力。4.权利要求1的方法，其中通过监测在HIVLTR启动子控制下的报道基因在HIV感染的细胞中的表达来检查调节化合物抑制HIV感染的能力。5.权利要求4的方法，其中所述细胞为HeLa-CD4-Bgal。6.权利要求4的方法，其中报道基因为P-半乳糖苷酶基因。7.斥又利要求4的方法，其中用HIV-IIIb感染所述细月包。8.权利要求l的方法，其中通过比较已经接触调节化合物的经人工改造的HIV允许细胞中HIV复制和没有接触所述调节化合物的对照细胞中的HIV复制来检查调节化合物抑制HIV-1感染的能力。9.权利要求8的方法，其中HIV允许细胞是HeLa-T4-PGalHIV细胞。10.4又利要求8的方法，其中通过p24抗原ELISA测定或反转录酶活性测定来监测HIV复制。11.权利要求l的方法，其中通过比较使用化合物处理的宿主细胞中假病毒的产生和没有使用所述化合物处理的对照宿主细胞中的假病毒产生来检查所述化合物抑制HIV感染的能力。12.权利要求ll的方法，其中所述宿主细胞是293THEK细胞。13.权利要求ll的方法，其中使用在细胞中产生HIV假病毒的假病毒质粒转染宿主细胞。14.权利要求l的方法，其中HIV相互作用宿主因子是酶，并且测定的生物活性是它的酶活性。15.权利要求13的方法，其中所述酶为激酶。16.权利要求15的方法，其中所述激酶为MLK3。17.抑制受试者中HIV感染的方法，其包括对受试者施用药物组合物，该药物组合物包含有效量的抑制选自表2-4中所列成员的多核苷酸编码的HIV相互作用宿主因子的生物活性或表达的化合物。18.权利要求17的方法，其中所述HIV相互作用宿主因子选自三十四肽重复序列l(IFITl)、磷脂酰肌醇转移蛋白oc(PITPNoc)和混合谱系激酶3(MLK3)。19.权利要求17的方法，其中所述HIV相互作用宿主因子是MLK3，并且所述化合物抑制MLK3的激酶活性。20.权利要求19的方法，其中所述化合物是K252a或CEP1347。全文摘要本发明提供了新的HIV相互作用宿主因子。本发明还提供了使用HIV相互作用宿主因子筛选抑制HIV感染的化合物的方法。该方法包括首先从受试化合物中筛选本文公开的HIV相互作用宿主因子的调节剂，然后进一步筛选所鉴定的调节化合物抑制HIV感染的能力。本发明还进一步提供了治疗与HIV感染相关的疾病和状况的方法和药物组合物。文档编号C12Q1/70GK101317091SQ200680044648公开日2008年12月3日申请日期2006年12月8日优先权日2005年12月8日发明者D·源,J·考德威尔,K·L·库亨申请人:Irm责任有限公司