专利名称：一种克隆基因的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种克隆基因的方法及其应用。
在器官原基水平上进行基因表达特征的研究是现代分子发育生物学的重要内容，但目前存在两个障碍。首先是植物材料的异质性。由于植物的器官发生和早期的形成过程均在茎端以微米的尺度进行，人们很难将簇生在茎端的各种不同特征的器官原基分别分离出来进行分子生物学研究。其次，从人们对突变体研究的现状看，器官形成过程的遗传控制程序可能比器官特征决定的遗传控制程序更复杂，因为还没有发现决定器官形成过程的单基因遗传突变体。只有发展新的技术，克服上述两个障碍，才能真正在认识器官形成过程及其调控的分子机制上取得实质性的进展。而新技术的核心应该是如何从簇生在茎端的各种不同特征的器官原基中特异性地分离得到某一种原基的cDNA。近年人们已经能够从单细胞或微量的材料中提取RNA、克隆基因，但活的单细胞或器官原基的获得通常受到材料特点的限制，如本发明的发明人在对黄瓜器官形成的研究中发现，由于黄瓜子房下位，因此很难通过解剖的方法获得早期的雌雄蕊原基。同时，活体解剖通常受到操作者个人差异的影响。总之，利用现有的基因克隆方法，很难以某些特殊部位的组织为材料，建立相应的cDNA文库。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种克隆基因的方法，是自被固定在石蜡切片中的生物材料中分离基因，克隆基因。
具体地说，该方法是以被固定在石蜡切片材料中的mRNA为模版，在载玻片止进行原位反转录，然后利用PCR技术扩增反转录产物，克隆基因。
为了达到理想的效果，对所利用的石蜡切片应进行前处理，包括脱蜡、用蛋白酶处理和基因组DNA的酶解。
所述原位反转录是在载玻片上加上反转录反应液及引物后，在载玻片上进行。
为对上述反转录得到的cDNA进行有效的扩增，所述原位反转录后，PCR扩增前，在切片上对反转录产物进行加尾反应。
所述加尾反应是用TDT末端转移酶在切片上进行的。
为了尽可能多地将反转录得到的cDNA从切片上取下，用不包含Taq酶的PCR反应液从切片中提取所述反转录得到的cDNA。
本发明的方法将在构建cDNA文库中得到广泛的应用。用本发明的方法，不仅能从植物材料的石蜡切片中克隆基因，构建cDNA文库，也能从动物材料的石蜡切片中克隆基因，构建cDNA文库。
石蜡切片技术经过长期的发展，无论是方法还是设备都非常成熟。在石蜡切片中，人们能够很容易地分辨处于不同发育阶段的各种器官原基。本发明的发明人研究证实，经过石蜡切片处理的植物材料中，基因仍然具有本来的时空特异性，在此基础上，本发明的发明人非常巧妙地将石蜡切片技术与现代的分子杂交、PCR等技术相结合，创造性地提出了一种全新的克隆基因的方法，使了解器官形成过程及其调控的分子机理成为可能。在植物发育生物学研究中，利用本发明的方法，可以方便地构建cDNA文库，进而在器官原基水平上比较正常发育的原基和受阻的原基在基因表达特征上的不同，例如可望揭示单性花的分化机制，证实其是否是因为器官形成早期阶段发育受阻的结果。
过去，cDNA文库的构建通常需要毫克级的植物材料。近年来，构建文库所需要的起始材料量正在逐步降低。目前有的实验室已经能够从25个细胞中构建cDNA文库。利用本发明的方法，能够准确、高效、稳定地从生物体特殊部位(例如植物的原基)中将基因克隆出来，为发育生物学研究的更进一步突破提供了可靠的保证。
下面结合附图及具体的实施例对本发明作进一步的说明。
图2为经EcoRI酶切的质粒电泳图。
图3-A为CFL基因在黄瓜萼片形成阶段幼花中的表达特征。
图3-B为CFL基因在黄瓜心皮形成阶段幼花中的表达特征。
图4-A是利用TUB基因的引物从4个文库中扩增特异片段。
图4-B是利用CUM1基因的引物从4个文库中扩增特异片段。
图4-C是利用WER基因的引物从4个文库中扩增特异片段。
具体实施例方式
实施例1、用本发明的方法构建黄瓜的cDNA文库1、制作石蜡切片1)材料的固定分别取黄瓜的茎尖，不同发育时期的花芽，叶片及种子萌发的根尖3mm在FAA固定液(50％乙醇，10％甲醛，5％冰醋酸)中固定，抽气3-5分钟后，4固定过夜。
2)石蜡切片FAA固定的材料用系列比例的乙醇(30％，50％，70％，85％，90％，100％，100％)梯度脱水，每级30分钟。其间可用1％番红(100％乙醇溶液)进行初染。然后再经乙醇和二甲苯梯度系列透明，包埋。按常规方法进行切片、展片，切片厚度为12μm。
2、石蜡切片前处理1)脱腊及蛋白酶处理切片经二甲苯/乙醇梯度系列脱蜡至100％乙醇，每级10分钟，再经乙醇/水梯度系列入水，每级2分钟。浸入1×PBS(120mMNaCl，7mMNa2HPO4，3mMNaH2PO4，2.7mM KCl，pH7.4)中5分钟，用蛋白酶K(Pronase K，Sigma)于37，处理30分钟，处理浓度为50μg/ml。然后于1×PBS中浸泡2次，每次3分钟。再经乙醇/水系列脱水，自然干燥，-20保存。
2)基因组DNA的消化经过前处理的切片上加50U/100μl的RQ1 RNase free DNaseI(Promega)，用塑料膜覆盖，置于湿盒中。37温箱中酶解8小时。于1×PBS(经DEPC处理)中3次，每次3分钟。然后乙醇梯度脱水，自然干燥。
3、原位反转录在经过基因组DNA消化的切片上加100μl反转录反应液，于42反转录2小时。1x反转录缓冲液包含0.01mM的DTT，0.25mM的各种dATP、dCTP、dGTP、dTTP，30U Rnasin，400U Superscript II RNase H-反转录酶(GibcoBRL)，引物浓度为1μM，使用自行设计的用于扩增cDNA文库的引物5’-ATGCGGCCGCT(17)-3’。反转录结束后，在1×PBS中洗2次，每次2分钟。
4、反转录产物(cDNAs)的末端加尾反应用TDT末端转移酶(Promega)在切片上进行加尾反应。在经过反转录的切片材料上加100μl反应液，1×TDT反应缓冲液中包含2μM的dCTP，20-60U的TDT转移酶，于37保温50分钟。反应结束后放入1×PBS中2次，每次5分钟，用于洗脱加尾反应液。之后经过乙醇/水系列脱水，干燥。
5、将加尾过的cDNA转移至eppendoff管将载玻片上的材料围好，加入PCR反应液(Taq酶除外)，包括50mM KCl，10mMTris-HCl(pH9.0)，1.5mM MgCl2，0.1％Triton X-100，0.1％dNTP 0.2mM。引物15’-ATGCGGCCGCT(17)-3’；引物25’-AACTGCAG(13)-3’。经65保温10分钟和99保温15分钟，用于溶解和浸出细胞中的DNA片段，然后将溶液转入试管中。
6、原位反转录产物的PCR扩增使用上述用于原位反转录的引物序列和加尾反应中所用的序列为PCR引物5’-ATGCGGCCGCT(17)-3’和5AACTGCAG(13)-3’，分别含有Not I和Pst I酶切位点，便于下一步克隆。扩增程序为94，3分钟；94，1分钟，55，30秒，72，30秒，5个循环；再进行94，30秒，55，30秒，72，30秒，35次循环；72延伸10分钟。PCR产物通过0.8％琼脂糖胶进行检测证实分离得到大小在300-2000bp之间的cDNA，如
图1所示，其中1为Marker DL 2000(TaKaRa)；2为正对照，以质粒DNA为模板ex为引物进行PCR扩增；3为茎尖cDNAs PCR产物经过过滤后的二次扩增产物；4为幼叶cDNAsPCR产物经过过滤后的二次扩增产物。
7、cDNA文库的包装及酶切检测将PCR产物经过Wizard PCR preps纯化系统(Promega)纯化后定容于10μl H2O中。
在冰上建立如下反应体系2×T4 DNA连接缓冲液5μlpGEM-T Easy Vector 0.5μlPCR产物 3.5μlDNA连接酶 1μl4连接过夜。
8、对包装的cDNA文库的检测将PCR-cDNA产物克隆到pGEM-T Easy Vector载体中，用蓝白斑法检测其转化效率，结果是文库的滴度达到3×107。然后随机选取若干个单克隆，分别摇菌后提取质粒，用EcoR I酶切，经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测插入片段大小及插入效率，证明其插入效率达到98％，而插入片段大小在300-1200bp之间，如图2所示，其中1为DL2000；2-11为经EcoR I酶切处理的从cDNA文库中筛选出的单克窿质粒DNA；12为DL15,000。
实施例2、原位反转录后cDNA分布仍然具有其本来的时空特异性为了解经过蛋白酶K处理及DNA酶消化后，基因是否仍然能够保持在原位，进行了反转录后的检测。利用在黄瓜分生组织特异表达的基因CFL的3’端进行反转录，由图3-A可见CFL基因在花芽分化的早期在萼片原基及分生组织部位有表达，在非分生组织部位没有表达。图3-B显示的是CFL基因在萼片、花瓣、雄蕊和心皮原基部位有表达，而在其他部位没有表达，证实通过以上各步反应后，基因并没有从细胞中扩散出去，仍然保持在原位。
实施例3、通过PCR方法从cDNAs中分离基因，检测用本发明的方法构建的cDNA文库的可靠性分别利用组成型表达的基因TUB、在心皮特异表达的基因CUM1、根中特异表达的基因WER的引物在用本发明的方法建立的相应的文库中进行PCR扩增，以检测是否能够从相应的库中扩增出特异表达的基因片段。如图4-A、图4-B、图4-C所示，三个图中1是Makker DL(TaKaRA)；2是由茎尖扩增的产物；3是由幼花库中扩增的产物；4是由根尖库中扩增的产物；5是由成熟叶片扩增的产物；6是Maker 100bp ladder(华美)，实验表明能够从茎尖、幼花和根尖中得到Tub引物扩增的相应片段(图4-A)；能够从茎尖和幼花库中扩增出CUM1引物的相应片段(图4-B)，因为茎尖中也包括了幼小花芽；只能从根尖库中扩增出Wer引物的相应片段(图4-C)。所以用本发明的方法得到的cDNA文库是完全正确可信的。
权利要求
1.一种克隆基因的方法，其特征在于是自被固定在石蜡切片中的生物材料中分离基因，克隆基因。
2.根据权利要求1所述的一种克隆基因的方法，其特征在于所述方法是以被固定在石蜡切片材料中的mRNA为模版，在载玻片上进行原位反转录，然后利用PCR技术扩增反转录产物，克隆基因。
3.根据权利要求1或2所述的一种克隆基因的方法，其特征在于对所利用的石蜡切片进行前处理，包括脱蜡、用蛋白酶处理和基因组DNA的酶解。
4.根据权利要求2所述的一种克隆基因的方法，其特征在于所述原位反转录是在载玻片上加上反转录反应液及引物后，在载玻片上进行。
5.根据权利要求2所述的一种克隆基因的方法，其特征在于所述原位反转录后，PCR扩增前，在切片上对反转录产物进行加尾反应。
6.根据权利要求5所述的一种克隆基因的方法，其特征在于所述加尾反应是用TDT末端转移酶在切片上进行的。
7.根据权利要求2或3或4或5或6所述的一种克隆基因的方法，其特征在于用不包含Taq酶的PCR反应液从切片中提取所述反转录得到的cDNA。
8.根据权利要求1所述的一种克隆基因的方法，其特征在于所述石蜡切片是植物材料的石蜡切片。
9.根据权利要求1所述的一种克隆基因的方法，其特征在于所述石蜡切片是动物材料的石蜡切片。
10.权利要求1的方法在构建cDNA文库中的应用。
全文摘要
本发明的名称为一种克隆基因的方法及其应用。本发明的目的是提供一种能够高效、准确地提取生物体特殊部位基因的方法。本发明技术方案是一种克隆基因的方法，是自被固定在石蜡切片中的生物材料中分离基因，克隆基因。具体地说，该方法是以被固定在石蜡切片材料中的mRNA为模版，在载玻片上进行原位反转录，然后利用PCR技术扩增反转录产物，克隆基因。为了达到理想的效果，对所利用的石蜡切片应进行前处理，包括脱蜡、用蛋白酶处理和基因组DNA的酶解。为了使提取的效果更好，原位反转录后，PCR扩增前，在切片上对反转录产物进行加尾反应。本发明的方法在构建cDNA文库中将得到广泛的应用。
文档编号C12P19/34GK1414106SQ0113664
公开日2003年4月30日 申请日期2001年10月24日 优先权日2001年10月24日
发明者白素兰, 白书农 申请人:北京大学