一株连翘内生细菌lq-a及其分离、纯化方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一株连翅内生细菌，具体的说是一株连翅内生细菌LQ-A及其分离、纯 化方法和应用。
【背景技术】
[0002] 连翅出自《神农本草经》，其别名又有旱连子、空翅、落翅、黄奇丹，为木犀科植物连 翅Forsythia suspense的干燥果实，是中国临床常用传统中药之一，具有有抗菌、强屯、、 利尿、镇吐等药理作用，常用其治疗急性风热感冒、淋己结结核、尿路感染等症，有广谱抗菌 作用，是各中药复方(为双黄连口服液、清热解毒口服液、银翅解毒冲剂）中的主要组成药 物，国内外已对连翅叶化学成分进行了相关研究，然而对连翅内生菌的研究甚少，对连翅内 生菌代谢产物的研究更是微乎其微。
【发明内容】
[0003] 本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种连翅内生细菌LQ-A及其分 离、纯化方法和应用。
[0004] 一株连翅内生细菌LQ-A，分类命名为枯草芽抱杆菌（历suA。知苗，已保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏日期为2015年05月13日，保藏 编号为CGMCCNo. 10805。
[0005] 所述的连翅内生细菌LQ-A的分离与纯化方法，包括W下步骤： 1、 原料及用具的准备 (1) 新鲜连翅叶：采新鲜连翅叶，用塑料袋包裹，置于0- 4°C冰箱中保存，备用； (2) 研鉢和研棒：洗净用报纸包扎好，12rC灭菌30min，备用； (3) 培养皿、锥形瓶和试管：洗净用报纸包扎好，12rC灭菌30min，备用； (4) IOml和Iml移液管：洗净用报纸包扎好，121°C灭菌30min，备用； (5) 50ml和100mL烧杯：洗净用报纸包扎好，121°C灭菌30min，备用； 2、 培养基及化学试剂的配制 (1) 培养基：肉汁腺培养基（BPA):每1000mL培养基中添加牛肉浸膏3.Og、蛋白腺 5.0邑、酵母膏1.0邑、葡萄糖10.0邑和琼脂18-20邑，余量为蒸馈水；0.謹口曰，115°(：高溫灭菌 SOmin； 肉汁腺液体培养基：每1000mL培养基中添加牛肉浸膏3.Og、蛋白腺5.Og、酵母膏1.Og和葡萄糖10.Og,余量为蒸馈水；0.IMPa, 115°C高溫灭菌30min; (2) 化学试剂的配制 浓度为Imol/L的化OH水溶液：称取4g化OH用80血水溶解，定容至100血； 7%Hcl:量取70%Hcl10血，定容至100血；质量分数为75%乙醇水溶液：量取99%无水 乙醇75mU用无菌去离子水定容至IOOmL;质量分数为0.l%HgCl2水溶液：称取0. 1巧gCl2 用80血水溶解，加水定容至100血；质量分数为5%NaC10水溶液：量取10%的化ClO50血， 加入定容至100mL; 3、操作方法 (1) 称量并且表面消毒 称连翅叶片5g，用自来水冲洗干净，在无菌操作台上，依次用质量分数为75%乙醇水溶 液和质量分数为0.l%HgCl2水溶液对翅叶片的表面进行消毒5分钟，再用无菌水漂洗翅叶 片4次； (2) 检验消毒效果 取最后一次无菌水冲洗液，涂布到BPA平板上，37°C培养3天，检验灭菌效果；若发现皿 中无菌落出现，证明该叶片表面灭菌彻底，否则该分离结果不能使用； (3) 样品处理 用灭过菌的剪刀将叶片剪成IOmm的正方形，置于研鉢中，加15ml无菌水反复研磨捣 碎，静置30min钟后，用无菌移液管取Iml上清液置于IOml试管中，加水梯度稀释到浓度为 10 1-10 4,得到不同浓度的稀释液；用无菌移液管分别取0. 2ml不同浓度的稀释液涂布于肉 汁腺培养基平板上，每浓度涂平皿一个，重复3次，至于37°C溫箱中培养； (4) 纯化 培养3-5d后，挑取不同形态的菌落在固体平板上划线纯化，直到分离得到单菌落； (5) 镜检 挑取单菌落固定在载玻片上，用革兰氏染色法进行染色，干燥后，滴加香柏油，在高倍 镜下观察菌落形态； (6) 保存 挑取镜检时所用的单菌落接种于含有BPA液体培养基的S角瓶中，在37°C15化/min摇床中培养12h，至细菌长到对数期，薩取菌悬液接种于斜面培养基上，37°C培养2d，在试 管中观察到S型的菌种，再转移到4°C的冰箱中斜面真空冷冻干燥保存，即得到连翅内生细 菌LQ-A。
[0006] 所述革兰氏染色法为，草酸锭结晶紫染色Imin,自来水冲洗，舰液染Imin,水洗， 95%的酒精脱色20s，水洗，番红复染2min，水洗。
[0007] 所述的连翅内生细菌LQ-A制备涂膜保鲜剂的方法，包括步骤如下：收集连翅内生 细菌A发酵上清液，离屯、收集上清，0. 45ym滤膜过滤；然后按照滤液和质量分数为1%的明 胶的体积比为2:1，将滤液添加到质量分数为1%的明胶中，混合均匀后，即制备出涂膜保鲜 剂。
[000引有益效果是： 本发明采用表面灭菌研磨的方法处理新鲜连翅叶片，分离纯化得到具有潜在研究价值 的连翅内生细菌。W此菌株为原材料进行研究。首先进行分离纯化，抑菌试验，采用传统形 态学给予初步鉴定，然后进行分子生物学鉴定，提取菌株DNA，运用凝胶电泳检测PCR扩增 产物，将产物送去测序中屯、进行测序并鉴定，确定该株连翅内生细菌属于枯草芽抱杆菌属。 将该菌发酵取上清做抑菌试验，发酵上清液仅对金黄色葡萄球菌有抑制作用，而其他的测 试菌均无抑制作用，运为该菌株在食品行业和医药行业的应用提供了理论基础。
[0009] 生物材料的保藏 连翅内生细菌LQ-A，分类命名为枯草芽抱杆菌（历suAfWis)，保藏日期为 2015年05月13日，保藏单位及其简称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、 (CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo. 10805,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
【附图说明】
[0010] 图1为本发明实验中连翅内生细菌LQ-A的单菌落镜检图； 图2为本发明实验中连翅内生细菌LQ-A的对金黄色葡萄球菌的抑菌作用图； 图3为本发明连翅内生细菌LQ-A的镜检图； 图4为本发明实验中连翅内生细菌LQ-A的ISsrDNA电泳图； 图中标记是：M为marker,A为连翅内生细菌LQ-A; 图5为本发明实验中连翅内生细菌LQ-A的的系统发育树图。
【具体实施方式】
[0011] 一株连翅内生细菌LQ-A，分类命名为枯草芽抱杆菌（历suA。知苗，已保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏日期为2015年05月13日，保藏 编号为CGMCCNo. 10805。
[0012] 所述的连翅内生细菌LQ-A的分离与纯化方法，包括W下步骤： 1、 原料及用具的准备 (1) 新鲜连翅叶：采新鲜连翅叶(采自河南科技大学周山校区一号教学楼前的花园）， 用塑料袋包裹，置于0- 4°C冰箱中保存，备用； (2) 研鉢和研棒：洗净用报纸包扎好，12rc灭菌30min，备用； (3) 培养皿、锥形瓶和试管：洗净用报纸包扎好，12rC灭菌30min，备用； (4) IOml和Iml移液管：洗净用报纸包扎好，121°C灭菌30min，备用； (5) 50ml和100mL烧杯：洗净用报纸包扎好，121°C灭菌30min，备用； 2、 培养基及化学试剂的配制 (1) 培养基：肉汁腺培养基（BPA):每1000mL培养基中添加牛肉浸膏3.Og、蛋白腺 5.Og、酵母膏1.Og、葡萄糖10.Og和琼脂18-20g，余量为蒸馈水；0.IMPa, 115°C高溫灭菌 SOmin; 肉汁腺液体培养基：每1000HiL培养基中添加牛肉浸膏3.Og、蛋白腺5.Og、酵母膏1.Og和葡萄糖10.Og,余量为蒸馈水；0.IMPa, 115°C高溫灭菌30min; (2) 化学试剂的配制 浓度为Imol/L的化OH水溶液：称取4g化OH用80血水溶解，定容至100血； 7%Hcl:量取70%Hcl10血，定容至100血；质量分数为75%乙醇水溶液：量取99%无水 乙醇75mU用无菌去离子水定容至IOOmL;质量分数为0.l%HgCl2水溶液：称取0. 1巧gCl2 用80血水溶解，加水定容至100血；质量分数为5%NaC10水溶液：量取10%的化ClO50血， 加入定容至100HiL; 3、操作方法 (1)称量并且表面消毒 称连翅叶片5g，用自来水冲洗干净，在无菌操作台上，依次用质量分数为75%乙醇水溶 液和质量分数为0.l%HgCl2水溶液对翅叶片的表面进行消毒5分钟，再用无菌水漂洗翅叶 片4次； (2) 检验消毒效果 取最后一次无菌水冲洗液，涂布到BPA平板上，37°C培养3天，检验灭菌效果；若发现皿 中无菌落出现，证明该叶片表面灭菌彻底，否则该分离结果不能使用； (3) 样品处理 用灭过菌的剪刀将叶片剪成IOmm的正方形，置于研鉢中，加15ml无菌水反复研磨捣 碎，静置30min钟后，用无菌移液管取Iml上清液置于IOml试管中，加水梯度稀释到浓度为 10 1-