ate.php?act=restriction_new&cid=3a5cl64f75725f3f6b2d42522180bb48)
[0164] 4.2梨??~2.2-级序列的基本分析
[0165] 利用瑞士生物信息学研究所（Swiss Institute of Bioinformatics SIB)的 ExPASy提供的ProtParam tool对Ppfw2.2的分子量、等电点、氨基酸组成及蛋白的不稳定系 数等进行预测。网址如下：http: //www. expasy. ch/tools/protparam.html
[01 ??] 4.3梨Ppfw2.2二级结构和功能预测
[0167] 运用PBIL LY0N-GERLAND对蛋白质序列进行二级结构预测（Secondary structure prediction)，网址：http: //npsa-pbil · ibcp · fr/cgi-bin …/NPSA/npsa_hnn. html 〇疏水 性分析:利用瑞士生物信息学研究所的ExPASy服务器上的ProtScale程序对梨Ppfw2.2做疏 水性分析，网址:http: //us · expasy · org/cgi-bin/protscale · pi。磷酸化位点分析:利用丹 麦科技大学(DTU)的CBS服务器上的NetPhos2. OServer程序对梨Ppfw2.2做磷酸化位点分 析。网址如下:http://www. cbs.dtu.dk/services/NetPhos/。蛋白质超家族分析:利用美国 国家生物技术信息中心(NCBI)中的BLASTp对梨Ppfw2.2做蛋白质超家族分析。网址如下： http: //supf am · mrc-lmb · cam · ac · uk/SUPERFAMILY/cgi-bin。跨膜区分析：利用丹麦科技大 学(DTU)的CBS服务器上的TMHMM Server v.2.0程序对梨Ppfw2.2进行蛋白序列跨膜区分 析。网址如下:http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/。蛋白质亚细胞定位分析:利用日 本国立基础生物学研究所的PS0RT II程序对梨Ppfw2.2做亚细胞定位分析，网址:http:// psort. ims.u-tokyo.ac. jp/f orm.html。其它特殊局部结构预测：SignalP:预测蛋白质序列 中信号肽的剪切位点。COILS的网址是：http : //www. ch · embnet · org/sof tware/C0ILS_ form.Html 〇SignalP的网址是:http: //www. cbs · dtu. dk/services/SignalP/〇
[0168] 4.4梨??€￥2.2三级结构预测
[0169] 使用同源模建方法构建梨Ppfw2.2的三维结构，步骤如下：（1)资料库搜寻及选择 模板（templates); (2)多重序列排列（multiple sequence alignment); (3)骨架 (framework)的建构，环状结构（loop)模拟以及侧链（side-chain)模拟；（4)能量最小化 (energy minimization); (5)结构合理性评价。在整个的蛋白质结构预测过程中，模板的筛 选和对目标序列的模建对于最终的建模影响最大。采用多种方法来提高这个过程的精度， 这对整个蛋白质结构预测过程有很重要的作用。用于模建的数据库及网址:模建模版搜索 使用PSH3LAST程序网址为:http: //myhits · isb-sib · ch/cgi_bin/psi_blast。模型评价使 用UCLA-D0E的SAVEs在线蛋白检测服务器网址为：http : //nihserver .mbi · ucla · edu/ SAVES/。模板的筛选：以Ppfw2.2推导氨基酸序列为探针，利用PSI-BLAST程序搜数据库， 选取序列相似性以及结构分辨率均最高的蛋白质作为模板。结构的模建:专业蛋白质分析 系统ExPASy(Expert Protein Analysis System)将三级结构预测（Tertiary structure prediction)分为三类：同源模建方法（Homologous Mode ling)包括Swiss-mode 1、 3Djigsaw、Cphmodels、ESyPred3D、Geno3d，需要有同源的蛋白三级结构为基础进行预测；折 叠识别方法（Threading)又称穿针引线法包括：Phyre、Fugue、HHpred、Libellula、L00PP、 SAM-T02、Threader、SWEET;从头计算方法（Ab initio predict ion)包括 HMMSTR/Rosetta， 只需要蛋白质序列即可进行结构预测，然而由于巨大的计算量，这种方法并不实用。目前， 该程序只支持小于150aa的氨基酸残基。蛋白质二级结构的预测依据PSIPRED(http:// bioinf.cs.ucl.ac. uk/psipred/)程序。功能域预测米用SMART (http : //smart · embl-heide lberg · de/)。模建结果与评估分别米用SWISS-MODEL的 Structure assessment和SAVS (Structural Analysis and Verification Server)程序来检测优化后模型的键长、键角 及二面角的合理性。采用蛋白质三维图象软件Swiss-Pdb Viewer3.7显示模型。结构对比根 据距离平方和最小的叠合方法(Least-squares superposition)，将两个蛋白质分子的结 构进行叠合。
[0170] 5.同源性与系统发育分析
[0171] 对Ppfw2.2相近物种进行初步的系统发育分析，方法如下:使用DNAMAN6.0软件对 梨 Ppfw2.2和其他物种fw2.2:葡萄（Vitis vinif era，XP_002284819)、番前（Solanum lycopersicum，XP_004236941)、草莓（Fragaria vesca，XP_004297478)、马铃薯（Solanum tuberosum，XP_006355072)、梅（Prunus mume，XP_008221439)、苹果（Malus domestica，XP_ 008360029)、烟草（Nicotiana sylvestris，XP_009762819)和棉花（Gossypium raimondii， XP_012467237)的进行同源性比对并绘制进化树。
[0172] 6.亚洲梨Ppfw2.2的qRT-PCR的表达检测
[0173] 参照Primescript II 1st stand cDNA synthesis kit试剂盒说明书（TaKaRa)将 RNA反转录成cDNA。按照标准实时定量PCR(qRT-PCR)引物设计原则设计碳水化合物代谢相 关酶基因的引物。梨31、35、5?5、嫩0-50!1、56?0!1基因的氨基酸序列和核苷酸序列的信息来 自于本实验室梨果实转录组数据。实时荧光定量PCR检测时，以梨18S基因作为内参。在ABI 7900型定量扩增仪(ABI，美国），扩增过程实时监测及荧光信号检查、数据的储存和分析均 由ABI7900扩增仪SDS2.0软件完成。实时荧光定量反应体系为20yL，含有10yL SYBR Premix Ex TaqII(TaKaRa)，2.0yL cDNA，6.4yL ddH20,上下游引物各0.8yL(引物浓度为ΙΟμ mol· L-l)。反应程序为:95 °C预变性5s，65 °C退火30s，72°C延伸30s，40次循环。每次qRT-PCR实验 均设阴性对照，每个样品重复3次。
[0174] 所用引物如下：
[0175] PpfwL119：TCGTTCCCCACCAATCTTCA(SEQ ID NO.:11)
[0176] PpfwL194：ACCTCCACCAACATGTCGAT(SEQ ID NO.:12)
[0177] PpfwL532：TCATGCTTCTACCGCTCCAA(SEQ ID NO.:13)
[0178] PpfwL96：TCTCTCAACCTCCTCATCGC(SEQ ID NO.:14)
[0179] PpfwL272：ACGAAGACATGAGCTCCCAA(SEQ ID NO.:15)
[0180] PpfwR291：TTGGGAGCTCATGTCTTCGT(SEQ ID NO.:16)
[0181] PpfwR433：GGCCAAAAGTGATGCATGGA(SEQ ID NO.:17)
[0182] PpfwR764：TCTCGACTCATGCCTTCCTC(SEQ ID NO.:18)
[0183] PpfwR253：GTTCACTACCGGAGCTGACT(SEQ ID NO.:19)
[0184] PpfwR514：CCGTCACACAAGCAATCAGT(SEQ ID NO.:20)
[0185] 实施例1
[0186] 亚洲梨Ppfw2.2基因序列的克隆
[0187] 以亚洲梨果肉组织的cDNA的第一链为模板，通过PCR反应扩增Ppfw2.2基因。
[0188] 结果见图1所示，PCR扩增得到了Ppfw2.2基因（图1A)及Ppfw2.2的CDS序列（图1B)。 测序结果表明，Ppfw2.2片段全长为812bp，含有开放性阅读框627bp，编码208个氨基酸残 基，与亚洲梨转录组拼接结果一致。Ppfw2.2的3 ' -UTR长度为41bp，终止密码子为TGA(图2)。 Ppfw. 2.2的5 'UTR长度为144bp。利用相关软件进行同源性比对后，发现该片段含有PLAC8超 家族序列的fw2.2保守的氨基酸序列。从而证明本实施例克隆得到的基因正是目的基因 fw2.2的cDNA 序列。
[0189] 实施例2
[0190] 梨Ppfw2.2的生物信息学分析
[0191] 利用0RF Finder软件分析fw2.2开放性阅读框(0RF)，长度为627bp，编码208个氨 基酸。用ProtParam tool软件预测该基因所编码的蛋白质相对分子量为23.076kD，等电点 (PI)为5.67，分子式为C1QQ4H1514N272O311S22 c^PpfwS. 2不含信号肽，不属于分泌蛋白，亚细胞定 位于细胞质膜，包含跨膜螺旋，是细胞质膜蛋白；Ppfw2.2包含19个磷酸化位点（Ser: 12， Thr: 3，Tyr:4);Ppfw2 · 2包含与PLAC8同源的富半胱氨酸蛋白（Cysteine-rich Protein)的 保守结构域。采用？1^(1;[(^口1'(^6；[11在先软件预测？口€￥2.2蛋白质的二级结构，？口€￥2.2由 20.67 %的α-螺旋和74.52 %的不规则卷曲组成。通过SWISS-MODEL在线工具进行预测， Ppfw2.2三维结构如图3所示。
[0192] 实施例3
[0193] Ppf w2.2蛋白的亚细胞定位
[0194] 通过TMHMM跨膜区预测工具，来预测Ppfw