出芽短梗霉氮响应转录因子Gat1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及出芽短梗霉氮响应转录因子Gatl，还涉及出 芽短梗霉氮响应转录因子Gatl在提高聚苹果酸产量中的应用。
【背景技术】
[0002] 聚苹果酸(Polymalic acid，PMA)是一种新型的可完全生物降解的聚酯型聚合物， 由于其具有良好的水溶性，生物降解性和生物相容性，可用于生物医学材料、营养强化剂、 食品包装等领域，具有广泛的应用前景。此外，聚苹果酸的单体为L-苹果酸，是一种优良的 食品酸化剂，市场年需求在10万吨以上。
[0003] 聚苹果酸主要由出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)代谢产生，研究发现发 酵过程氮源对聚苹果酸合成及细胞生长具有显著影响，且在氮限制条件下有利于聚苹果酸 合成，但是对于该机制并不十分清楚，如氮响应转录因子Gatl是否参与调控聚苹果酸合成 尚未报道。因此，有必要对氮响应转录因子Gatl进行研究，探究氮源对聚苹果酸合成影响的 原因，以进一步提高聚苹果酸的产量。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供出芽短梗霉氮响应转录因子Gatl;本发明 的目的之二在于提供含有编码出芽短梗霉氮响应转录因子Gatl基因的过表达载体;本发明 的目的之三在于提供出芽短梗霉氮响应转录因子Gatl在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中 的应用;本发明的目的之四在于提供含有编码所述出芽短梗霉氮响应转录因子Gatl基因的 过表达载体在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 1、出芽短梗霉氮响应转录因子Gatl，其氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示;编码区的 核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示;基因组序列如SEQ ID N0.3所示。
[0007] 2、含有编码所述出芽短梗霉氮响应转录因子Gatl基因的过表达载体。
[0008] 优选的，所述过表达载体由以下方法构建:扩增编码出芽短梗霉氮响应转录因子 Gat 1的基因组序列，然后连入过表达载体pBARGPEI的构巢曲霉gpdA强启动子与trpC终止子 之间，然后扩增含构巢曲霉gpdA强启动子、出芽短梗霉氮响应转录因子Gatl和trpC终止子 的表达框，连入pk2-bar-gus的EcoRI酶切位点处，得过表达载体。
[0009] 优选的，扩增编码出芽短梗霉氮响应转录因子Gatl的基因组序列的引物如SEQ ID NO. 26和SEQ ID NO. 27所示；扩增含构巢曲霉gpdA强启动子、出芽短梗霉氮响应转录因子 Gatl和trpC终止子的表达框的引物如SEQ ID N0.28和SEQ ID N0.29所示。
[0010] 3、所述出芽短梗霉氮响应转录因子Gatl在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应 用。
[0011] 4、所述含有编码所述出芽短梗霉氮响应转录因子Gatl基因的过表达载体在提高 出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。
[0012] 本发明的有益效果在于：本发明成功获得了出芽短梗霉氮响应转录因子Gatl基 因，并获得了该基因的氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示，编码区序列如SEQ ID N0.4所示，基 因组序列如SEQ ID N0.3所示;对基因功能研究发现，敲除出芽短梗霉氮响应转录因子Gatl 基因后出芽短梗霉的生物量降低，同时聚苹果酸产量也降低;而过表达出芽短梗霉氮响应 转录因子Gatl后聚苹果酸产量明显提高，约为10-30%，对进一步提高聚苹果酸产量具有重 要意义，同时对提高出芽短梗霉其他代谢产物如普鲁兰多糖等的发酵产量也具有指导意 义。
【附图说明】
[0013] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0014] 图 1 为pk2_gus 和pk2-Ptrpc_hyg-Ttrpc 载体图谱（A:pk2_gus ;B:pk2-Ptrpc_hyg-Ttrpc)〇
[0015] 图2为出芽短梗霉敲除转化子的PCR引物设计原理图及验证结果。
[0016] 图3为pBARGPEI和pk2-bar-gus的载体结构图（A:pBARGroi载体结构图；B:pk2-bar-gus载体结构图）。
[0017] 图4为出芽短梗霉Gatl过表达菌株的PCR验证。
【具体实施方式】
[0018] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著） 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0019] 实施例1、克隆出芽短梗霉氮响应转录因子Gatl基因
[0020] 根据出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)全基因组测序结果，利用生物信息 学软件设计氮响应转录因子Gatl基因组扩增引物，上游引物为Gat 1-F: 5'-atgacatcgccgcgcacc-3'（SEQ ID Ν0· 1);下游弓丨物：5'-ttacaaactcatggtaagccattccc-3' (SEQIDN0.2)，然后以出芽短梗霉(A.pullulansCCTCCM2012223)基因组DNA为模板，进 行PCR扩增，PCR扩增条件为:94°C预变性5min; 94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，30 个循环；72°C后延伸10min;25°C保温10min。然后将PCR产物经琼脂糖电泳，并回收目的片 段，回收产物连接pMD 19-T Vector，经测序获得如SEQ ID N0.3所示序列，其开放阅读框序 列如SEQ ID N0.4所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示。
[0021] 实施例2、出芽短梗霉氮响应转录因子Gatl基因敲出
[0022] (1)出芽短梗霉氮响应转录因子Gatl基因敲除载体的构建
[0023] 利用同源重组的方法，以潮霉素抗性标记hyg替换掉氮响应转录因子Gatl中 1074bp的一段序列，包括从ATG开始的894bp和ATG上游的180bp，以破坏其表达。具体是以出 芽短梗霉(A.pullulans CCTCC M2012223)基因组为模板，使用phata Max Super-Fidelity D N A polymerse 高保真 Taq 酶，W5arm-F:5'-agtggatcccccggggaattcccatactgtcccatttctcg_3'（SEQ ID N0.6);5arm-R:5'_ cagtaggttagctggggttgc-3 '（SEQ ID NO. 7)扩增上游同源臂5arm，同时以3arm_F: 5 ' -gtttagaggtaatccttcttcaaacgacgtgccgactgc-3'（SEQ ID N0.8);3arm-R:5'- acagctatgacatgattacggcaaccattcgtgtaggagcag-3'（SEQ ID N0.9)为引物扩增下游同源 臂3arm;获得的上游同源臂5arm如SEQIDN0.10所示，下游同源臂3arm如SEQIDN0.11所 不。
[0024] 再以pk2-PtrpC-hyg-Ttrpc载体为模板（图1中B)(参见文献"涂光伟，王永康，冯 俊，李晓荣，郭美锦，邹祥.农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化及高效筛选聚苹果酸高产菌 株·生物工程学报，2015,31(7):1063-1072 "）WHYGL-F:5'-caaccccagetaacctactggtcgacagaagatgacattgaag-3'（SEQ ID NO·12)^PHYGL-R:5'-acagctatgacatgattacgtgctccatacaagccaacc-3'（SEQ ID NO. 13)扩增潮霉素抗性标的左 端 HYG-L (如 SEQ ID N0.14 所示）；同时以！1￥61?-?:5'-agtggatcccccggggaattacctgcctgaaaccgaact_3'（SEQ ID N0.15)和阶61?-1?:5'-aagaaggattacctctaaacaagtgt-3'（SEQ ID NO. 16)扩增潮霉素抗性标的右端HYG-R(如SEQ ID NO. 17所示），其中HYG-L的右端和HYG-R的左端有427bp的同源序列。将扩增产物进行琼 脂糖凝胶电泳，然后回收备用。
[0025] 使用一步克隆试剂盒（ClonExpress? MultiS One Step Cloning Kit)将上游同 源臂5arm和潮霉素抗性标记的左端HYG-L连接至pk2-gus的EcoRI酶切位点处（图1中A)。具 体原理是:将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5'端引入线性化克隆载体 末端序列，使得插入片段PCR产物5 '和3'最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的 完全一致的序列（15bp~20bp)，这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体 按一定比例混合后，在重组酶的催化下，仅需反应30min即可进行转化，完成定向克隆。具体 操作是:将pk2_gus载体在EcoRI酶切位点处酶切线性化，在5arm的正向PCR引物5arm_F(SEQ ID NO. 6) 5 '端引入线性化载体pk2-gus上游末端20bp序列，使得5arm的PCR产物5 '端带有和 线性化载体pk2-gus上游末端对应的完全一致的序列（20bp);同理在HYG-L的正向引物 HYGL-F(SEQ ID N0.12)5'端引入5arm片段的下游末端20bp序列，使得HYG-L的PCR产物5'端 带有和5arm下游末端完全一致的20bp序列；在HYG-L的反向引物HYGL-R(SEQ ID N0.13)5' 端引入线性化载体pk2-gus下游末端20bp序列，使得HYG-L的PCR产物3 '端带有和线性化载 体pk2-gus下游末端完全一致的20bp序列；然后以线性化载体pk2-gus和插入片段5arm、 HYG-L的PCR产物配制重组反应体系，37°C反应30min实现将片段5arm和HYG-L顺序拼接并克 隆至载体pk2-gus的EcoRI酶切位点处。构建敲除载体pk2-gus-5arm-HygL，转化E · co 1 i DH5 α感受态细胞;采用同样的方法，将潮霉素抗性标记的右端HYG-R和下游同源臂3arm连接至 pk2-gus的EcoRI酶切位点处，构建敲除载体pk2-gus_HygR-3arm(图1)，转化E. coli DH5a感 受态细胞。然后分别以5arm-F/HYGL-R引物和HYGR-F/3arm-R引物PCR验证转化子，经测序验 证无误后