专利名称：一种生产不同分子量普鲁兰糖的方法
技术领域：
本发明涉及微生物法发酵生产普鲁兰糖的生产方法。
背景技术：
普鲁兰糖(Pullulan)由出芽短梗霉分泌的一种易溶于水的微生物多糖，1939年 R-Baner首先在出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)的发酵液中发现一种黏性物 质，即普鲁兰糖。1959年Bender等首先表征了出芽短梗霉发酵产生的普鲁兰糖是由中性 葡萄糖组成，它是葡萄糖按α-1，4-糖苷键结合成麦芽三糖，两端再以α-1，6_糖苷键反复 连接而成高分子多糖，是一种易溶于水 、安全无毒害、可食用、低热值的天然多糖，因其可塑 性、成膜性好、簿膜隔气性佳，故常用其作为保色、保香、保鲜、抗氧化等的包装材料。在医 药、食品、化妆品、农药等行业具有广泛的用途。因其在自然界可被微生物降解利用，不会引 起环境污染，故被誉为无公害塑料。普鲁兰糖的生产及应用已经有30多年的研究历史，日本林原公司在70年代进行 中试规模工业化生产，至今一直垄断国际市场。国内经过20年研究也有较大进展，但仍存 在较多问题，如色素水平高、底物糖转化率低、发酵时间长等问题，还有一个突出的问题就 是得到的普鲁兰多糖分子量较低或分子量范围较广，而普鲁兰糖的应用与其分子量存在直 接联系，这就导致普鲁兰糖附加值降低。本发明通过控制发酵培养基氮源组成及搅拌速度，可以得到预期分子量的普鲁兰 糖产品，同时无黑色素产生，提高了普鲁兰糖的收率及附加值。
发明内容
(1)种子培养基及种子液制备a.种子培养基组成为蔗糖5% ；酵母膏0. 2% ； NaClO. l%;MgS04 ·7Η20 0. 02%;Κ2ΗΡ04 ·3Η20 0· 63% ; (NH4) 2S040. 06%，初始 ρΗ 6.5。115°C 灭菌20分钟；b.种子液制备将步骤(1)中所得出芽短梗霉突变菌株接种到装有1/5种子 培养基的500mL三角瓶中，培养温度28 士 1 °C，摇床转速250r/min，培养24 36h，种子浓度 0.8 2. 5X IO8个/mL，作为一级种子，将一级种子按2% 10%接种量接入种子培养基， 逐级扩大至适合相应接种量，作为发酵种子液。(2)发酵生产普鲁兰多糖的基本培养基为碳源10% ；酵母膏0. 2% ；NaCl 0. 1%； MgSO4 · 7H20 0. 02% ；K2HPO4 · 3H20 0. 63% ； (MM)2SO4O. 06%，初始 pH 6. 5。其中碳源包括 蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、DE值为30 70的淀粉水解液等。按欲得普鲁兰糖分子量的不同，调 节发酵培养基中的氮源组成，其中酵母膏调节范围为0. 2.0%，(MM)2SO4调节范围为 0.02% 0. 1%，酵母膏含量越高则得到的普鲁兰多糖分子量越低，(MM)2SO4含量越高则 普鲁兰多糖分子量越高，在其调节范围内适当组合酵母膏及(NH4) 2S04,培养温度28士 1 °C， 罐压0.01 0. 05Mpa。发酵前24h，搅拌速度为150 250r/min，24 48h搅拌速度为 300 400r/min，48h后搅拌速度为100 200r/min。发酵时间为60 72h。(3)发酵液经除菌、浓缩后喷雾干燥得到普鲁兰糖产品。
具体实施方法实施例一种子培养基蔗糖5%;酵母膏 0. 2% ；NaCl 0. 1 % ；MgSO4 · 7H20 0. 02 % ； K2HPO4 · 3Η200· 63% ； (MM)2SO4O. 06%，初始 ρΗ 6. 5。115°C灭菌 20min。发酵生产所用培 养基为蔗糖10% ；酵母膏0.6% ;NaCl 0. 1 % ；MgSO4 · 7H20 0. 02% ；K2HPO4 · 3H20 0. 63% ； (MM)2SO4O. 05%，初始 ρΗ 6. 5。115°C灭菌 20min。种子液培养将中所得出芽短梗霉突变菌株接种到装有1/5种子培养基的500mL 三角瓶中，培养温度28士 1°C，摇床转速250r/min，培养24h，种子浓度2. OX IO8个/mL，作 为一级种子，将一级种子按2%接种量将菌种接入装有1/5种子培养基的500mL三角瓶中， 培养温度28士 1°C，摇床转速250r/min，培养24h作为二级种子液。按2%接种量将二级种 子液接入含有20L种子培养基的30L发酵罐中，培养温度28 士 1 °C，罐压0. 03Mpa,搅拌速度 180r/min,通气量lL/min，培养24h，作为三级种子。lm3发酵罐发酵按2%接种量将种子液接入含有700L发酵培养基的Im3发酵罐 中，培养温度28 士 1 °C，罐压0. 03Mpa,通气量为3L/min。发酵前24min，搅拌速度180r/min， 24 48min调搅拌速度到400r/min。48min以后，搅拌速度调为150r/min，继续发酵12min， 发酵结束，普鲁兰糖分子量为糖转化率为67%，平均分子量为8万道尔顿。实施例二 种子培养基蔗糖5%;酵母膏 0. 2% ；NaCl 0. 1 % ；MgSO4 · 7H20 0. 02 % ； K2HPO4 · 3Η200· 63% ； (MM)2SO4O. 06%，初始 ρΗ 6. 5。115°C灭菌 20min。发酵生产所用培养基为DE值55的玉米淀粉水解液10% ；酵母膏1.0% ；NaCl 0. 1% ；MgSO4 · 7H20 0. 02% ；K2HPO4 · 3H20 0. 63% ； (MM)2SO4O. 02%，初始 ρΗ 6. 5。115°C灭 菌 20min。种子液培养将中所得出芽短梗霉突变菌株接种到装有1/5种子培养基的500mL 三角瓶中，培养温度28士 1°C，摇床转速250r/min，培养24h，种子浓度2. OX IO8个/mL，作 为一级种子，将一级种子按2%接种量将菌种接入装有1/5种子培养基的500mL三角瓶中， 培养温度28士 1°C，摇床转速250r/min，培养24h作为二级种子液。按2%接种量将二级种 子液接入含有20L种子培养基的30L发酵罐中，培养温度28 士 1 °C，罐压0. 03Mpa,搅拌速度 180r/min，通气量lL/min，培养24h，作为三级种子。Im3发酵罐发酵按2%接种量将种子液接入含有700L发酵培养基的Im3发酵罐 中，培养温度28 士 1°C，罐压0.03Mpa，通气量为3L/min。发酵前24h，搅拌速度180r/min， 24 48h调搅拌速度到400r/min。48h以后，搅拌速度调为150r/min，继续发酵12h，发酵 结束，普鲁兰多糖分子量为糖转化率为67%，平均分子量为40万道尔顿。实施例三种子培养基蔗糖5%;酵母膏 0.1% ；NaCl 0. 1 % ；MgSO4 · 7H20 0. 02 % ； K2HPO4 · 3Η200· 63% ； (MM)2SO4O. 08%，初始 ρΗ 6. 5。115°C灭菌 20min。发酵生产所用培养基为蔗糖10% ；酵母膏0.5% ;NaCl 0. 1 % ；MgSO4 · 7H20 0. 02% ；K2HPO4 · 3H20 0. 63% ； (MM)2SO4O. 08%，初始 ρΗ 6. 5。115°C灭菌 20min。种子液培养将中所得出芽短梗霉突变菌株接种到装有1/5种子培养基的500mL 三角瓶中，培养温度28士 1°C，摇床转速250r/min，培养24h，种子浓度2. OX IO8个/mL，作为一级种子，将一级种子按2%接种量将菌种接入装有1/5种子培养基的500mL三角瓶中， 培养温度28士 1°C，摇床转速250r/min，培养24h作为二级种子液。按2%接种量将二级种 子液接入含有20L种子培养基的30L发酵罐中，培养温度28 士 1 °C，罐压0. 03Mpa,搅拌速度 180r/min,通气量lL/min，培养24h，作为三级种子。 Im3发酵罐 发酵按2%接种量将种子液接入含有700L发酵培养基的Im3发酵罐 中，培养温度28 士 1°C，罐压0.03Mpa，通气量为3L/min。发酵前24h，搅拌速度180r/min， 24 48h调搅拌速度到400r/min。48h以后，搅拌速度调为150r/min，继续发酵12h，发酵 结束，普鲁兰糖分子量为糖转化率为67%，平均分子量为18万道尔顿。
权利要求
一种生产不同分子量普鲁兰糖的方法，由以下步骤组成(1)按2％～10％接种量将出芽短梗霉菌种接到种子培养基中培养，得到种子液；(2)按2％～10％接种量将上述种子液接到发酵培养基中培养，得到发酵液；(3)上述发酵液经下游处理得到普鲁兰糖；其特征在于通过控制发酵培养基的氮源组成，制得不同分子量的普鲁兰糖。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中的种子培养基的组成为蔗糖5%、 酵母膏 0. 2%, NaCl 0. 1 %, MgS04 7H20 0. 02%, K2HP04 3H20 0. 63%, (NH4)2S040 . 06%, 其余为水；初始pH 6. 5 ；培养温度28 士 1°C ；摇床搅拌速度250r/min。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中的发酵培养基的组成为碳源、酵 母膏、NaCl、MgS04 7H20、K2HP04 3H20、(NH4)2S040. 06%、其余为水；初始 pH 6. 5 ；其中碳源 包括蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和/或DE值为30 70的淀粉水解液；酵母膏在发酵培养基中 的含量为0. 2.0%，(NH4)2S04在发酵培养基中的含量为0.02% 0. ；培养温度 28 士 1°C，发酵 60 72h。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于发酵培养基的组成为碳源10%、酵母膏 0. 2%,NaCl 0. l%,MgS04 '7H20 0. 02%、K2HP04 3H20 0. 63%、(NH4)2S040 . 06%、其余为水。
5.权利要求1所述的方法，其特征在于通过调节发酵培养基中酵母膏和(NH4)2S04 的含量，制得不同分子量的普鲁兰糖；酵母膏含量越高则得到的普鲁兰糖分子量越低， (NH4)2S04含量越高则普鲁兰糖分子量越高。
6.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)的培养温度28士1°C，罐压0.01 0. 05Mpa ；发酵前24h，搅拌速度为150 250r/min，24 48h搅拌速度为300 400r/min， 48h后搅拌速度为100 200r/min。发酵时间为60 72h。
7.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的下游处理包括除菌、浓缩和 干燥。
全文摘要
本发明涉及普鲁兰糖的发酵生产，通过控制发酵培养基的组成及发酵参数得到不同分子量的普鲁兰糖产品。生产不同分子量普鲁兰糖的方法包括以下步骤(1)种子及发酵培养基的制备；(2)将活化后菌种按2％～10％接种量将菌种接到种子培养基，28±1℃培养24～36h，种子浓度0.8～2.5×108个/mL；(3)按2％～10％接种量将种子液接到发酵培养基，罐压0.01～0.05Mpa，温度28±1℃，发酵60～72h；(4)发酵液经除菌、浓缩后喷雾干燥得到普鲁兰糖产品。
文档编号C12P19/10GK101942492SQ20091014876
公开日2011年1月12日 申请日期2009年7月3日 优先权日2009年7月3日
发明者候重文, 凌沛学, 刘飞, 张晓元, 朱希强, 李海军, 李霞, 相茂功, 苏移山, 郭学平, 陈勉, 颜震 申请人:山东省生物药物研究院