可抑制RAGE与Aβ的结合或能与Aβ/RAGE结合的富脯胺酸胜肽及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明系关于一种富脯胺酸胜肽(PRP)产品，取自一乳源而非基因合成的，特别涉及可抑制RAGE与A β的结合或能与A β /RAGE结合的富脯胺酸胜肽产品。
【背景技术】
[0002]全球失智症人口已超过3，500万，阿兹海默症已为先进国家人口老化的共同问题。目前市场上有银杏萃取物EGb761作为防止老人失智症的保健食品，于中草药销售量占欧美第一名。惟银杏萃取物EGb761的预防效果经常受到质疑。此外，许多研究报导显示，常食乳品可降低老人失智症的风险。研究报导也显示乳品中所含有富脯胺酸胜肽(proline-rich peptide, PRP),为有助于改善阿兹海默症患者脑部功能的主因。因此,市面上出现从初乳中萃取初乳素(Colostrinin)的产品，用来防治阿兹海默症。初乳是由雌性哺乳动物乳房在分娩后最初数天内产出的黄色粘稠液体。分娩数天后它将被成熟母乳替代。与成熟母乳相比，初乳中含有丰富的生长因子和免疫球蛋白等机能性成分，特别是PRP的含量比成熟母乳多很多。美国专利US8，168，585有说明如何从初乳中萃取初乳素(Colostrinin)的方法。然而，此等初乳素产品虽含有浓度高于初乳的PRP，却有其它缺点。举例而言，此等初乳素产品须从初乳中萃取，而初乳却是分娩后的短暂期间才有，且为初生仔畜健康所必需。此等初乳素产品原料来源受限，产品价格因此居高不下。因此，市场上仍期待有更创新技术解决上述问题。
【发明内容】
[0003]本发明提供一种含有富脯胺酸胜肽(proline-rich peptide, PRP)的产品，此产品具有可抑制RAGE与Αβ的结合或能与Αβ /RAGE结合的功能。此产品可以一般的乳品产制，不受限于初乳。此产品可减少因RAGE或Αβ引起疾病的风险，如神经退化性疾病或糖尿病等。
[0004]本发明系将一般乳蛋白有限分解后，利用特定单源抗体分离出具有能与Αβ或RAGE结合，或能抑制RAGE与A β结合的富脯胺酸胜肽。详言之，本发明利用A β容易以疏水性聚集，而RAGE含高量脯胺酸区域等特性，设定特定的氨基酸序列条件。依据所设定的条件搜查乳蛋白的氨基酸序列，以选定欲合成的PRP的氨基酸序列。然后进一步合成各种含所选定PRP序列的胜肽。藉由所合成胜肽，一方面制造各合成胜肽的单源抗体；一方面检测各合成胜肽与A β或RAGE的结合力，以及抑制RAGE与A β结合的能力。接着，本发明将具有与A β或RAGE结合功能的合成胜肽的单源抗体，与亲和性色层分析的树脂结合并制成亲和性管柱。本发明于另一方面将一般乳品进行有限分解以产制含多种乳胜肽的水解物。然后，使含多种乳胜肽的水解物流经上述的亲和性管柱，藉此收集特定功能性的乳源富脯胺酸胜肽，以制成富脯胺酸胜肽的产品。
[0005]本发明尚包含其他各方面及各种实施例，以解决其他问题并合并上述的各方面详细揭露于以下实施方式中。
[0006]图式简单说明
[0007]图1为本发明的方法的流程图。
[0008]图2A及图2B为具有Pro-X-X-Pro基序的PRP结构示意图；图2C为具有Pro-X-X-X-Pro基序的PRP结构示意图，其中Pro代表脯胺酸，X代表任一氨基酸。
[0009]图3为在步骤Ml，步骤M2及步骤M3取样的电泳分析结果。
[0010]图4显示各种合成PRP与RAGE结合的实验结果。
[0011]图5A与5B显示合成PRP与Αβ结合的实验结果。
[0012]图6Α与6Β显示合成PRP与RAGE结合的实验结果。
[0013]图7Α与7Β显示合成PRP抑制RAGE与Αβ结合的实验结果。
[0014]图8Α显示乳源功能性PRP能与A β及RAGE结合的实验结果；图8Β显示乳源功能性PRP能抑制RAGE与A β结合的实验结果。
[0015]图9显示本发明的酪蛋白水解物过滤与萃取的示意图。
[0016]实施方式
[0017]以下将参考所附图式示范本发明的较佳实施例。所附图式中相似元件系采用相同的元件符号。应注意为清楚呈现本发明，所附图式中的各元件并非完全按照实物的比例绘制，而且为避免模糊本发明的内容，以下说明亦省略习知零组件、相关材料、及其相关处理技术。
[0018]本发明的研发动机出自于对阿兹海默症的主要病因的理解与研究。研究显示，存在人体中名为β_淀粉样蛋白(β-Amyloid Protein, Αβ )的蛋白质在阿兹海默症当中扮演着很重要的角色。Αβ在人类脑中是自然产生的。当人类老化时，Αβ可能过多而在脑中聚集，形成斑块(senile plaque)。目前了解阿兹海默症的病因主要有三:(I)细胞外Αβ聚集成球聚体或斑块；(2)神经细胞内Tau蛋白过度磷酸化，形成神经纤维缠结(neurofibrillary tangle) ； (3)发炎或氧化直接或间接伤害神经细胞。这三种原因中,Αβ的聚集被认为是阿兹海默症的关键病因。
[0019]详言之，Αβ系由位于细胞膜上的β_淀粉样蛋白前体(amyloid precursorprotein,APP)经β-secretase与Y-secretase所分解产生。Αβ含有42或40个氨基酸的分子。以下显示含有42个氨基酸的Aβ分子
[0020]I Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-LeU-Val-Phe-Phe-
[0021]21 Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-1le-1le-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-
[0022]41 Ile-Ala
[0023]人类脑脊液与血浆中Aβ 1-40比Αβ 1_42分别多10倍与1.5倍。但Αβ 1_42末端多两个疏水性氨基酸，聚集较快，也是斑块的主要成分。Αβ含有Lysl6?Glu22序列会自动聚集。Gly29?Val40序列则以反向排列β折板(antiparallel β-sheet)紧密形成球聚体(globulomers)。Αβ含高量的疏水性氨基酸,疏水性结合在其分子间的聚集扮演重要的角色。
[0024]RAGE 为进阶糖化产物的受体(receptor for advanced glycat1nendproduct,RAGE) o糖尿病或高血糖产生的进阶糖化产物(advanced glycat1nendproduct,AGE)主要经由血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)内皮细胞上的RAGE进入脑部而伤害神经。RAGE也会和Αβ结合。人类脑脊液中含Αβ 2.5ng/ml,血衆含0.9ng/ml。周边血液的Αβ可经BBB的RAGE运入脑内。A β与RAGE的结合也会伤害细胞，破坏BBB的紧密连结，失去血脑屏障的功能。因此，抑制RAGE与Αβ结合的药物即可望用于防治因血脑屏障失能所造成的疾病，如阿兹海默症等。
[0025]以下显示RAGE分子的氨基酸序列。从RAGE分子的氨基酸序列可知RAGE分子含高量脯胺酸。
[0026]I maagtavgaw vlvlslwgav vgaqnitari ge^lvlkckg apkkppqrle wklntgrtea
[0027]61 wkvIs^qggg ^wdsvarvngslfl^avg iqdegifrcq amnrngketk snyrvrvyqi
[0028]121 ^gk^eivdsa seltagv^nk vgtcvsegsy ^agtlswhld gk^lv^nekg vsvkeqtrrh
[0029]181 ^etglftlqs elmvt^argg d^r^tfscsf s^gl^rhraI rta^iq^rvw e^v^leevql
[0030]241 vve^eggava ^ggtvtltce v^aq^s^qih wmkdgv^l^l ppspvlilpe ig^qdqgtys
[0031]301 cvathsshg^ qesravsisi ie^geeg^ta gsvggsglgt lalalgilgg Igtaalligv
[0032]361 ilwqrrqrrg eerka^enqe eeeeraelnq see^eagess tgg￡
[0033]一般而言，PRP的二级结构主要为多脯胺酸II螺旋(polyproline II helix)。不同于α螺旋，为伸展型的左手螺旋(left hand helix)，其能与其他分子的接触面积较多。另外，脯胺酸的α-ΝΗ2与自身的δ-C形成共价键，无法如α螺旋形成分子内氢键，而且其所游离出来的-C = O能够与其它分子形成分子间的氢键。因此，PRP较容易与其他蛋白质进行非特异性的结合。再者，脯胺酸本身为疏水性氨基酸，故PRP如再多含几个疏水性氨基酸，则容易与其他分子的疏水性区域以疏水性交互作用结合。
[0034]依据前述可知，Αβ分子主要靠疏水性聚集，而RAGE分子含有PRP区域。因此，本发明的特点之一在于寻找一种特定PRP，此特定PRP能与Αβ结合，以降低周边血液游离Αβ藉由RAGE进入脑部。此外，此PRP亦能与RAGE结合，以阻挠RAGE与Αβ结合。能与Αβ或RAGE其中之一结合的PRP都在本发明范围中。此特定的PRP具有至少以下的优点之一:减少周边血液的A β运入脑中；及减少Αβ与RAGE结合导致血脑屏障失能。
[0035]以下依据一较佳实施例并参考图1，说明本发明的富脯胺酸胜肽产品的制造步骤。
[0036]步骤A:选定欲合成PRP的氨基酸序列
[0037]查询常食乳品所含的各种乳蛋白的各种氨基酸序列，从其中选定一条或多条序列作为欲合成PRP的氨基酸序列。从各种乳蛋白的氨基酸序列可发现，β -酪蛋白、Ct -酪蛋白、K-酪蛋白等都含有若干片段具有较多脯胺酸(proline)与疏水性氨基酸，其中尤以β酪蛋白含量最多。因此，本发明的