专利名称：胃抑胜肽受体活化的胰高血糖素化合物的制作方法
技术领域：
本发明提供了一种胰高血糖素胜肽类似物，其对于胃抑胜肽受体(GIP)显现促效剂(agonist)活性。同时于本文中提出了使用该类似物的方法。
背景技术：
胰高血糖素前原(pre-proglucagon)是一种具有158个氨基酸的前体多肽，其在不同组织中经处理而形成的许多不同的胰高血糖素原(proglucagon)的衍生肽，包括胰高血糖素(glucagon)、胰高血糖素样肽-I(GLP-I)、胰高血糖素样肽-2 (GLP-幻及调酸素 (0XM;OXyntOmOdUlin)，其参与多样生理功能，包括葡萄糖体内平衡、胰岛素分泌、胃排空、 及肠道生长、以及食物摄取量调节。胰高血糖素(Glucagon)是对应于胰高血糖素前原由 33至61位氨基酸组成的含四个氨基酸的胜肽，而胰高血糖素样肽-1 (GLP-I)是经产生为对应于胰高血糖素前原由72至108位氨基酸组成的含37个氨基酸的胜肽。胰高血糖素样肽-1(7-36)酰胺或胰高血糖素样肽-1(7-37)酸是胰高血糖素样肽_1的生物有效形式，其主要对胰高血糖素样肽-1受体展现相等的活性。当血糖值降得太低时而不能提供足够能量供身体活动时，会发生低血糖症。在成人或超过10岁大的孩童中，低血糖症除了作为糖尿病治疗的副作用出现外，并不常见，但其会由其他的药物治疗或疾病、激素或酵素缺乏、或肿瘤所引起。当血糖开始下降时，胰高血糖素(一种由胰脏所产生的激素)会对肝脏发出分解肝糖(glycogen)及释放葡萄糖的信号，导致血糖值朝向正常值上升。因此，胰高血糖素在葡萄糖调节中所扮演之一般角色是为抗衡胰岛素的作用及维持血糖值。然而，对于糖尿病患，此胰高血糖素对低血糖症的反应可能受损，而使得葡萄糖值更难回到正常范围。低血糖症是一种需要立即医疗而威胁生命的事件。施予胰高血糖素是为一种已确定的用于治疗急性低血糖症的药物疗法，且其是可在给药的数分钟内恢复正常葡萄糖值。当将胰高血糖素用于低血糖症的急性医疗时，将结晶形态的胰高血糖素用稀酸缓冲液溶解，且以肌内注射该溶液。虽然此治疗有效，但此方法对于意识不清的人士而言麻烦且危险。因此，需要有一种胰高血糖素类似物，其可维持或超越母分子的生物效能但在相关的生理条件下可充分溶解且稳定，且可预先调配为溶液，并且能够立即注射。此外，糖尿病患者被鼓励要维持接近正常的血糖值，以延缓或预防微血管并发症。 此目标的达成通常需要密集的胰岛素治疗。在努力达成此目标时，医师已遭遇的糖尿病患中的低血糖症频率及严重度大量增加。因此，需要比目前的胰岛素疗法更不易诱导低血糖症的用于治疗糖尿病的改良药物及方法。胰高血糖素样肽-1具有与胰高血糖素不同的生物活性。其作用包括刺激胰岛素合成及分泌、抑制胰高血糖素分泌，以及抑制食物摄取量。胰高血糖素样肽-1已证实可降低糖尿病患中的高血糖症(升高的葡萄糖值)。促胰岛素分泌素-4(exendin-4)，是一种来自蜥蜴毒液(lizard venom)的与GLP-I共有约50%氨基酸相似度的胜肽，其是可活化 GLP-I受体且同样已证实可降低糖尿病患中的高血糖症。
也证实胰高血糖素样肽-1及促胰岛素分泌素-4可降低食物摄取量及促进减重， 其是一种不仅对糖尿病患，且亦对罹患肥胖症的病患有益的效果。肥胖症的病患有较高的糖尿病、高血压、高脂血症、心血管疾病、及肌肉骨骼疾病的患病风险。因此，有需要用于治疗糖尿病及肥胖症的替代且较佳的经改良的方法。
发明内容
如本文所述，本发明是提供一种胰高血糖素胜肽类似物，其对于胃抑胜肽受体 (GIP)显现促效剂(agonist)活性。同时于本文提出使用所述类似物的方法。天然胰高血糖素(SEQ ID NO 1)不会活化胃抑胜肽受体，且天然胰高血糖原本于胃抑胜肽受体显现0% (例如小于0. 001%,0. 0001%)的天然胃抑胜肽活性。天然胰高血糖素对于胰高血糖素样肽-1受体，具有约天然胰高血糖素样肽-1活性。如本文所述对该天然胰高血糖素序列(SEQ ID NO 1)的修饰产生胰高血糖素胜肽类似物，其是可显现与天然胰高血糖素(SEQ ID NO 1)活性相等或更佳的有效胰高血糖素活性，与天然胃抑胜肽 (SEQ ID NO :67 活性相等或更佳的有效胃抑胜肽活性，及/或与天然胰高血糖素样肽-1、 胰高血糖素样肽-1 (7-36)酰胺(SEQ ID NO 52)或胰高血糖素样肽_1 (7_37)酸(SEQ ID NO 50)的活性 < 是胰高血糖素样肽-1的生物有效形式，证实基本上对胰高血糖素样肽-1 受体相等的活性 > 相等或更佳的有效胰高血糖素样肽-1活性。如本文所述的数据证实具有胃抑胜肽活性及胰高血糖素样肽-1活性的胰高血糖素类似物对于导致体重降低或预防体重增加，以及治疗高血糖症，包括糖尿病，特别有效。鉴于先前技术的启示，即拮抗胃抑胜肽为降低日常食物摄取量及体重，并增加胰岛素敏感性及能量消耗，该活性并未特别地被预期。(Irwin et al.，Diabetologia 50 :1532-1540(2007) ；and Althage et al.，J Biol Chem, e-publication on April 17,2008).。因此，在某些实施例中，该胰高血糖素类似物为IOOnM或更少，或约75、50、25、 10、8、6、5、4、3、2或InM或更少时，显现对胃抑胜肽受体活化活性的EC50值。在某些实施例中，本文所述的类似物为约0. OOlnM.O. OlnM或0. InM的胃抑胜肽受体显现一 EC50值。 在某些实施例中，本文所述的类似物为不超过InM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、8nM、10nM、15nM、 20nM、25nM、30nM、40nM、50nM、75nM、或IOOnM的胃抑胜肽受体显现一 EC50值。在某些实施例中，该类似物为IOOnM或更少，75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或InM或更少时，显现对胰高血糖素受体活化的EC50值。在某些实施例中，本文所述的类似物为约0. OOlnM.O. OlnM或 0. InM的胰高血糖素受体显现一 EC50值。在某些实施例中，该于胰高血糖素受体的EC50值不超过 InM、2ηΜ、3ηΜ、4ηΜ、5ηΜ、6ηΜ、8ηΜ、IOnMU5ηΜ、20ηΜ、25ηΜ、30ηΜ、40ηΜ、50ηΜ、75ηΜ、或 ΙΟΟηΜ。在某些实施例中，该类似物显现约IOOnM或更少，或约75、50、25、10、8、6、5、4、3、2 或InM或更少的对胰高血糖素样肽-1受体活化的EC50值。在某些实施例中，本文所述的类似物为约0. OOlnM.O. OlnM或0. InM的胰高血糖素样肽-1受体显现一 EC50。在某些实施例中，该于胰高血糖素样肽-1的EC50值不超过1ηΜ、2ηΜ、3ηΜ、4ηΜ、5ηΜ、6ηΜ、8ηΜ、10ηΜ、15ηΜ、 2011] 、2511]\1、3011]\1、4011]\1、5011]\1、7511]\1、或10011]\1。受体活化是通过体外(in vitro)测定法而测得，其是在HEK293细胞中过度表达该受体以测试cAMP的诱导，例如测定的HEK293细胞与DNA编号的受体共同转染，且具连接至如实施例14所述的cAMP应答元件(responsive element)的一焚光素酶基因(luciferase gene)。
在某些实施例中，该类似物于胃抑胜肽受体相对于天然胃抑胜肽(胃抑胜肽效能)显现至少约 0. 005 %,0. 0075 %,0. 01 %,0. 025 %,0. 05 %,0. 075 %,0. 1 %,0. 2%, 0. 3%,0. 4%,0. 5%,0. 6%,0. 7%,0. 8%,0. 9%,1 %>5%,10%,20%,30%,40%,50%, 60 %、75 %、100 %、125 %、150 %、175 %或200 %或更高的活性。在某些实施例中，本文所述的类似物于胃抑胜肽受体相对于天然胃抑胜肽显现不超过约100 %、1000 %、10，000 %、 100，000%，或1，000，000%的活性。在某些实施例中，该类似物于胰高血糖素受体相对于天然胰高血糖素(胰高血糖素效能)显现至少约1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、 60%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500% 或更高的活性。在某些实施例中，本文所述的类似物于胰高血糖素受体相对于天然胰高血糖素显现不超过约100%、1000%、10，000%、100，000%，或1，000，000%的活性。在某些实施例中，该类似物于胰高血糖素样肽-1受体相对于天然胰高血糖素样肽-1 (胰高血糖素样肽-1 效能)显现至少约 0. 1%,0. 2%,0. 3%,0. 4%,0. 5%,0. 6%,0. 7%,0. 8%,0. 9%, 1%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,75% ,100%, 125 %、150 %、175 %或200 %或更高的活性。在某些实施例中，本文所述的类似物于胰高血糖素样肽-1受体相对于天然胰高血糖素样肽-1显现不超过约100%、1000%、10，000%、 100，000%，或 1,000，000% 的活性。在特定实施例中，如本文所述的类似物及胰高血糖素胜肽，当缺少亲水性基团时， 例如聚乙二醇(PEG)，显现标示％的活性，然而，当包含亲水性基团时，例如聚乙二醇 (PEG)，显现一降低％的活性(例如约10倍降低的活性)。因此，在某些实施例中，该类似物在缺少亲水性基团时显现前述％活性程度，并在包含亲水性基团时，显现一约10倍降低的活性。一类似物于一受体相对于该受体之一天然配体的活性，其是以该类似物对天然配体两者的EC50取倒数计算。因此，本发明一方面提供可于胰高血糖素受体及胃抑胜肽受体显现活性的类似物 (胰高血糖素/胃抑胜肽共同促效剂(co-agonist))。此类类似物缺少天然胰高血糖素的选择性(其是胰高血糖素受体相对于胃抑胜肽受体的选择性)。在某些实施例中，该类似物于胃抑胜肽受体的EC50，与其于胰高血糖素受体的EC50不同，是少于约50倍、40倍、30 倍或20倍(较高或较低)。在某些实施例中，该类似物的胃抑胜肽效能，与其于胰高血糖素效能不同，是少于约500倍、450倍、400倍、350倍、300倍、250倍、200倍、150倍、100倍、 75倍、50倍、25倍、20倍、15倍、10倍或5倍(较高或较低)。在某些实施例中，该类似物于胃抑胜肽受体的EC50除以该类似物于胰高血糖素受体的EC50的比值，约少于100、75、 60、50、40、30、20、15、10或5。在某些实施例中，于胃抑胜肽受体的EC50除以胰高血糖素受体的 EC50 的比值，约为 1 或少于 1(例如约 0. 01、0. 013、0. 0167、0. 02,0. 025,0. 03,0. 05、 0. 067,0. 1,0. 2)。在某些实施例中，该类似物胃抑胜肽效能相较于该类似物胰高血糖素效能的比值，约少于 500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、60、50、40、30、20、15、10 或 5。在某些实施例中，于胃抑胜肽受体的效能除以于胰高血糖素受体的效能的比值，约为1 或少于 1 (例如约 0. 01,0. 013,0. 0167,0. 02,0. 025,0. 03,0. 05,0. 067,0. 1,0. 2)。在某些实施例中，胰高血糖素样肽-1活性是可显著地降低或破坏，例如通过第7号位置的氨基酸修饰，如取代异亮氨酸(Ile)，羧基端至第27号或第观号位置的删除，产生27-或28-氨基酸胜肽，或其组合。
本发明的另一方面提供于胰高血糖素、胃抑胜肽及胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1 rec印tor)(胰高血糖素/胃抑胜肽/胰高血糖素样肽-1三重促效剂 (tri-agonist)显现活性的类似物。此类类似物会损失天然胰高血糖素的选择性(其是胰高血糖素受体相对于胰高血糖素样肽-1及胃抑胜肽受体的选择性)。在某些实施例中，该类似物于胃抑胜肽受体的EC50，分别与其于胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1受体的EC50 不同，是约少于5000倍、2500倍、1000倍、750倍、500倍、250倍、100倍、50倍、40倍、30倍或20倍(较高或较低)。在某些实施例中，该类似物的胃抑胜肽效能，与其于胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1效能不同，是少于约1000倍、750倍、500倍、450倍、400倍、350倍、300 倍、250倍、200倍、150倍、100倍、75倍、50倍、25倍、20倍、15倍、10倍或5倍(较高或较低)。在某些实施例中，三重促效剂于胃抑胜肽受体的EC50除以三重促效剂于胰高血糖素样肽-1 受体的 EC50 的比值，约少于 10，000、7500、5000、2500、1000、750、500、250、100、75、 60、50、40、30、20、15、10、5或1。在某些实施例中，于胰高血糖素样肽_1受体的EC50除以于胃抑胜肽受体的EC50的比值，约为5、4、3、2或1，或少于1 (例如少于约0. 00001,0. 0001、 0.001,0.0025,0.005,0.0075,0.01,0.013,0.0167,0.02,0.025,0.03,0.05,0. 067,0. 1、 0. 2)。在某些实施例中，于胰高血糖素样肽-1受体的EC50大于约0. 1(例如大于约0. 25、 0. 75、1)。在某些实施例中，三重促效剂于胃抑胜肽受体的效能除以三重促效剂于胰高血糖素样肽-1 受体的效能的比值，约 1000、750、500、250、100、75、60、50、40、30、20、15、10、5 或1。在某些实施例中，于胃抑胜肽受体的效能除以于胰高血糖素样肽-1受体的效能的比值，约为 5、4、3、2 或 1，或少于 1(例如少于约 0. 0001,0. 001,0. 01,0. 013,0. 0167,0. 02、 0. 025,0. 03,0. 05,0. 067,0. 1,0. 2)。在相关实施例中，三重促效剂于胃抑胜肽受体的EC50 除以三重促效剂于胰高血糖素受体的EC50的比值，约少于100、75、60、50、40、30、20、15、10 或5。在某些实施例中，于胃抑胜肽受体的EC50除以胰高血糖素受体的EC50的比值，约为 1 或少于 1 (例如约 0. 01,0. 013,0. 0167,0. 02,0. 025,0. 03,0. 05,0. 067,0. 1,0. 2)。在某些实施例中，该三重促效剂的胃抑胜肽效能相较于该三重促效剂的胰高血糖素效能的比值，约少于 500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、60、50、40、30、20、15、10 或 5。在某些实施例中，于胃抑胜肽受体的效能除以于胰高血糖素受体的效能的比值，约为1或少于 1 (例如约 0. 01,0. 013,0. 0167,0. 02,0. 025,0. 03,0. 05,0. 067,0. 1,0. 2)。在某些实施例中，三重促效剂于胰高血糖素样肽-1的EC50除以三重促效剂于胰高血糖素受体的EC50 的比值，约少于100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在某些实施例中，于胰高血糖素样肽-1的EC50除以胰高血糖素受体的EC50的比值，约为1或少于1 (例如约0. 01,0. 013、 0. 0167,0. 02,0. 025,0. 03,0. 05,0. 067,0. 1,0. 2)。在某些实施例中，三重促效剂的胰高血糖素样肽-1效能除以三重促效剂的胰高血糖素效能的比值，约少于100、75、60、50、40、30、 20、15、10或5。在某些实施例中，于胰高血糖素样肽-1受体的效能除以于胰高血糖素受体的效能的比值，约为1或少于1(例如约0. 01、0. 013、0. 0167、0. 02,0. 025,0. 03,0. 05、 0. 067,0. 1,0. 2)。本发明的又另一方面提供于胰高血糖素样肽-1受体及胃抑胜肽受体显现活性， 但其中胰高血糖素活性是显著地降低或破坏(胃抑胜肽/胰高血糖素样肽-1共同促效剂) 的类似物，例如第3号位置氨基酸修饰。举例来说此位置取代为酸性、碱性或疏水性氨基酸(谷氨酸、鸟氨酸、亮氨酸)而降低胰高血糖素的活性。在某些实施例中，该类似物于胃抑胜肽受体的EC50，与其于胰高血糖素样肽-1受体的EC50不同，是约少于1000倍、750 倍、500倍、250倍、100倍、50倍、40倍、30倍或20倍(较高或较低)。在某些实施例中，该类似物的胃抑胜肽效能，与其胰高血糖素样肽-1效能不同，是少于约1000倍、750倍、500 倍、250倍、100倍、25倍、20倍、15倍、10倍或5倍(较高或较低)。在某些实施例中，此类类似物于胰高血糖素受体具有约10%或更少的天然胰高血糖素活性，例如约1至10%，或约0. 1至10%，或大于约0. 但小于约10%。在某些实施例中，该类似物于胃抑胜肽受体的EC50除以该类似物于胰高血糖素样肽-1受体的EC50的比值，约少于100、75、60、50、40、 30、20、15、10或5，且不少于1。在某些实施例中，该类似物的胃抑胜肽效能相较于该类似物的胰高血糖素样肽-1的比值，约少于100、75、60、50、40、30、20、15、10或5，且不少于1。 在某些实施例中，于胰高血糖素样肽-1受体的EC50除以于胃抑胜肽受体的EC50的比值， 约为 5、4、3、2 或 1，或少于 1 (例如少于约 0. 00001,0. 0001,0. 001,0. 0025,0. 005,0. 0075、 0. 01,0. 013,0. 0167,0. 02,0. 025,0. 03,0. 05,0. 067,0. 1,0. 2)。在某些实施例中，共同促效剂的胃抑胜肽效能除以共同促效剂的胰高血糖素样肽-1效能，约1000、750、500、250、100、 75、60、50、40、30、20、15、10、5或1。在某些实施例中，于胃抑胜肽受体的效能除以于胰高血糖素样肽-1受体的效能的比值，约为5、4、3、2或1，或少于1(例如少于约0. 0001、0. 001、 0. 01,0. 013,0. 0167,0. 02,0. 025,0. 03,0. 05,0. 067,0. 1,0. 2)。本发明的另一方面提供于胃抑胜肽受体显现活性，其胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1活性显著地降低或破坏(「胃抑胜肽促效剂胰高血糖素胜肽」)的类似物，例如第3及 7号位置的氨基酸取代。在某些实施例中，此类类似物于胰高血糖素受体具有约10%或更少的天然胰高血糖素活性，例如约1至10%，或约0. 1至10%，或大于约0. 1^^0.5%或 1 %，但小于约1 %、5 %或10 %。在某些实施例中，此类类似物于胰高血糖素样肽-1受体具有约10%或更少的天然胰高血糖素样肽-1活性，例如约1至10%，或约0. 1至10%，或大于约0. 1%,0. 5%或1%，但小于约1%、5%或10%。在本发明的某些方面，于胃抑胜肽受体显现促效剂活性的类似物包含有SEQ ID NO :1，是具有至少一个氨基酸修饰以及一种延伸，其是由1至21个氨基酸(例如5至18、 7至15、9至12个氨基酸)的羧基端至类似物第四号位置的氨基酸。在特定实施例中，该类似物包含至少一个氨基酸修饰并高达15个(例如不超过 15个，不超过10个氨基酸修饰)。举例来说，该类似物包含有SEQ ID N0:1，具1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸修饰。在特定实施例中，该类似物包含至少一个氨基酸修饰，高达10个氨基酸修饰以及额外的保留性氨基酸修饰。于又一方面，该至少一个的氨基酸修饰是赋予稳定类似物羧基端部分中一稳定化的α螺旋结构。达成稳定化的α 螺旋结构的修饰是如本文所述。请参见，例如，在「α螺旋结构的稳定/分子内架桥」章节中的教学。包含有一酰基化或烷基化羧基端延伸或一包括1至6个带正电氨基酸羧基端延伸的类似物，意外地于胃抑胜肽受体显现增加的促效剂活性。因此，在特定实施例中，该延伸的氨基酸至少一个，是位于第37至43号位置中任何位置(根据SEQ ID NO 1的编号)包含有酰基或烷基，其中该酰基或烷基对自然发生的氨基酸来说是非自然的，即该延伸酰基化或烷基化。在某些实施例中，该酰基或烷基是直接连接至氨基酸，例如通过氨基酸侧链。 在其他实施例中，该酰基或烷基是可通过间隔物(例如单一氨基酸、双肽、三肽、亲水性双功能间隔物、疏水性双功能间隔物)连接至酰基或烷基。适合包含酰基或烷基的氨基酸，也适合如本文所述的酰基及烷基。请参见，例如标题为「酰基化及烷基化」章节中的教学。在其他实施例中，延伸的1至6个氨基酸(例如1至2个、1至3个、1至4个、1 至5个氨基酸)为带正电氨基酸，例如化学式IV的氨基酸，如赖氨酸。如本文所使用的术语「带正电氨基酸(positive-charged amino acid)」是指包含在生理pH下(例如pH 6. 8至8.0，pH 7.0至7. 7)的任何自然生成或非自然生成，在其侧链原子上带正电的氨基酸。在特定方面，该带正电氨基酸是位于第37、38、39、40、41、42及43号位置中任何位置。 在特定实施例中，该带正电氨基酸是位于第40号位置。在其他实施例中，该延伸中是如本文所述经酰基化或烷基化，并包含如本文所述的1至6个带正电氨基酸。在又一实施例中，该胃抑胜肽受体显现促效剂活性的类似物包含(i)SEQ ID NO 1，其是具有至少一个氨基酸修饰，(ii) 一种延伸，为1至21个氨基酸(例如5至18、7至 15、9至12个氨基酸)，其是羧基端至类似物第四号位置的氨基酸，以及(iii)包含酰基或烷基的氨基酸，该酰基或烷基是指对自然生成的氨基酸来说是非自然的氨基酸，该氨基酸是位于羧基端延伸外(例如第1至四号位置中任何位置)。在某些实施例中，该类似物包含于第10号位置经酰基化或烷基化的氨基酸。在特定方面，该酰基或烷基是为C4至C30 脂肪酰基或C4至C30烷基。在某些实施例中，该酰基或烷基是可通过间隔物(例如一氨基酸、双肽、三肽、亲水性双功能间隔物、疏水性双功能间隔物)连接至酰基或烷基。在特定方面，该类似物包含稳定α螺旋的氨基酸修饰，(例如其是介于第16号位置的谷氨酸及第20号位置的赖氨酸间的盐桥，或位于第16、20、21、及M号位置中任意一、二、三或多个位置的α，α双取代氨基酸)。在特定方面，该类似物额外地包含有氨基酸修饰，其是赋予对第四型双胜肽蛋白水解酶切割的抗性。包含另外氨基酸修饰的类似物需于此处考虑。在特定实施例中，该具胃抑胜肽受体活性的类似物于胃抑胜肽受体显现至少约 0. 1% (例如至少0. 5%、1%、2%、5%、10%、15%或20%)的天然胃抑胜肽活性。在某些实施例中，该类似物于胃抑胜肽受体显现超过20% (例如超过50%、75%、100%、200%、 300%,500%)的天然胃抑胜肽活性。在某些实施例中，该胃抑胜肽受体于胰高血糖素样肽-1受体及胰高血糖素受体中之一或前述两者显现可观的促效剂活性。在某些方面，对此类受体(其是指胃抑胜肽受体及胰高血糖素样肽-1受体及/或胰高血糖素受体)的选择性为100倍以内。举例来说，该具有胃抑胜肽受体活性的类似物，其对胰高血糖素样肽-1 受体的选择性是少于100倍(于50倍内、于25倍内、于15倍内、于10倍内)，该选择性是于胃抑胜肽受体及/或胰高血糖素受体。如本文所述，提供高效能的胰高血糖素促效剂类似物，其对于胰高血糖素受体也显现增加的活性，在另外实施例中，显现增强的生物物理稳定度及/或水溶液溶解度。此夕卜，依据本发明的另一方面，提供缺少天然胰高血糖素的选择性(其是胰高血糖素受体相对于胰高血糖素样肽-1受体的选择性)的类似物，且因此代表此两类受体的共同促效剂。 胰高血糖素类似物内的经选择氨基酸修饰是可控制该类似物的相对活性，其是于胰高血糖素样肽-1受体对胰高血糖素受体的相对活性。因此，本发明的又另一方面提供胰高血糖素共同促效剂类似物，其是于胰高血糖素受体对胰高血糖素样肽-1受体具较高活性，胰高血糖素共同促效剂类似物是于此两受体均约有相等活性，且胰高血糖素共同促效剂类似物
12于胰高血糖素样肽-1受体对胰高血糖素受体具较高活性。共同促效剂的后续分类是可设计于胰高血糖素受体显现少量或无活性，而仍保留其活化胰高血糖素样肽-1受体的能力， 其是与天然胰高血糖素样肽-1有相同或更强的效能。此类共同促效剂的任一种亦包含有修饰，其是赋予增强的生物物理稳定度及/或水溶液溶解度。对胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1受体展现共同促效作用的胰高血糖素类似物有利于数个应用。首先，使用胰高血糖素于治疗低血糖症会过度补偿低血糖值，而导致过高的血糖值。若施予胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1受体共同促效剂，则额外的胰高血糖素样肽-1刺激可缓冲胰高血糖素促效剂的效果，而防止由治疗低血糖症所导致的过高的葡萄糖血值。此外，如本文所述，当单独使用，或与其他抗糖尿病或抗肥胖药剂合并用药时，本发明的胰高血糖素共同促效剂类似物可用于控制高血糖症，或导致体重降低或防止体重增力口。另一种导致体重降低的化合物为调酸素，其是一种存在于小肠中的天然产生的消化激素(参见Diabetes 2005 ；54 =2390-2395)。调酸素为包含胰高血糖素的四个氨基酸序列 (即SEQ ID NO 1)其后接SEQ ID NO :27的8个氨基酸羧基端延伸(KRNRNNIA)之一 37个氨基酸胜肽。虽然本发明考虑将文中所述的胰高血糖素类似物可可选择的结合至此8个氨基酸羧基端延伸(SEQ ID NO :27)，但本发明的某些实施例中亦特别地考虑缺乏SEQ ID NO 27的8个相连羧基氨基酸的类似物及该类似物的使用。化合物可经由氨基酸修饰而客置化以调节胜肽的胰高血糖素样肽-1活性，且因此可调整本发明的胰高血糖素类似物以治疗特定症状或疾病。更具体地说，本文提供胰高血糖素类似物，其中每一类似物对各别的胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1受体展现特有的活性相对值。举例来说，可对每一胜肽进行修饰，以产生胰高血糖素胜肽，该胰高血糖素胜肽具有对GLP-I受体相对于天然GLP-I为至少约(包括至少约1.5^^2^^5 ^ 7 % UO %,20 %,30 %,40 %,50 %,60 %,75 % UOO % ,125 % ,150 % ,175 % )至约 200 % 间的任何值或更高活性，以及对胰高血糖素受体相对于天然胰高血糖素为至少约(包括至少约 1. 5%,10 %,20 %,30 %,40 %,50 %,60 %,75 %,100 %,125 150 % ,175 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %,400 %,450 % )至约 500 % 间的任何值或更高活性。在某些实施例中，本文所述的胰高血糖素胜肽，于胰高血糖素受体显现高达约100%、 1000 %、10，000 %、100，000 %或1，000, 000 %的天然胰高血糖素活性。某些实施例中，本文所述的胰高血糖素胜肽，于胰高血糖素样肽-1受体显现高达约100%、1000%、10，000%、 100，000%，或1，000，000%的天然胰高血糖素样肽-1活性。该天然胰高血糖素的氨基酸序列为SEQ ID NO :1，该胰高血糖素样肽-1(7-36)酰胺的氨基酸序列为SEQ ID N0:52，该胰高血糖素样肽-1(7-37)的氨基酸序列为SEQ ID NO :50。在例示实施例中，一胰高血糖素胜肽是可于胰高血糖素受体显现至少10%的天然胰高血糖素活性，并于胰高血糖素样肽-1受体显现至少50%的天然胰高血糖素样肽-1活性，或于胰高血糖素受体显现至少 40 %的天然胰高血糖素活性，且于胰高血糖素样肽-1受体显现至少40 %的天然胰高血糖素样肽-1活性，或于胰高血糖素受体显现至少60%的天然胰高血糖素活性，并于胰高血糖素样肽-1受体显现至少60%的天然胰高血糖素样肽-1活性。胰高血糖素胜肽的选择性(其是胰高血糖素受体相对于胰高血糖素样肽-1受体的选择性)，是以胰高血糖素/胰高血糖素样肽-ι活性的相对比率描述(其是于胰高血糖素受体对于天然胰高血糖素的胜肽活性，除以于胰高血糖素样肽-ι受体对于天然胰高血糖素样肽-1的胜肽活性)。举例来说，胰高血糖素胜肽有1 1的胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1活性比率，其是于胰高血糖素受体显现60 %的天然胰高血糖素活性，且于胰高血糖素样肽-1受体显现60 %的天然胰高血糖素样肽-1活性。胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1 活性的例示比率包含约 1 1、1.5 1、2 1、3 1、4 1、5 1、6 1、7 1、8 1、 9 1 或 10 1，或约 1 10、1 9、1 8、1 7、1 6、1 5、1 4、1 3、1 2 或 1 1.5。如一实施例，10 1的胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1活性比率是指10倍的选择性(其是胰高血糖素受体相对于胰高血糖素样肽-1受体的选择性)。同样地，10 1的胰高血糖素样肽-1/胰高血糖素的活性比率是指10倍的选择性(其是胰高血糖素样肽-1 受体相对于胰高血糖素受体的选择性)。根据一实施例，提供具有增强的效能，及可选择的溶解度及稳定度经改良的胰高血糖素类似物。在一实施例中，增强的胰高血糖素效能，是通过位于天然胰高血糖素(SEQ ID NO 1)中第16号位置的氨基酸修饰而提供。经由非限定实施例的方法，此等增强的效能是通过第16号位置的自然发生的丝氨酸取代为谷氨酸，或另一具有4个原子长度侧链的带负电氨基酸，或替代为谷氨酰胺、高谷氨酸(homoglutamic acid)或同胱氨酸(homocysteic acid)、或带电荷氨基酸，其是具有包含至少一异质原子(例如N，0，S，P)的侧链以及4个 (或3至幻原子长度侧链。在一实施例中，增强效能的胰高血糖素促效剂包含SEQ ID NO 2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 之一胜月太或一 SEQ ID NO :5的胰高血糖素促效剂类似物。依据一实施例，是提供一种胰高血糖素类似物蛋白质，其是对胰高血糖素受体相对于野生型胰高血糖素具有增强的效能，其中该胜肽包含 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 或 SEQ ID NO 10 的序列，其中该胰高血糖素肽维持其于胰高血糖素受体相对于胰高血糖素样肽-1受体的选择性。胰高血糖素受体活性，是可通过于第3号位置的氨基酸修饰而减少、维持或增强， 例如取代第3号位置自然发生的谷氨酰胺。在一实施例中，第3号位置的氨基酸取代为酸性、碱性、或疏水性氨基酸(谷氨酸、鸟氨酸、亮氨酸)，其是证实可大量地降低或破坏胰高血糖素受体活性。取代该类似物例如谷氨酸、鸟氨酸或亮氨酸，于胰高血糖素受体具有约 10%或更少的天然胰高血糖素活性，例如约1-10%，或约0. 1-10%，或大于约0. 但小于约10%，而于胰高血糖素样肽-1受体显现约至少20%的胰高血糖素样肽-1活性。举例来说，如本文所述的例示类似物，具有约0.5%、或约7%的天然胰高血糖素活性，而于胰高血糖素样肽-1受体显现约至少20%的胰高血糖素样肽-1活性。在另一实施例中，该胰高血糖素胜肽第3号位置自然发生的谷氨酰胺，是可取代为不会于胰高血糖素受体大量降低活性的谷氨酰胺类似物，且在某些情况下，增强如本文所述胰高血糖素受体的活性。举例来说，该在第3号位置包含有一谷氨酰胺类似物之一胰高血糖素胜肽，是可于胰高血糖素受体显现约5 %、10 %、20 %、50 %或约85 %，或更高的天然胰高血糖素(例如SEQ ID N0:1)活性。举例来说，该在第3号位置包含有谷氨酰胺类似物之一胰高血糖素胜肽，是可于胰高血糖素受体显现约5^^10^^20^^50%或约85%， 或更高的天然胰高血糖素(例如SEQ ID NO :1)活性，其是一对应的胰高血糖素胜肽的活性，具有除了在第3号位置经修饰氨基酸外(例如SEQ ID NO 601或SEQ ID NO :602)，与包含有谷氨酰胺类似物的胜肽相同的氨基酸序列。在某些实施例中，该在第3号位置包含有谷氨酰胺类似物之一胰高血糖素胜肽，是可于胰高血糖素受体显现增强的活性，但增强的活性不超过1000 %、10，000 %、100, 000 %、或1，000, 000 %的天然胰高血糖素活性或一
对应的胰高血糖素胜肽的活性，其是具有除了在第3号位置经修饰氨基酸外，与包含有谷氨酰胺类似物的胜肽相同的氨基酸序列。在某些实施例中，该谷氨酰胺类似物是为自然生成或非自然生成的氨基酸，其是包含有结构I、II，或III的侧链
权利要求
1.一种胰高血糖素胜肽的类似物，该类似物包含(i)具有至少一个至最多10个氨基酸改变的SEQ ID NO :1，其中该至少一个的氨基酸的改变使得类似物的C-末端部分被赋予了一个稳定化的α螺旋结构；( )羧基端至第四号位置的氨基酸的1至21个氨基酸的延伸；以及(iii)下列的至少一种(a)位于第37至43号位置(根据SEQID NO=I的编号)中任何位置的该延伸的氨基酸中至少一个包含有对自然发生的氨基酸来说是非自然的一酰基或一烷基；(b)该延伸的1至6个氨基酸为带正电氨基酸；(c)在所述的同系物的第10号位置上为包含酰基或烷基的氨基酸，其中该酰基或烷基对自然发生的氨基酸来说是非自然的，或(d)(a)、(b)及(c)的组合；其中当该类似物缺少一亲水性基团时，该类似物于胃抑胜肽(GIP)受体显现至少约 0. 的天然胃抑胜肽(GIP)的活性；
2.如权利要求1所述的类似物，其中⑴该类似物包含一分子内架桥，是介于第i及 i+4号位置的氨基酸的侧链之间或第j及j+3号位置的氨基酸侧链之间，其中i为12、13、 16、17、20或24，且j为17，(ii)该类似物的第16、20、21、及M号位置中一、二、三或多个位置被取代为α，α-双取代氨基酸，或(iii) (i)及(ii)两者。
3.如权利要求1或2所述的类似物，包含第16号位置的谷氨酸及第20号位置的赖氨酸，其中可选择的有一内酰胺架桥连接至该谷氨酸及该赖氨酸。
4.如权利要求3所述的类似物，是进一步包含一或多个的第17号位置的谷氨酰胺、 第18号位置的丙氨酸、第21号位置的谷氨酸、第23号位置的异亮氨酸、第M号位置的丙氨酸或半胱氨酸，或其一或多个保守性取代。
5.如权利要求1至4任一项所述的类似物，包含一羧基端酰胺。
6.如权利要求1至5中任一项所述的类似物，是包含于第1号位置、第2号位置或第1号及2号位置处的氨基酸取代，其中该氨基酸取代获得了第四型双胜肽蛋白水解酶 (DPP-IV protease)的抗性。
7.如权利要求6所述的类似物，其中在第1号位置的组氨酸被一氨基酸所取代，所述的氨基酸是选自于包含D-组氨酸、α，α-双甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸(imidazole acetic acid)、脱胺基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸及高组氨酸所组成的群。
8.如权利要求6或7所述的类似物，其中在第2号位置的丝氨酸被一氨基酸所取代，所述的氨基酸是选自于包含D-丝氨酸、丙氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、 N-甲基丙氨酸以及胺基异丁酸(AIB)所组成的群。
9.如权利要求1至8中任一项所述的类似物，其中在第1号位置的氨基酸包含一咪唑环(imidazole ring)。
10.如权利要求9所述的类似物，其中在第1号位置的氨基酸为组氨酸。
11.如权利要求1至6中任一项所述的类似物，其中在第1号位置的氨基酸为非大的、 芳香族氨基酸。
12.如权利要求11所述的类似物，其中在第1号位置的氨基酸并非酪氨酸。
13.如权利要求1至12中任一项所述的类似物，包含在27J8或四号位置中一、二或所有处的氨基酸修饰。
14.如权利要求13所述的类似物，其中(a)第27号位置的甲硫氨酸被取代为大的脂肪族氨基酸，可选择的为亮氨酸，(b)第观号位置的天冬酰氨酸取代为小的脂肪族氨基酸，可选择的为丙氨酸，(c)第四号位置的苏氨酸取代为小的脂肪族氨基酸，可选择的为甘氨酸， 或(d) (a)、(b)及(c)中两种或所有的组合。
15.如权利要求14所述的类似物，包含第27号位置的亮氨酸、第观号位置的丙氨酸以及第四号位置的甘氨酸或苏氨酸。
16.如权利要求15所述的类似物，是包含一或多个下列修饰a.第2号位置的丝氨酸替换为为丙氨酸；b.第3号位置的谷氨酰胺替换为谷氨酸或谷氨酰胺类似物；c.第7号位置的苏氨酸替换为异亮氨酸；d.第10号位置的酪氨酸替换为色氨酸或包含对自然生成的氨基酸来说是非自然的一酰基或烷基的一氨基酸；e.第12号位置的赖氨酸替换为异亮氨酸；f.第15号位置的天冬氨酸替换为谷氨酸；g.第16号位置的丝氨酸替换为谷氨酸；h.第20号位置的谷氨酰胺替换为丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或胺基异丁酸； (i)第M号位置的谷氨酰胺替换为丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或胺基异丁酸； j.第27号位置的甲硫氨酸替换为亮氨酸或正亮氨酸(Nle)；k.第四号位置的天冬酰氨酸替换为一带电荷氨基酸，可选择的为天冬氨酸或谷氨酸；以及(1)第四号位置的苏氨酸替换为甘氨酸或一带电荷氨基酸，可选择的为天冬氨酸或谷氨酸。
17.如权利要求1至16中任一项所述的类似物，是包含(i)GPSSGAPPPS(SEQID NO :26) 或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO :674)的氨基酸序列，其中X为任何氨基酸，(ii)与SEQ ID NO 或SEQ ID NO :674氨基酸序列相比具有至少80%序列相似度的氨基酸序列，或(iii)具有一或多个保守性氨基酸替换的(i)或(ii)的该氨基酸序列，其中该氨基酸序列是类似物的羧基端至第四号位置。
18.如权利要求17所述的类似物，包含GPSSGAPPPS(SEQID NO 26)或 XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO :674)的氨基酸序列，其中X为任何氨基酸，C-末端至类似物第四号位置的氨基酸。
19.权利要求1至18中任一项所述的类似物，其中包含一酰基或烷基的该氨基酸是为化学式I、II或III所示的氨基酸。
20.如权利要求19所述的类似物，其中该包含一酰基或烷基的该氨基酸为赖氨酸。
21.如权利要求1至20中任一项所述的类似物，其中包含一酰基或烷基的该氨基酸是位于该类似物的第37、38、39、40、41、42及43号位置中任何位置。
22.如权利要求21所述的类似物，其中包含一酰基或烷基的该氨基酸是位于该类似物的第40号位置。
23.如权利要求1至22中任一项所述的类似物，其中该酰基为一C4至C30脂肪酰基。
24.如权利要求1至23中任一项所述的类似物，其中该酰基或烷基是通过一间隔物共价性连接至该氨基酸的该侧链。
25.如权利要求M所述的类似物，其中该间隔物是为3至10个原子长度。
26.如权利要求25所述的类似物，其中该间隔物为氨基酸或双肽。
27.如权利要求沈所述的类似物，其中该间隔物为六-胺基己酸(6-aminohexanoic acid) 0
28.如权利要求沈所述的类似物，其中该间隔物为一双肽，选自于由丙氨酸-丙氨酸、β -丙氨酸-β -丙氨酸、亮氨酸-亮氨酸及脯氨酸-脯氨酸所组成的群。
29.如权利要求对至观中任一项所述的类似物，其中该间隔物及该酰基的总长度为约 14至观个原子长度。
30.如权利要求1至四中任一项所述的类似物，其中该酰基为一C12至C18脂肪酰基。
31.如权利要求30所述的类似物，其中该酰基为C14或C16脂肪酰基。
32.如权利要求1至31中任一项所述的类似物，根据SEQID NO=I的编号，该1至6个带正电氨基酸是位于该类似物的第37、38、39、40、41、42及43号位置中任何位置。
33.如权利要求32所述的类似物，包含于第40号位置的一带正电氨基酸。
34.如权利要求1至33中任一项所述的类似物，其中该带正电氨基酸包含化学式IV的该结构
35.如权利要求34所述的类似物，其中该化学式IV的氨基酸为鸟氨酸、二胺基丁酸 (Dab)、赖氨酸或高赖氨酸。
36.如权利要求1-35中任一项所述的类似物，当该类似物不包含一亲水性基团时，该类似物于胰高血糖素样肽-1受体具有至少约4%的胰高血糖素样肽-1(SEQ ID N0:2)的活性。
37.如权利要求1-36中任一项所述的类似物，其中当该类似物不包含一亲水性基团时，该类似物于胰高血糖素受体具有至少约20%的胰高血糖素的活性。
38.如权利要求1-36中任一项所述的类似物，其中当该类似物不包含一亲水性基团时，该类似物包含在第3号位置的氨基酸修饰且于胰高血糖素受体具有少于的胰高血糖素的活性。
39.如权利要求1-35、37、38中任一项所述的类似物，其中当该类似物不包含一亲水性基团时，该类似物包含在第7号位置的氨基酸修饰且于胰高血糖素样肽-1受体具有少于 10%的胰高血糖素样肽-1的活性。
40.如权利要求1-39中任一项所述的类似物，其中该胰高血糖素胜肽是共价性连接至在第19、20、23、24、27、32、43号位置处或该羧基端的氨基酸任何位置的亲水性基团。
41.如权利要求40所述的类似物，其中该胰高血糖素胜肽是共价性连接至于第M或 40号位置处的氨基酸的亲水性基团。
42.如权利要求40或41所述的类似物，其中该亲水性基团是共价性键结至赖氨酸、半胱氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸。
43.如权利要求40至42中任一项所述的类似物，其中该亲水性基团为聚乙二醇 (PEG)。
44.如权利要求43所述的类似物，其中该聚乙二醇链分子量为约1，000道尔顿至约 40, 000道尔顿。
45.如权利要求43所述的类似物，其中该聚乙二醇链的分子量为约20，000道尔顿至约 40, 000道尔顿。
46.如权利要求40至45中任一项所述的类似物，其中对于胃抑胜肽受体活化的该类似物EC50为约IOnM或更少。
47.如权利要求40至46中任一项所述的类似物，其中该类似物于胃抑胜肽受体具有至少约0.01%的野生型胃抑胜肽(SEQ ID NO 4)的活性。
48.如权利要求40至47中任一项所述的类似物，其中该类似物于胰高血糖素样肽-1 受体具有至少约0.4%的胰高血糖素样肽-1 (SEQ ID NO 2)的活性。
49.如权利要求40至48中任一项所述的类似物，其中该类似物于胰高血糖素受体具有至少约2%的胰高血糖素的活性。
50.如权利要求1-38、权利要求40-47中任一项所述的类似物，其中该类似物于胰高血糖素样肽-I受体的EC50与该类似物于胃抑胜肽受体的EC50的比值约少于0. 01。
51.如权利要求1-50中任一项所述的类似物，其中该类似物的胃抑胜肽效能是在该类似物的胰高血糖素样肽-1效能的约500倍内。
52.如权利要求1-51中任一项所述的类似物，其中该类似物的胃抑胜肽效能是在该类似物的胰高血糖素效能的约500倍内。
53.一种包含两胰高血糖素胜肽的二聚体，其中该胰高血糖素胜肽中至少一个如权利要求1至52中任一项所述的类似物，通过一连接物连接至另一者。
54.一种药学组合物，包括如权利要求1至52中任一项所述的类似物、权利要求53所述的二聚体以及其药学可接受盐类，及药学可接受载体。
55.一种使用预调配水性组合物治疗低血糖症的方法，该方法包括施予一有效量的如权利要求M项所述的药学组合物的步骤。
56.一种治疗糖尿病的方法，该方法包括施予一有效量的如权利要求M项所述的药学组合物的步骤。
57.一种诱发肠道暂时麻痹的方法，该方法包括施予一有效量的如权利要求M项所述的药学组合物的步骤。
58. 一种减少体重增加或导致体重降低的方法，该方法包括施予一有效量的如权利要求讨项所述的药学组合物的步骤。
全文摘要
本发明提供了具有增加胃抑胜肽(GIP)活性的胰高血糖素胜肽，其可选择的具有胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及/或胰高血糖素活性。在某些实施例中，本发明提供包含有实际上与天然胰高血糖素相似的羧基端延伸的胰高血糖素胜肽。
文档编号C07K14/605GK102459325SQ201080027026
公开日2012年5月16日 申请日期2010年6月16日 优先权日2009年6月16日
发明者乔纳森·戴, 大卫·L.·斯迈利, 布莱恩·P.·沃德, 玛丽亚·迪马仕, 理查德·D.·迪马仕, 约瑟夫·沙贝内, 詹姆斯·帕特森, 马涛 申请人:印第安纳大学科技研究有限公司