专利名称：一种促进鱼类卵黄生成的合成胜肽以及方法
技术领域：
本发明关于一种合成胜肽及其应用，特别是一种可以促进鱼类卵黄生成的合成胜肽，及其在诱发和促进种鱼成熟的应用。
背景技术：
台湾的水产养殖产业发展历史悠久，近二十年来，由于养殖技术的科技化及养殖品种的多元化，带动养殖产业快速发展与成长。台湾早期的鱼类养殖大都以粗放混养的养殖形式，种苗来源多仰赖捕捞，故种苗数量、来源及品质多不稳定，无法符合产业发展的需求；近年来，因幼苗培育技术及人工饵料的建立，促使水产养殖的集约化、企业化，集约式养殖方式使养殖鱼类的放养密度大幅度增加，因而对于种苗数量、质量上的需求也相对提升；因此，种苗的来源无法完全依赖自然捕捞，必须以人工繁殖技术诱导养殖鱼类性腺发育、卵 巢成熟(即卵黄发育达第三期)，再以环境因子或内分泌等刺激诱导排卵及产卵，培育稚鱼以满足现今养殖产业对种苗的需求；然而，目前多数养殖业者在种苗生产与开发上往往遭遇诸多问题，有必要针对养殖鱼类生殖调控机制加以研究并建立良好的育苗系统。鱼类的生殖调控机制较为复杂且相关生理研究至近十数年才渐有成果展现，主要是由外在环境的刺激(如光周期、温度等)以及内分泌系统而控制；一般而言，鱼类的生殖内分泌应与脊椎动物相同，是由荷尔蒙分泌调控信息传递，通过下视丘-脑垂体-生殖性腺(hypothalamus-pituitary-gonad)的传递路径,进而控制一连串的生殖反应，诱发生殖细胞的成长及成熟。下视丘是分泌促性腺激素释素(Gonadotropin ReleasingHormone ;GnRH)或促性腺激素抑制因子(Gonadotropin Inhibiting Factor ;GnIF,如多巴胺Dopamine)分别刺激或抑制脑垂体促性腺激素(Gonadotropin ；GtH)的合成、释放,该促性腺激素可通过血液输送至卵细胞或精细胞膜上的接受器，促使蛋白质激酶磷酸化，诱发类固醇合成(Steroidogenesis);其中，雌二醇是主导卵细胞的成熟，即为卵黄生成作用(Vitellogenesis),再由成熟促动因子(maturation factor)的作用使卵细胞进入最后成熟阶段，而成熟卵细胞(即卵黄第三期)则由水温、光照及其他环境因子的诱导以致排卵及产卵，为雌鱼性成熟的生理作用途径及调控机制；其中，由下视丘所分泌的GnRH由十个氨基酸所组成，为所有脊椎动物在繁殖调控上负责连接外在刺激及内在分泌的主要机制，因 此，脊椎动物的GnRH普遍具有很高的物种相似度，约50 90%。在过去研究中，已有多种GnRH由脊椎动物各物种中分离出来，一般认为，同一物种中应具有一种以上的GnRH，在该物种内分泌系统的调控上代表不同意义；而在鱼类生殖细胞的发育成熟过程中，GnRH分别在调控卵黄生成以及最后的成熟步骤中扮演重要角色。由上所述，下视丘分泌的促性腺激素释素(GnRH)及脑垂体分泌的促性腺激素(GtH)皆为刺激鱼类生殖发育的主要因子，现有种鱼的人工繁殖操作多用脑垂体注入法(Hypophysation),即以促性腺激素(GtH)处理以获得预期的产卵结果,然而，该GtH具有种间差异性且无法以合成方式取得，如以基因工程方式生产则成本偏高，故使用范围受限；而目前养殖产业最常使用的激素制剂除含GtH成分的脑垂体萃取或纯化制剂外，还有人类胎盘绒毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin ；hCG)及商用激素混合制剂[由LHRHA与多巴胺拮抗剂(Domperidome)混合]，两者的使用皆为促进成熟种鱼卵细胞的最后成熟，即由第三卵黄期至排卵、产卵的过程，然而，上述各种激素制剂皆无法促进养殖鱼类卵细胞的早期发育，亦即无法诱发及促进养殖鱼类卵黄生成作用，因此，对于生殖季节短暂，在人为养殖条件下难以自然发育成熟，成熟状态不稳定，生殖季节不利于进行人工种苗培育或种苗来源稀少的养殖鱼类，不易建立一种有效控制产卵及种苗量产的技术，为现今养殖产业的发展瓶颈。
发明内容
本发明的主要目的是针对上述问题加以改进，提供一种促进鱼类卵黄生成的合成胜肽，可以促进硬骨鱼类卵细胞的早期发育、成熟。本发明的次一目的是提供一种促进鱼类卵黄生成的的制剂，可以调节重要养殖鱼类的产卵季节。 本发明的又一目的是提供一种促进鱼类卵黄生成的方法，以提高种鱼性腺发育率，降低产业成本及提升经济效益。为达到前述发明目的，本发明所运用的技术手段包含有—种促进鱼类卵黄生成的合成胜肽为十个氨基酸所组成的胜肽(decapeptide),具有以下序列Glu His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly,该合成胜肽参照自一禽类所自然分泌的GnRH-II。一种促进鱼类卵黄生成的制剂，包含上述的合成胜肽。一种促进鱼类卵黄生成的方法，是将如上所述的制剂埋植至一硬骨鱼类的体壁或体腔，如体侧肌肉或腹腔，以促进该硬骨鱼类卵细胞的成熟。
图I :本发明一种促进鱼类卵黄生成制剂的埋植示意图。图2a :本发明一种促进鱼类卵黄生成制剂于点带石斑的施用效果示意图。图2b :本发明一种促进鱼类卵黄生成制剂于点带石斑的施用效果又一示意图。图3 :本发明一种促进鱼类卵黄生成制剂于乌鱼的施用效果示意图。主要元件符号说明I注射器2硬骨鱼类21背鳍
具体实施例方式为让本发明的上述及其他目的、特征及优点能更明显易懂，下文特举本发明的较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下本发明一种促进鱼类卵黄生成的合成胜肽，为十个氨基酸所组成的胜肽(decapeptide),该合成胜肽的序列参照自一禽类(如鸡、鸭或鹅等)所自然分泌的GnRH-II序列；该合成胜肽可以诱发及促进硬骨鱼类的卵黄生成作用。将该合成胜肽埋植至一硬骨鱼类的体壁或体腔，可以有效促进该硬骨鱼类的卵黄生成及堆积，促使雌性种鱼发育成熟，并且可调控该硬骨鱼类雌性种鱼的生殖季节。
更详言之，本发明的合成胜肽，参考鸡所自然分泌的GnRH-II的氨基酸序列p_GluHis Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly_NH2 (请参见序列表,序列识别编码1),由一氨基酸合成仪(即以solid-phase peptide synthesis方式合成)进行人工合成,该合成胜肽具有以下序列Glu His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly(请参见序列识别编码2),相较于该鸡所自然分泌的GnRH-II，该合成胜肽N端的谷氨酸Glu)未经环化而形成pyro-Glu，而该合成胜肽C端的甘胺酸(Gly)则未被酰胺化而转成Gly-NH2，因此，该合成胜肽的第一及第十个氨基酸皆未经修饰，亦即未被阻断，与鸡所自然分泌的GnRH II在结构上略有不同，该合成胜肽可由Edman降解法(Edman degradation)进行氨基酸定序；一般而言，生物体所分泌的GnRH因具有很高的种间相似度，故由本发明的合成胜肽可以刺激多数硬骨鱼类的脑垂体，促使脑垂体合成及释放促性腺激素(GtH)，开启该硬骨鱼类的生殖内分泌系统，促使卵黄生成作用开始进行。本发明一种促进鱼类卵黄生成的方法，是将一制剂埋植于一硬骨鱼类的体壁或体腔，如体侧肌肉或腹腔，该制剂包含本发明的合成胜肽，使该合成胜肽可以在硬骨鱼类体内缓慢释放，刺激该硬骨鱼类的卵细胞发育、成熟，进而调控该硬骨鱼类的生殖季节。本实施例将该合成胜肽混合一基质，再填入一玻璃管进行压制，以便压缩、固化而制成本发明的制 齐U，该合成胜肽的剂量可以为10微克g) 5毫克(mg)/单位个体重量，较佳依照施用个体的种类及体重的不同稍作调整，如每单位鯧鱼体重(公斤)施用100 500微克(y g)的合成胜肽；该基质由一胆固醇(cholesterol)、一纤维素(cellulose)及少量油脂黏着剂所共同构成的混合物，其中，该胆固醇所占的质量比例约为50 95%，纤维素则为5 50 %，该合成胜肽由胆固醇及纤维素包覆、压制而呈缓释锭剂形式，较佳于压制前混合少量油脂黏着剂(如植物油，椰子油)，以增加黏性加速制程；该合成胜肽具有与禽类GnRH-II的胜肽序列(p-Glu His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly_NH2)相同的序列及近似的结构，可以刺激该硬骨鱼类的生殖内分泌系统；纤维素具有组织支撑的功能，可以维持该制剂的构形；该胆固醇可以包覆该合成胜肽，使该合成胜肽具有缓释效果，同时该胆固醇为生物体合成荷尔蒙的重要原料，可以辅助该硬骨鱼类的生殖内分泌系统合成生殖激素。请参照图I所示，为本发明制剂的埋植示意图，由一注射器I将该制剂直接植入一硬骨鱼类2背鳍21基部的肌肉中，使该制剂所含的合成胜肽可以缓慢释放于该硬骨鱼类中，以长时间刺激该硬骨鱼类的脑垂体释放促性腺激素，使卵黄生成、堆积。为证实本发明一种促进鱼类卵黄生成的合成胜肽可以有效促使硬骨鱼类的卵黄生成堆积，将该制剂埋植至一养殖硬骨鱼类，观察该养殖硬骨鱼类的卵黄生成及卵细胞成熟情形。请参照图2a及2b所示,本实施例是采用点带石斑(Epinephelus coioides)进行试验，该点带石斑为台湾地区主要养殖的石斑鱼种，市场价格高，于天然海域的分布范围极广，该点带石斑的生殖季节为春末(4 5月)至夏中出 8月)，有时会延长至秋初，由4 5年的成熟雌鱼进行产卵；该点带石斑的养殖技术在台湾虽已渐成熟，然而在繁殖发展上，却无法改善；点带石斑为适高水温鱼种，虽然台湾位处亚热带，其生殖季节高峰仍偏处春、夏季，又种鱼在人工养殖状态下须待其自然成熟后方能以激素注射促使其产卵，因此种苗生产技术及流程尚有瓶颈亟待突破。请再参照图2a及2b所示，是将本发明的制剂及一商用激素制剂(如LHRHA)分别埋植至数组体重达2 3. 5公斤的成熟点带石斑，逐月抽取并监测该点带石斑的卵细胞发育情况，判别卵巢成熟程度；其中，该商用激素制剂同样混合一纤维素、一胆固醇及一植物油，再注入该玻璃管进行压缩、固化，制成缓释锭剂形式，以避免实验差距；该点带石斑卵细胞的发育情况及成熟度由卵径大小变化及卵黄堆积状态判别，其卵细胞发育阶段依序约略可分为I.卵黄泡期卵径大小为10 70微米(ilm) ；2.卵黄发育第一期卵径大小为70 120微米；3.卵黄发育第二期卵径大小为120 250微米；4.卵黄发育第三期卵径大小> 400微米，此时卵细胞已完成卵黄堆积达成熟阶段。数组点带石斑的分组状态如下表所示第I表点带石斑分组状态
权利要求
1.一种促进鱼类卵黄生成的合成胜肽，为十个氨基酸所组成的胜肽(decapeptide)，如序列辨识编码2所示。
2.一种促进鱼类卵黄生成的制剂，包含如权利要求I所述的合成胜肽。
3.如权利要求2所述的一种促进鱼类卵黄生成的制剂，其特征在于，该制剂由一种纤维素、一种胆固醇及少量油脂黏着剂所组成的基质包覆该合成胜肽。
4.如权利要求2所述的一种促进鱼类卵黄生成的制剂，其特征在于，该合成胜肽的剂量为10微克至5毫克/单位个体重量(公斤)。
5.如权利要求2所述的一种促进鱼类卵黄生成的制剂，其特征在于，该制剂呈缓释锭剂形式。
6.如权利要求3所述的一种促进鱼类卵黄生成的制剂，其特征在于，该胆固醇于该基质所占的质量比例为50 95%,纤维素则为5 50%。
7.一种促进鱼类卵黄生成的方法，将如权利要求2所述的制剂埋植至一只硬骨鱼类的体壁或体腔，以促进该硬骨鱼类卵细胞的成熟。
8.如权利要求7所述的一种促进鱼类卵黄生成的方法，其特征在于，是将该制剂埋植于该硬骨鱼类的体侧肌肉。
9.如权利要求7所述的一种促进鱼类卵黄生成的方法，其特征在于，是将该制剂埋植于该硬骨鱼类的腹腔。
全文摘要
一种促进鱼类卵黄生成的合成胜肽为十个氨基酸所组成的胜肽(decapeptide)，如序列辨识编号2所示。该合成胜肽参照自一禽类所自然分泌的GnRH-II；一种促进鱼类卵黄生成的制剂，包含上述的合成胜肽；以及，一种促进鱼类卵黄生成的方法，是将如上所述的制剂埋植至一硬骨鱼类的体壁或体腔，以促进该硬骨鱼类卵细胞的成熟。
文档编号C07K7/06GK102675420SQ20111006459
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者陈英男 申请人:屏东科技大学