专利名称：缺失型人角质细胞生长因子-Ⅰ二硫键变构体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于重组蛋白及其在制药领域的应用，特别是涉及ー种缺失型人角质细胞生长因子-I ニ硫键变构体及其制备方法以及作为药物在预防和治疗纤维化增生性疾病和血管增生性疾病中的应用。本发明是发明名称为“新型人角质细胞生长因子突变体”(专利号CN 03101156. X)的发明专利的延伸。
背景技术：
角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor, KGF)属于成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)家族,具有肝素结合特性。目前已发现两种角质细胞生长因子，即角质细胞生长因子-I (KGF- I )和角质细胞生长因子-II (KGF- II )，又分别被命名为 FGF-7 和 FGF-10 (Aarono son SA et al，Ann N Y Acad Sci，1991，638 :62-77)。人角质细胞生长因子-I (hKGF- I )最初由Rubin等人(Rubin JS et al, Proc Natl Acad Sci USA，1989，86 :802-806)从人胚胎肺成纤维细胞的生长培养液中分离纯化，因具有促进小鼠角质细胞有丝分裂的作用，故被命名为角质细胞生长因子；hKGF- II是Emoto等人(Emoto H et al, J Biol Chem，1997，272 :23191-23194)从肺中分离出编码 KGF- II 的cDNA。hKGF- I基因位于15号染色体，编码含194个氨基酸残基的蛋白前体，包含一段31个氨基酸残基的分泌信号肽，成熟的hKGF- I是ー个含163个氨基酸残基的单链多肽。大量研究结果显示，hKGF- I由间质细胞表达，通过旁分泌的方式作用于上皮细胞，是一种多功能的细胞生长因子，具有广泛的生物学作用。hKGF- I能够促进包括肝实质细胞、胃肠上皮细胞、II型肺泡上皮细胞、尿道上皮细胞、角膜上皮细胞和各种鳞状上皮的角化细胞等多种上皮细胞(Finch Pff et al, Science, 1989,245 :752-755 ；Farrell CL et al,Int J Radiat Biol, 1999, 75 :609-20 ；Farrell CL et al,Cancer Res,1998, 58 :933-939 ;Ellison CA et al, J Clin Immunol, 2008,28 :600-615 ；Terry NH et al, Int J RadiatOncol Biol Phys, 2004, 58 :435-444 ;Imayasu M et al, Curr Eye Res2003, 27 133-141)的増殖、迁移、分化、存活，維持细胞骨架结构蛋白的稳定，拮抗辐射损伤、促进DNA修复以及诱导解毒酶的表达来加强上皮功能，有效保护上皮细胞免于毒性物质和射线的损伤。损伤修复过程中hKGF- I可被大量诱生表达，促进伤ロ愈合，加快角膜上皮细胞损伤恢复的速度，缩短角膜上皮细胞愈合时间。天然野生型hKGF- I由163个氨基酸组成，分子量为21KD，含5个Cys，分别位于第I位、第15位、第40位、第102位和第106位，其中形成Cysl_Cysl5、Cysl02_Cysl06两对ニ硫键，Cys40以游离巯基形式存在于分子内部(Osslund TD et al,Protein Sci, 1998,7 :1681-1690)。全长hKGF- I蛋白质具有不稳定性，容易发生断裂和聚集，利用基因工程技术，通过突变或缺失某些氨基酸可以改善蛋白质的稳定性。文献报道(Osslund TD et al,Protein Sci,1998,7 1681-1690 ；Hsu E et al, Protein Eng Des Sel,2006,19 :147-153和美国专利US 5677278)缺失N端23个氨基酸，且形成Cysl02_Cysl06 ニ硫键(记为Λ 23hKGF- I )吋，不影响其生物活性，且会提高稳定性。该事实说明，N端第1-23位氨基酸及Cysl-Cysl5 ニ硫键与KGF- I的生物学活性无关。本发明人曾将hKGF- I天然序列第102位的Cys突变为Ser,使之无法形成Cysl02_Cysl06 ニ硫键,并缺失N端24个氨基酸,形成新型的hKGF- I突变体(记为102S Λ 24 hKGF- I )。该新型hKGF- I突变体能促进角质细胞増殖和抑制成纤维细胞生长，具有抗疤痕、抗纤维化和促进表皮愈合的功能，该发明已获得中国专利(CN 03101156. X)授权。在上述专利的基础上，本发明通过ニ硫键配对分析发现，重组表达的缺失型hKGF- I (Δ23 hKGF- I )及上述的102S Λ 24 hKGF- I突变体均未形成对应于天然 hKGF- I第40位和第106位Cys间的ニ硫键，其中Λ 23 hKGF- I仅有Cysl02和Cysl06间的ニ硫键形成，102S Λ 24 hKGF- I中无ニ硫键形成。本发明对ニ种序列中对应于天然hKGF- I的Cys40和Cysl06人为形成分子内ニ硫键的方法进行了详细的研究摸索，并对该ニ硫键形成后分子构象进行了确证。与Cys40和CyslOe间未形成ニ硫键的结构相比，形成非天然CyS40-CyS106 ニ硫键后的hKGF- I缺失型突变体在空间构象上有显著变化，并经系列研究发现，出现了新的生物学功能，既能促进上皮细胞増殖，又可逆转组织纤维化，并有效抑制新生血管生长。同时，本发明人构建和制备了将第106位Cys突变成Ser的106SΔ23 hKGF- I缺失型突变体重组蛋白，采用本专利实施例的方法，结果未能实现非天然ニ硫键CyS40-CyS102的有效形成。组织纤维化是一种严重危害人类健康的慢性疾病，是许多疾病致残、致死的主要原因。世界卫生组织的统计表明，全球因各种疾病致死的病人中，约40%可以归因于组织纤维化疾病，如矽肺、肺囊虫感染、病毒性肝硬化、酒精性肝硬化、肾小球肾炎、肾盂肾炎等。组织纤维化可导致器官组织内结缔组织增多，实质细胞减少，持续发展可致组织硬化，使器官功能減退乃至衰竭，严重威胁人类健康和生命。到目前为止，尚无治疗组织纤维化的有效药物。而本发明提供的缺失型hKGF- Iニ硫键变构体具有新的抑制纤维增生的生物学作用，能逆转组织纤维化，有望开发成液体水针、冻干粉针、缓控释剂和滴眼药剂等形式的制剂，临床上用于治疗慢性肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化、角膜纤维化和皮肤纤维化等组织纤维化疾病。还可开发成外用药剂用于防治因皮肤纤维化导致的疤痕形成。本发明提供的缺失型hKGF- I ニ硫键变构体还具有新的抑制新生血管生长的生物学作用，可用于抑制新生血管瘤的生长以及肿瘤的血管增生，有望开发成抗癌药物。检索国内外专利和文献发现，尚无关于hKGF- I的非天然ニ硫键形成、构象变化及其生物学作用的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种具有新的生物学作用的缺失型人角质细胞生长因子-I (hKGF- I ) ニ硫键变构体，其核心特征在于含有对应于天然hKGF- I第40位和第106位半胱氨酸(Cys)间的非天然ニ硫键结构，其新的生物学作用包括抑制纤维增生和抑制新生血管生长。在本发明的第一个方面，提供了ー种具有新的生物学作用的缺失型hKGF- I ニ硫键变构体的氨基酸序列或组成。
本发明所述的ニ硫键变构体是指含有对应于天然hKGF- I第40位和第106位半胱氨酸(Cys)间的非天然ニ硫键结构，其分子构象已发生显著改变的hKGF- I缺失型突变体。该突变体在非天然ニ硫键形成以前既可特指本发明的ニ硫键变构体，也可更广义地被称为突变体；在非天然ニ硫键形成后，因分子构象已发生显著变化，更狭义地被称为ニ硫键变构体。本发明所述的ニ硫键变构体的氨基酸序列是指在天然野生型hKGF- I的氨基末端缺失23个氨基酸的缺失突变体(即Λ 23 hKGF- I )，具有Seq ID No : I的氨基酸序列特征。序列中第17位、第79位和第83位的半胱氨酸(Cys)分别对应于天然hKGF- I的第40位、第102位和第106位。本发明同时包含在Seq ID No 1序列的基础上，氨基末端增加或减少1_5个氨基酸的突变体。如在Seq ID No : I序列的氨基末端增加ー个甲硫氨酸(Met)，或增加序列为 Pro-Glu-His-Thr-Arg 或 Met-Glu-His-Thr-Arg 的 5 个氨基酸；或从 Seq ID No 1 序列的氨基末端减少ー个丝氨酸(Ser)，或减少序列为Ser-Tyr-Asp-Tyr的4个氨基酸，或减少序列为Ser-Tyr-Asp-Tyr-Met的5个氛基酸。本发明同时也包含在Seq ID No : I序列的基础上，将第79位的Cys (对应于天然hKGF- I的第102位)突变为非极性氨基酸。所述非极性氨基酸主要指Ser、Ala、Gly、Thr、Leu或He，本发明优选的非极性氨基酸是Ser，记为Λ 23 S79 hKGF- I，具有Seq ID No:2的氨基酸序列特征。本发明上述的任何一种缺失型hKGF- I的ニ硫键变构体或突变体，通过重组DNA技术制备而成。所述的重组DNA技术是指利用分子生物学技术，合成或提取外源目的基因，对外源基因进行缺失或点突变，然后将外源基因转入表达宿主，利用表达宿主表达外源目的蛋白。表达宿主可以是原核系统，也可以是真核系统，其中的原核表达系统可以是大肠杆菌，真核表达系统可以是酵母和哺乳动物细胞。本发明优选大肠杆菌原核表达系统。在本发明的第二个方面，提供了一种能够促使上述任何一种缺失型hKGF- I ニ硫键变构体形成非天然ニ硫键(即Cysl7_Cys83 ニ硫键)的制备方法。本发明的核心特征在于，上述的任何一种缺失型hKGF- I的ニ硫键变构体含有第17位和第83位(对应于天然hKGF- I第40位和第106位)半胱氨酸间的非天然ニ硫键结构。本发明上述的任何ー种hKGF- I的ニ硫键变构体或突变体的获得是通过重组DNA技术、微生物大規模培养技术和生物工程下游纯化技术实现的。根据变构体的氨基酸序列，结合宿主菌的遗传密码子偏好型，化学合成对应的缺失型hKGF- I突变体cDNA，连接到重组质粒载体中，并成功构建高效表达工程菌株；接种到培养基，采用微生物大規模培养技术，高密度表达缺失型hKGF- I突变体蛋白；离心收集菌体并破菌后，采用生物工程下游纯化技术，通过色谱层析手段，得到纯度95%以上的缺失型hKGF- I的突变体重组蛋白。本发明所述的色谱层析手段，主要指离子交换层析、肝素亲和层析、反相层析和凝胶过滤层析，更优选地，为离子交换层析和肝素亲和层祈。本发明通过特有的ニ硫键配对复性方法，促使第17位与第83位的Cys之间形成非天然ニ硫键，即Cysl7-Cys83 ニ硫键(对应于天然hKGF- I的Cys40_Cysl06 ニ硫键)。其主要步骤为
①将得到的纯度95%以上的缺失型hKGF- I突变体重组蛋白，在碱性条件下用还原剂处理，使其第17位和第83位的Cys的巯基(-SH)均处于游离状态；②在碱性条件下经菲洛林和铜离子配对复性，促进形成Cysl7-Cys83 ニ硫键，获得具有第17位和第83位Cys间非天然ニ硫键的变构体。③采用色谱层析手段，从复性样品中分离并得到纯度95%以上的缺失型hKGF- Iニ硫键变构体。本发明上述的制备方法中，所述的还原剂主要指ニ硫苏糖醇(Dithiothreitol, DTT)、β_ 巯基こ醇、三[2-羧こ基]膦(Tris [2-carboxyethyl]phosphine, TCEP)以及半胱氨酸等试剂，更优选地，为DTT。本发明所述的菲洛林是指1,10-菲洛林(I, ΙΟ-Phenanthroline),铜离子主要是指硫酸铜，但不限于硫酸铜，还可以是其它形式的铜离子。菲洛林和铜离子的摩尔比例范围
I: 10 100 : I均可，更优选地，为I : I 5 : I。本发明所述的碱性条件是指7. O 12. O的pH值范围，更优选地，为9. O 11. O。本发明所述的色谱层析手段，主要指离子交换层析、肝素亲和层析、反相层析和凝胶过滤层析，更优选地，为反相层析。本发明上述的任何一种缺失型hKGF- I的ニ硫键变构体或突变体在非天然ニ硫键形成后，因分子构象已发生显著变化，更狭义地被称为ニ硫键变构体，并在其代号后追加“-M”以示区別。具有Seq ID No 1的氨基酸序列特征的缺失突变体(Λ 23 hKGF- I )，形成非天然ニ硫键后被记为Λ 23 hKGF-M，具有Seq ID No :2的氨基酸序列特征的突变体(Λ 23S79 hKGF- I )，形成非天然ニ硫键后被记为Λ 23 S79 hKGF-M。在本发明的第三个方面，提供了上述任何一种缺失型hKGF- I ニ硫键变构体在预防和治疗纤维化增生性疾病和血管增生性疾病上的应用。本发明所述的缺失型hKGF- I ニ硫键变构体，与天然hKGF- I相比，构象上发生了显著变化。首先经质量肽图结果证实了其中的Cysl7-Cys83 ニ硫键(对应于天然hKGF- I的CyS40-CyS106 ニ硫键)的形成。计算机模建数据表明，与未形成前相比和与形成Cys79_Cys83 ニ硫键结构相比(Λ 23 hKGF- I )，形成Cysl7_Cys83 ニ硫键后的分子构象发生了极显著变化(附图I)。利用本发明提供的方法，制备获得的ニ硫键变构体重组蛋白进行的圆二色谱(⑶)分析结果同样表明，形成非天然Cysl7-Cys83 ニ硫键后⑶图谱出现明显差异(附图2)。本发明所述的缺失型hKGF- I ニ硫键变构体，发现具有抑制纤维增生和抑制新生血管生长的生物学作用。本发明通过细胞体外活性測定实验证明，形成Cysl7-Cys83 ニ硫键后的缺失型hKGF- I ニ硫键变构体重组蛋白除保留原有促上皮细胞増殖(附图3)的生物学活性外，还出现了新的生物学作用，能够较明显地抑制人组织纤维细胞(附图4)和人血管内皮细胞(附图5)的生长和増殖。此外，本发明通过SD大鼠肝纤维化模型、SD大鼠肺纤维化模型和鸡胚绒毛尿囊膜实验证明，形成Cysl7-Cys83 ニ硫键后的缺失型hKGF- I变构体重组蛋白能够有效地逆转慢性肝损伤造成的肝纤维化(附图6和附图7)和急性肺损伤造成的肺纤维化(附图8)，井能够有效地抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生长(附图9)。本发明所述的抑制纤维增生的生物学作用适用于预防和治疗纤维化增生性疾病，包含但不限于慢性肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化、角膜纤维化和皮肤纤维化，还包含其它组织器官的纤维化。本发明所述的抑制新生血管生长的生物学作用适用于预防和治疗血管增生性疾病，包含但不限于视网膜黄斑、新生血管瘤以及肿瘤的血管增生。本发明所述的预防和治疗纤维化增生性疾病和血管增生性疾病的应用，是通过含缺失型hKGF- I ニ硫键变构体重组蛋白的药物组合物来实现。本发明所述的药物组合物适用于各种给药方式，例如ロ服给药、静脉内给药、肌肉内给药、局部给药、经皮给药、经鼻给药等。根据所采用的给药方式，可将含有本发明缺失型hKGF- I ニ硫键变构体重组蛋白的药物组合物制成合适的剂型，其中包含在有效剂量范围的缺失型hKGF- I ニ硫键变构体重组蛋白和至少ー种药学上可接受的药用载体。
本发明所述的适当剂型的实例包含但不限于片剂、胶囊、粒剂、糖浆、ロ服溶液、气雾胶、鼻喷剂、滴眼剂、缓控释剂、透皮制剂、用于皮肤表面的油膏和药贴、以及可用于注射的无菌溶液等。含有本发明缺失型hKGF- I ニ硫键变构体重组蛋白的药物组合物可以制成无菌液体或者冻干粉末，优选地，用于胃肠外给药。本发明所述的适当剂型中还可含有其它常规组分，如防腐剤、稳定剂、表面活性齐U、缓冲剂、乳化剤、增甜剂、着色剂、调味剂、调节滲透压的盐等等。本发明药物组合物中使用的稳定剂优选柠檬酸钠、甘氨酸、甘露醇等。含有本发明药物组合物的无菌液体或者 冻干粉末更优选的配方包括缺失型hKGF- I ニ硫键变构体重组蛋白O. 1-5. Omg,甘露醇15-60mg，甘氨酸O. 1-8. Omg, pH 3. 0-6. 0，液体配方还含有注射用水O. 5-2. Oml0若有特殊治疗要求，本发明所述的药物组合物还可包含其他活性药理成分，这种相伴使用有利于疾病的预防和治疗。本发明所述的药物组合物中，缺失型hKGF- I ニ硫键变构体重组蛋白的用量可以在ー个较大范围内变动，本领域技术人员可以根据ー些已知的因素，诸如疾病的种类、病情严重程度、病人体重、剂型、所选给药途径等很容易的加以确定。毎日用量根据制剂和治疗目的的不同而有较大差异，通常的人体用量范围为I. 0-100 μ g/kg，但不限于此范围。至此已对本专利进行了详细的描述，通过參考下面的实施例能够更清楚地理解本发明，所述实施例仅为说明目的而并不g在对本发明进行限制。
附图I :缺失型hKGF- I ニ硫键异构体中不同ニ硫键配对的计算机模拟分子构象比较图。其中，图A为不含ニ硫键的Λ23 hKGF- I的构象图，图B为含Cys79-Cys83 ニ硫键的Λ 23 hKGF- I的构象图，图C为含Cysl7-Cys83 ニ硫键的Λ 23 hKGF- I ニ硫键变构体的构象图，图D为不含ニ硫键的Λ 23 S79 hKGF- I的构象图，图E为含Cysl7_Cys83 ニ硫键的Λ 23 S79 hKGF- I ニ硫键变构体的构象图。附图2 :缺失型hKGF- I ニ硫键异构体中不同ニ硫键配对的圆二色谱(⑶)比较图。其中，图A为不含ニ硫键的Λ 23 hKGF- I的⑶图，图B为含Cys79_Cys83 ニ硫键的Δ 23 hKGF- I的CD图，图C为含Cysl7_Cys83 ニ硫键的Λ 23 hKGF- I ニ硫键变构体的CD图，图D为不含ニ硫键的Λ 23 S79 hKGF- I的⑶图，图E为含Cysl7_Cys83 ニ硫键的Λ 23S79 hKGF- I ニ硫键变构体的CD图。
附图3 NBL-7细胞株体外生物学活性測定刺激细胞生长最大百分率示意图。其中，A为对照品hKGF- I，B为Λ 23突变体，C为Λ 23-Μ变构体，D为Λ 23 S79-M变构体。附图4 :HSC细胞体外生物学活性測定刺激或抑制细胞生长最大百分率示意图。其中，A为对照品hbFGF，B为Λ 23突变体，C为Λ 23-Μ变构体，D为Λ 23 S79-M变构体。附图5 =HUVEC细胞体外生物学活性測定刺激或抑制细胞生长最大百分率示意图。其中，A为对照品hVEGF，B为Λ 23突变体，C为Λ 23-Μ变构体，D为Λ 23 S79-M变构体。附图6 =CCl4肝损伤SD大鼠慢性肝纤维化模型中预防给药各实验组的病理照片(VG染色)。其中，图A为模型对照组，图B为Λ 23突变体组，图C为Λ 23-Μ变构体组，图D为Λ23 S79-M变构体组。
附图7 =CCl4肝损伤SD大鼠慢性肝纤维化模型中治疗给药各实验组的病理照片(Masson染色)。其中，图A为正常对照组，图B为模型对照组，图C为Λ 23突变体组，图D为Λ 23-Μ变构体组，图E为Λ 23 S79-M变构体组。附图8 :博莱霉素肺损伤SD大鼠急性肺纤维化模型中各实验组的病理照片(HE染色)。其中，图A为正常对照组，图B为模型对照组，图C为Λ 23突变体组，图D为Λ 23-Μ变构体组，图E为Λ 23 S79-M变构体组。附图9 :鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生长实验照片示意图。其中，图A为生理盐水组，图B为bFGF组，图C为Λ 23 S79-M变构体组。附图10 :cDNA测序图谱結果。其中，图A为pET_3C_Λ 23的测序报告，其中的第35位至第454位为Λ 23 hKGF- I的cDNA序列；图B为pET_3C_Δ 23 S79测序报告，其中的第46位至第465位为Λ 23 S79 hKGF- I的cDNA序列。附图11 : Λ 23 S79 hKGF_Mニ硫键变构体的胰蛋白酶酶切质量肽图色谱图。其中，图A为非还原肽图，图B为还原肽图。附图12 :家兔角膜损伤修复实验中各组的角膜病理显微照片图(HE染色)。其中，图A为模型对照组，图B为bFGF对照组，图C为Λ 23 S79-M变构体组。
具体实施例方式实施例一编码人野生型KGF- I的cDNA序列的获得根据天然野生型hKGF- I的氨基酸和cDNA序列(GI 186738)，并按照大肠杆菌偏爱的密码子，设计以下Seq ID No 3的碱基序列(共489bp)，委托宝生物(大连)有限公司(TAKARA，大连)进行全基因合成，嵌入pUC18载体且命名为pUC18_KGF。TGCAATGACATGACTCCTGAACAAATGGCTACCAATGTCAACTGTTCCTCTCCGGAGCGCCACACCCGGAGTTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGTGTTCGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGTGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTACAACATCATGGAAATCCGTACCGTTGCTGTTGGTATCGTTGCTATCAAAGGTGTTGAATCTGAGTTCTACCTGGCTATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCTAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCTTCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCTATCACC。实施例ニ 缺失型Λ 23 hKGF- I重组质粒和工程菌株的构建根据Λ 23 hKGF- I的氨基酸序列(Seq ID No 1)设计并合成引物Pl和P2
Pl 5/ -gCA TAT gTA CgA CTA CAT ggA Agg Tgg TgA C-3/ (Seq ID No :4)P2 5/ -ggg ATC CTC Agg TgA Tag CCA TCg g_3' (Seq ID No :5)Pl为Λ 23正向引物，其中g为保护碱基，CATATg为Nde I酶切位点；P2为Λ 23反向引物，其中g为保护碱基，ggATCC为BamH I酶切位点。以pUC18-KGF质粒为模板，用引物Pl和P2扩增Λ 23 hKGF- I基因片段。PCR反 应条件为94°C lmin,56°C lmin,72°C lmin，共30个循环,第一个循环94°C变性lOmin，最后一个循环72°C延伸lOmin，结果显示获得了 420bp的扩增片段。PCR产物经低熔点琼脂糖回收后，用Nde I和BamH I双酶切，回收目的片段，再用T4 DNA连接酶与质粒pET_3C (购于Invitrogen)同样经Nde I和BamH I酶切回收的片段连接,转化大肠杆菌克隆宿主菌ToplO，用酶切和PCR验证的方法筛选重组质粒pET-3C- Λ 23。经DNA测序(TAKARA，大连)证明重组质粒中Λ 23 hKGF- I的cDNA序列正确后(附图IOA图)，转化大肠杆菌表达宿主菌 BL21 Star (DE3) plysS (Novagen)，成功构建 pET_3C_ Δ 23/BL21 Star (DE3) plysS 重组表达工程菌。实施例三突变型Λ 23 S79 hKGF- I重组质粒和工程菌株的构建根据Λ 23 S79 hKGF- I的氨基酸序列(Seq ID No 2)设计并合成两对引物P3 5/ -gCA TAT gTA CgA CTA CAT ggA Agg Tgg TgA C_3' (Seq ID No 4)P4 5/ -ggg ATC CTC Agg TgA Tag CCA TCg g_3' (Seq ID No :5)P5 5/ -gCT AAA AAA gAA TCC AAC gAA gAC C-3/ (Seq ID No :6)P6 5/ -TTC gTT ggA TTC TTT TTT AgC gTA_3' (Seq ID No :7)P3为正向引物，与Pl相同；P4为反向引物，与P2相同；P5为正向引物，用于对应于天然序列第102位Ser点突变的扩增；P6为反向引物，用于对应于天然序列第102位Ser点突变的扩増。以pET-3C- Δ 23质粒为模板，用引物P3和P6扩增含突变点的5'端的cDNA片段，用引物P4和P5扩增含突变点的3'端的cDNA片段。再将扩增后得到的两个片段混合后作为模板，用引物P3和P6扩增含Ser突变位点的Λ 23 S79 hKGF- I基因片段(420bp)。PCR产物经低熔点琼脂糖回收后，用Nde I和BamH I双酶切，回收目的片段，再用T4 DNA连接酶与质粒PET-3C (购于Invitrogen)同样经Nde I和BamH I酶切回收的片段连接,转化大肠杆菌克隆宿主菌ToplO，用酶切和PCR验证的方法筛选重组质粒pET-3C- Δ 23 S79。经DNA测序(TAKARA，大连)证明重组质粒中Λ 23 S79 hKGF- I的cDNA序列正确后(附图10B图)，转化大肠杆菌表达宿主菌BL21 Star (DE3) plysS (Novagen),成功构建pET_3C_A 23S79/BL21 Star (DE3)plysS 重组表达工程菌。实施例四缺失型突变体Λ 23和Λ 23 S79 hKGF- I的微生物大規模培养将表达最佳的pET-3C- Δ 23/BL21 Star (DE3) plysS 和 pET_3C_ Δ 23 S79/BL21Star (DE3) plysS重组工程菌划线接种于LA琼脂平板，37°C培养过夜。从过夜培养的LA平板上挑取菌苔接种于含LB液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加水定容至1000ml，121 °C，高压灭菌30min)试管中，37°C培养12小吋，然后按1%的比例转接到含200ml LB培养液的1000ml三角瓶中，37°C培养过夜即成为上罐种子液。将上罐种子液按5%的比例接种于含YT培养液(胰蛋白胨4g/L，酵母提取物3g/L，Na2HPO4 · 12H20 30g/L,KH2P043g/L，NaCl lg/L，MgSO4 · 7H20 lg/L，葡萄糖 8g/L，121°C，高压灭菌 30min)的 30L 发酵罐中，37°C培养，整个发酵过程中，通过调节转速、通空气量、通纯氧量来保持溶氧在30%以上，用28%的氨水调节pH并保持在7. O。至菌液0D_达到10 14时，加入终浓度为O. 2mM的IPTG，继续培养4小时后停止发酵，收集菌液，8000rpm离心10分钟，弃上清，收集菌体放入_20°C冰箱保存备用。实施例五缺失型突变体Λ 23和Λ 23 S79 hKGF- I重组蛋白的分离纯化(I)破菌从_20°C冰箱中取出菌体，放入细菌裂解液(50mM PB, pH 7. O, IOmM EDTA,0. 2g/L溶菌酶)，37°C低速搅拌I小时，冷却后超声(400W，工作时间5s，间歇5s，超声40个循环)，12000rpm离心10分钟,弃沉淀,取上清。
(2)粗纯化将破菌上清用CM-S印harose FF柱层析进行粗纯化。用平衡液(50mM PB,pH 7. O)平衡后，破菌上清上样，复平衡。用含50mM PB的O 500mM的NaCl线性梯度洗脱，收集含目的蛋白的洗脱峰。(3)精纯化将粗纯化收集的目的蛋白洗脱峰，用！feparin CL-6B亲和柱层析进行精纯化。用平衡液(50mM PB, pH 7.0)平衡后，上CM-S印harose FF分离纯化的目的蛋白，用含50mM PB的O IOOOmM的NaCl线性梯度洗脱，收集含目的蛋白的洗脱峰。将纯化后的ニ种重组蛋白经12%的聚丙酰胺凝胶电泳后，考马斯亮蓝显示分子量约为16KD的单一条带，纯度均大于95%，C18柱RP-HPLC检测均为单一色谱峰。纯化制备的Λ 23和Λ 23 S79 hKGF- I重组蛋白经过N端序列分析，其N端15个氨基酸序列均为 Ser-Tyr-Asp-Tyr-Met-Glu-Gly-Gly-Asp-Ile-Arg-Val-Arg-Arg-Leu,与理论序列一致；MALDI-T0F质谱测定的分子量分别为16279. 8和16263. 7，与理论分子量一致。实施例六含Cysl7-Cys83非天然ニ硫键的Λ 23-Μ和Λ 23 S79-M变构体的制备将纯度达95%以上的Λ 23和Λ 23 S79 hKGF- I重组蛋白溶液Ofeparin亲和层析后)，调节PH至10. 5，加入终浓度5mM的DTT，4°C反应2h。再透析过夜(透析液为20mMこ醇胺，ρΗΙΟ. 5)后，补入终浓度O. 2mM的菲洛林铜离子复性液，25°C搅拌反应2h，补入IOmM的EDTA，25°C搅拌反应Ih。复性液经过C18制备型RP-HPLC(流动相A液为5%こ臆、O. 1%三氟こ酸；流动相B液为95%こ腈、O. I %三氟こ酸；洗脱条件为A液从100%至0%，B液从O至100% )，分离除去未形成Cysl7-Cys83 ニ硫键的其它蛋白，得到纯度95%以上的ニ硫键变构体Λ 23-M和Λ 23 S79-M重组蛋白。
实施例七ニ硫键变构体Λ 23 S79-M和Λ 23-Μ的ニ硫键配对分析原理缺失型hKGF- I ニ硫键变构体Λ 23 S79-M蛋白的氨基酸序列中仅含有两个Cys残基(第17位和第83位)，本发明通过特有的ニ硫键配对复性方法，促使第17位与第83位的Cys之间形成ー对非天然ニ硫键，即Cysl7_Cys83 ニ硫键(对应于天然野生型hKGF- I的Cys40_Cysl06 ニ硫键)。为了证明Cysl7_Cys83非天然ニ硫键已正确形成,通过选用专ー性强的胰蛋白酶进行酶切后，再用还原剂(TCEP)进行酶切后肽段的还原处理。采用液质联用的质谱分析还原处理前后的各个肽段的差异，从而确定其中參与ニ硫键形成的肽段以及Cys的配对形式。Λ 23 S79 hKGF_M经胰蛋白酶酶切的理论肽段序列表
权利要求
1.ー种具有新的生物学作用的缺失型人角质细胞生长因子-I ニ硫键变构体，其特征在于含有对应于天然人角质细胞生长因子-I第40位和第106位半胱氨酸间的非天然ニ硫键结构。
2.权利要求I中所述缺失型人角质细胞生长因子-I是指在天然野生型的氨基末端缺失23个氨基酸的缺失突变体，具有Seq ID No 1的氨基酸序列特征。
3.权利要求2中所述缺失突变体，同时包含在SeqID No :I序列的基础上氨基末端增加或减少1-5个氨基酸的类似突变体。
4.权利要求2-3中所述缺失突变体，优选同时包含在SeqID No :1序列的基础上氨基末端增加I个甲硫氨酸(Met)。
5.权利要求2-4中所述缺失突变体，优选SeqID No : I序列中第79位(对应于天然人角质细胞生长因子-I的第102位)的半胱氨酸(Cys)突变为非极性氨基酸的突变体。
6.权利要求5中所述非极性氨基酸,主要指Ser、Ala、Gly、Thr>Leu或He。
7.权利要求5-6中所述非极性氨基酸，优选Ser，具有SeqID No 2的氨基酸序列特征。
8.权利要求1-7中所述新型人角质细胞生长因子-I缺失型突变体适用重组DNA技术制备而成。
9.权利要求8中所述重组DNA技术适用原核和真核表达系统，其中的原核表达系统可以是大肠杆菌，真核表达系统可以是酵母和哺乳动物细胞。
10.权利要求I中所述缺失型人角质细胞生长因子-I的ニ硫键变构体是含一对非天然ニ硫键的重组人角质细胞生长因子-I变构体。
11.权利要求10中所述ニ硫键变构体，通过特有的ニ硫键配对复性方法而实现，其主要步骤为 ①在碱性条件下用还原剂处理，使缺失型突变体第17位和第83位的Cys的巯基(-SH)均处于游离状态； ②在碱性条件下经菲洛林和铜离子配对复性，促进形成第17位和第83位Cys间非天然_■硫键； ③采用色谱层析手段，从复性样品中分离并得到具有第17位和第83位Cys间非天然ニ硫键的变构体重组蛋白。
12.权利要求I中所述新的生物学作用是指缺失型突变体第17位和第83位Cys间形成非天然ニ硫键后，变构体分子构象发生显著变化，除保留原有促上皮细胞増殖的生物学活性外，还出现了新的生物学作用。
13.权利要求I和12中所述新的生物学作用包含抑制纤维增生和抑制新生血管生长。
14.权利要求13中所述新的抑制纤维增生的生物学作用适用于预防和治疗纤维化增生性疾病，包含但不限于慢性肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化、角膜纤维化和皮肤纤维化。
15.权利要求13中所述新的抑制新生血管生长的生物学作用适用于预防和治疗血管增生性疾病，包含但不限于视网膜黄斑、新生血管瘤以及肿瘤的血管增生。
16.权利要求14-15中的特征是含缺失型人角质生长因子-Iニ硫键变构体重组蛋白的药物组合，该药物组合为在有效剂量下制备而成的药物制剂。
17.权利要求16中所述药物制剂主要指液体水针、冻干粉针、缓控释剂、滴眼药剂、透皮制剂、粘膜喷剂、外用药剂以及 脂质体药剂。
全文摘要
本发明涉及一种缺失型人角质细胞生长因子-Ⅰ二硫键变构体及其制备和应用，其特征为该二硫键变构体含有对应于天然人角质细胞生长因子-Ⅰ第40位和第106位半胱氨酸间的非天然二硫键结构。本发明利用基因工程技术制备获得重组人角质细胞生长因子-Ⅰ缺失型突变体后，通过特有的二硫键配对复性方法促使形成缺失型突变体第17位和第83位半胱氨酸间的非天然二硫键。该二硫键变构体具有抑制纤维增生、抑制新生血管生长的生物学作用，临床上有望开发成预防和治疗纤维化增生性疾病和血管增生性疾病的药物。
文档编号C07K14/475GK102675449SQ20111006381
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者万颖, 何建军, 张增涛, 李祥, 范开, 谢敏, 陈勇 申请人:重庆富进生物医药有限公司