抗乙型肝炎病毒x蛋白多肽药物的制作方法

专利名称：抗乙型肝炎病毒x蛋白多肽药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及多肽药物领域，具体涉及抗乙型肝炎病毒X蛋白的多肽和编码此多肽的多核苷酸，以及它们的应用。
背景技术：
肝癌是导致病人死亡的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，在我国肝癌死亡率仅次于胃癌，居我国恶性肿瘤死亡率第二位。据统计，我国每年新增肝癌人数30万人，而每年肝癌死亡人数达11万。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染可导致肝炎、肝硬变和原发性肝癌的发生，在我国80%以上的肝癌患者为乙肝感染后肝癌，可称之为乙肝后肝癌。HBV为长约3. 2Kb的DNA病毒，其开放阅读框表达乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)、乙型肝炎病毒多聚酶和乙型肝炎病毒X抗原(HBxAg)(或称之为乙型肝炎病毒X蛋白，即HBx)，其中HBx是HBV DNA复制所必须的因子。由于HBx是HBV DNA复制所必须的因子，因此抑制HBx的功能，意味着可抑制HBV的感染，以及由此导致的肝炎和肝硬变。另外，HBx作为反式作用因子，促进肝癌的生长和增殖，称之为癌蛋白。在分子水平、细胞水平和动物水平的研究也发现，HBx具有很强的促肝癌细胞增殖和迁移的作用。转基因鼠实验也证明HBx具有显著的促进肝癌发生的作用。大量研究结果显示，HBV感染的持续存在可导致慢性肝病，包括慢性肝炎、慢性肝炎反复发作引起的肝组织中纤维结缔组织增生后发生的肝硬变，及大部分在肝硬变基础上发生的肝癌。在慢性肝病(包括肝炎、肝硬变和肝癌)的发生发展过程中，HBx发挥了重要的作用。因此，HBx是预防和治疗肝病的重要靶点。目前，肝癌的治疗以手术为主，辅以介入疗法，而化疗效果不理想。在临床手术的肝癌组织中HBsAg和HBxAg的表达阳性检出率高达80%甚至90%以上。因此，HBx作为肝癌发生发展的重要致病因子，而发现其特异性抑制剂，则具有重要的理论意义和实际临床应用价值。然而，由于目前HBx的三维构象解析尚未完成，故难以通过HBx立体三维构象设计其化学抑制剂。 多肽片段可作为药物,其在临床上已广为应用。例如，胸腺肽(thymopeptide)是从小牛胸腺中提取的胸腺五肽，具有促进淋巴细胞转化、增强巨噬细胞吞噬活性的作用，可用于治疗多种免疫缺陷病。多肽药物的特点是药理作用明确，安全性高，并易于生产。但是，多肽药物的发现难度大，其原因在于大部分的多肽片段在体内的半衰期短，直接影响药效学作用。

发明内容
本发明涉及一种具有抑制乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)功能活性的多肽，其在分子水平、细胞水平和动物水平上具有抑制HBx的活性，因而能抑制乙型肝炎病毒感染所造成的肝炎，由肝炎反复发作引起的肝硬变，以及在肝硬变基础上发生的肝癌。该多肽和它的肽模拟物，包括它们的功能片段和功能变体，以及编码这些多肽、肽模拟物或它们的功能片段、功能变体的基因，可广泛用于防治乙型肝炎感染后的肝病，包括肝炎、肝硬变和肝癌。一方面，本发明提供了分离的多肽或肽模拟物，其包含如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列、或其功能片段或功能变体，所述多肽或肽模拟物具有抑制乙型肝炎病毒X蛋白的功能，并能抑制乙型肝炎病毒感染后的慢性肝病的发生和发展。所述乙肝病毒感染后的慢性肝病可以包括肝炎，由肝炎反复发作引起的肝硬变，以及在肝硬变基础上发生的肝癌。在本发明的一些具体实施例中，上述多肽或肽模拟物，其包含的氨基酸序列、其功能片段或功能变体可以具有与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列至少70%，或者80%，或者90%，以及甚至更高的相同性。优选地，这些多肽或肽模拟物包含如SEQ ID NOs :1-6中所示的任一种氨基酸序列。另一方面，本发明提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码如SEQ ID N0:1所 示的氨基酸序列、其功能片段或功能变体的多核苷酸；或者是与包含编码如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列、其功能片段或功能变体的多核苷酸互补或严格杂交的多核苷酸。优选地，这些多核苷酸为编码SEQ ID NOs :1-6所示的氨基酸序列的多核苷酸，或者为与编码SEQID NOs :1-6所示的氨基酸序列的多核苷酸互补或严格杂交的多核苷酸。另一方面，本发明还提供含有外源多核苷酸的重组表达载体，其包含编码如SEQID NO :I所示的氨基酸序列、其功能片段或功能变体的多核苷酸；或者是与包含编码如SEQID NO 1所示的氨基酸序列、其功能片段或功能变体的多核苷酸互补或严格杂交的多核苷酸。优选地，这些重组表达载体权利包含编码SEQ ID NOs :1-6所示的氨基酸序列的多核苷酸，或者包含与编码SEQ ID NOs :1-6所示的氨基酸序列的多核苷酸互补或严格杂交的多核苷酸。本方明还提供包括上述重组表达载体的宿主细胞。此外，本发明也提供包括上述多肽或肽模拟物、核苷酸以及重组表达载体在制造抗乙肝病毒感染后的慢性肝病的药物中的应用。在一个具体实施例中，所述药物可为乙肝的治疗性疫苗。所述药物可以包含药物组合物，其可以包含任选的药物载体。本发明中，所述的多肽(包括其功能片段或变体)及其肽模拟物，作为HBx的有效抑制因子，具有抑制HBx的生物活性的能力，能抑制乙型肝炎病毒感染所造成的肝炎，由此引发的肝硬变和在肝硬变基础上发生的肝癌。值得强调的是，本发明提供的上述多肽具有明显的药效学作用，因此可以成为治疗由于乙肝病毒感染所导致的肝病的有效药物。


图I :应用高压液相色谱(HPLC)对纯化后人工合成多肽Anti_HBxP2#的分析结
果O图2.应用报告基因检测本发明的多肽基因质粒对表达HBx蛋白的肝癌细胞的影响。结果显示，p-Anti-HBxP2#对H印G2-X细胞、L-02-X细胞和H印G2. 2. 15细胞中NF-B启动子的活性具有抑制作用，呈剂量依赖性，而对无HBx的HepG2肝癌细胞和无HBx的L-02肝细胞无影响。相似地，p-Anti-HBxP2#的5种功能变体基因(O. 15μ g/well)对H印G2_X细胞和L-02-X细胞中NF-B启动子的活性具有一定的抑制作用。
< O. 05广P < O. 01，进行Student’ s t test统计学分析。
图3.检测本发明的多肽在细胞水平对表达的HBx蛋白激活NF-B启动子的活性的影响。结果显示，人工合成的多肽Anti-HBxP2#对表达HBx蛋白的H印G2-X细胞、L-02-X细胞和H印G2. 2. 15细胞中的NF-B启动子的活性具有抑制作用，且该抑制作用呈剂量依赖性，但对无HBx表达的!fepG2肝癌细胞和L-02肝细胞则无此影响。乍< O. 05，**P < O. 01，进行Student’ s t test统计学分析。图4.应用MTT检测转染本发明的多肽基因质粒对表达HBx蛋白的肝癌细胞的影响。结果显示，p-Anti-HBxP2#对!fepG2-X细胞、L-02-X细胞和H印G2. 2. 15细胞生长和增殖具有抑制作用，且其效果呈剂量依赖性，但对无HBx表达的H印G2肝癌细胞和L-02肝细胞则无影响。p-Anti-HBxP2#的5种功能变体基因(O. 15 μ g/well)对H印G2-X细胞和L-02-X细胞的生长和增殖也具有抑制作用。p-Anti-HBxP2#后*P < O. 05，**P < O. 01，进行Student’ s t test统计学分析。图5.应用MTT检测本发明的多肽对肝癌细胞的生长的影响。结果显示，应用人工合成的多肽Anti-HBxP2#对H印G2-X细胞、L-02-X细胞和H印G2. 2. 15细胞生长和增殖具 有抑制作用，且其作用呈剂量依赖性。而对无HBx表达的H印G2肝癌细胞和L-02肝细胞无影响。< O. 05，**P < O. 01，进行 Student’ s t test 统计学分析。图6 :人工合成的多肽Anti_HBxP2#对H印G2-X细胞的作用。裸鼠接种实验结果显示，应用人工合成的多肽Anti-HBxP2#对H印G2-X细胞生长和增殖具有明显的抑制作用。**P < O. 01, Student’ s t test 统计学分析图7.人工合成的多肽Anti-HBxP2#对H印G2. 2. 15细胞的作用。裸鼠接种实验结果显示，应用人工合成的多肽Anti-HBxP2#对H印G2. 2. 15细胞生长和增殖具有明显的抑制作用。"wP < O. 01, Student’ s t test 统计学分析
图8.构建多肽真核表达载体的连接示意图。
具体实施例方式本发明中，包括说明书和权利要求书，使用的下列术语除非特别说明，具有如下的含义“分离的” 一词是指将物质从它原始的环境(例如，若是自然产生的就指其天然环境)分离出来。比如说，一个自然产生的多核苷酸或多肽存在于活动物中就是没有被分离出来，而同样的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系统中与之共存的物质分开就是分离的。这样的多核苷酸或多肽可以是某一载体的一部分，也可以是某一组合物的一部分。既然载体和组合物不是它的天然环境的成分，它们仍然是分离的。“纯化的”一词意指已经在纯度上提高的。“纯度”在这是相对术语，并不必要地解释为绝对纯度。例如，纯度可以是至少约50%，或可以是大于60%、70%、80%、90%、或可以是100%。如本发明中所用，分离的物质是从其原始环境中分离出来。活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离的，但同样的多核苷酸和多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离的，同时纯度上得到了提高，也因此是纯化的。“核酸”、“核酸序列”或“碱基序列”是指核苷酸，寡核苷酸或多核苷酸及其片段或部分。本发明的核酸能够以RNA (例如，mRNA)的形态、或DNA的形态(例如，cDNA或基因组DNA)存在。DNA可以是双链，也可以是单链。单链DNA或RNA可以是编码链(有义链)、或非编码链(反义链)中任一种。另外，本发明的多核苷酸也可以在其5’端或3’端融合编码标签标记(标签序列或标记物序列)的多核苷酸。它们可以是合成的或是从天然来源获得的(例如，分离和/或纯化)，其可以包含天然的、非天然的或者修饰过的核苷酸，并且其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸之间的键，诸如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键，用来代替在未修饰的寡核苷酸中核苷酸之间存在的磷酸二酯键。所谓“氨基酸序列”或“多肽”是指肽、寡肽、多肽或蛋白质及其部分片段，其间以肽键相连接的氨基酸。当本发明中的“氨基酸序列”涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，这种“多肽”或“蛋白质”并不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸序列。本发明的氨基酸序列可以含有附加的肽。作为附加的肽，如多组氨酸标签(His-tag)、或Myc、FLAG等表位标记的肽为例。“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或多个氨基酸或核苷酸的缺失。“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与天然存在或改 变前的分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。“置换”是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。“缺失、置换或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”则是指，利用定位诱变法等公知的突变核酸或多肽的制作法缺失、置换或添加能够缺失、置换或添加的程度的数目的氨基酸或核苷酸。上述突变不限于利用已知的定点突变法而人为诱导的突变，也可以是对天然存在的核酸或蛋白质的突变进行分离纯化而得到的。对氨基酸的突变可以包含有一个或多个氨基酸残基为构象为D-型的氨基酸，自然界存在的稀有氨基酸或人工修饰的氨基酸，这些氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的。与此相类似的，诱导核酸发生突变，可以包括自然界天然存在的核苷酸，也可以包括具有修饰的核苷酸。多肽的“功能片段”是指本发明的多肽的任何部分，所述部分保留其作为一部分的多肽(即“亲本”多肽)的基本相似或相同的生物学活性和功能。多肽的“功能变体”是指基本上保持如所述多肽或氨基酸序列相同或相似的生物学功能或活性的氨基酸序列，它们可以包括，例如，D原氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基有缺失和/或一个或多个氨基酸残基被添加；或者2)原氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基取代；或者3)原氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；或者4)原氨基酸序列和另外的分子或化合物(比如糖、脂类、聚乙二醇等)的融合；或者5)原有的氨基酸序列与添加的氨基酸序列融合进而形成的多肽序列(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列等)；或者6)原氨基酸序列的逆反类似物；或者7)以上各种情况的混合。本发明中，氨基酸序列的功能变体，可以包含有一个或多个氨基酸残基为构象为D-型的氨基酸，自然界存在的稀有氨基酸或人工修饰的氨基酸，这些氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的。多肽的“逆反类似物”是指包括反转的亲本多肽氨基酸序列的多肽，以致所述逆反类似物的氨基酸序列(当从N端向C端读取时)与当从C端向N端读取时的亲本多肽的氨基酸序列相同；此外，逆反类似物中每一个氨基酸是该氨基酸的D异构体，D异构体与L异构体相反。例如，三肽Val-Ala-Gly的逆反类似物具有氨基酸序列Gly-Ala-Val，其中每个氨基酸是D异构体。本发明中，“肽模拟物”是指具有与相对应多肽基本相同的通用结构且具有，例如，能增加其稳定性或生物学功能的修饰的化合物。肽模拟物包括，例如，包含与相对应多肽的相同氨基酸序列的那些化合物，但在其中两个或更多个氨基酸之间，肽模拟物具有改变的主链。所述肽模拟物可以包括合成的或非天然存在的氨基酸来代替天然存在的氨基酸。本发明中，核苷酸序列的“简并变异体”是这样的多核苷酸序列，其与亲本核苷酸序列有区别，但编码的蛋白质和多肽和亲本核苷酸序列所编码的蛋白质或多肽一样。“核酸杂交”在本领域已公知(参见,例如，Sambrook等，Molecular Cloning ALaboratory Manual, 3rd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, 2001)。通常，温度越高，盐浓度越低，则严谨性变得越高(难以杂交)，从而能够取得更加相同的多核苷酸。适合的杂交温度根据碱基序列或其碱基序列的长度而异。另外，本发明还涉及在“严格条件”下杂交。本发明中，“严格条件”是指，在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，例如，42°C的条件下、在(50%甲酰胺、5 X SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM的磷酸钠(pH7. 6)、 5XDenhardt溶液、10%硫酸葡聚糖、和20 μ g/ml的变性剪切鲑鱼精子DNA)中孵育过夜，然后在65 °C条件下用O. IXSSC洗脱。“同源性”是指互补的程度，可以是部分同源，也可以是完全同源。“部分同源”是指一种部分互补的序列，其可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交。这种抑制可通过在严格性程度降低的条件下进行杂交(Southern印迹或Northern印迹等)来检测。基本同源的序列或杂交探针可竞争和抑制完全互补的序列与靶序列在严格性程度降低的条件下的结合。当然，严格性降低的条件并非允许非特异性的结合，两条序列相互结合，仍然需要特异性或选择性的相互作用。氨基酸序列或核苷酸序列的“相同性”或“同一性”百分率是指在两种或多种氨基酸或核苷酸序列比较中，序列相同或相似的百分率。有很多本领域技术人员熟知的方法测定相同性百分率，如通过 MEGALIGN 程序(Lasergene software package, DNASTA, Inc.,Madison, WI)。MEGALIGN程序可根据不同的方法如Cluster法比较两种或多种序列(参见Higgins & Sharp7Gene 73 :237_244，(1988))，Gluster法通过检查所有配对之间的距离将各组序列排列成簇，然后将簇以成对或成组分配。两个氨基酸序列如序列A和序列B之间的相同性百分率可以通过下式计算[(序列A与序列B之间匹配的残基个数)/(序列A的残基数-序列A中间隔残基数-序列B中间隔残基数)]X 100%同理，也可以通过Cluster法或用本领域已知的方法，如Jotun Hein的方法(参见Hein J. , Methods in Emzumology 183 :625-645,1990),测定核酸序列的相同性百分率。“重组表达载体”是指遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸重组体，该重组体克隆有编码mRNA、蛋白、多肽、或肽的核苷酸序列，当该表达载体进入宿主细胞后可表达相应的mRNA、蛋白、多肽、或肽。本发明中，重组表达载体可以包含任意类型的核苷酸序列，但不仅限于是DNA或RNA，可为单链或双链、人工合成或来自天然，也可为非天然的或改变的核苷酸。核苷酸之间的键可以是天然存在的、也可以是非天然存在的或修饰的。本发明中，“乙肝病毒感染后的慢性肝病”是指乙型肝炎病毒感染后导致的肝病，包括慢性肝炎、慢性肝炎反复发作引起的肝组织中纤维结缔组织增生后发生的肝硬变，及大部分在肝硬变基础上发生的肝癌。肝癌的发生是乙型肝炎病毒持续感染的结果，这种肝癌可称之为乙肝后肝癌。
本发明中，“治疗”和“预防”以及由它们派生的词语，但并不意味是100%的或完全的治疗或预防，可以认定为本领域技术人员所认同的治疗或预防程度。本发明中的“预防”可理解为延迟疾病、或其症状或病症的发作。多肽本发明提供分离或纯化的多肽。本发明涉及的多肽可以是包含、基本由、或由氨基酸序列 Pro-Asp-Leu-His-Lys-Asn-Glu-Leu-Lys-His-Val-Lys-Tyr (SEQ ID NO 1)所组成的多肽。研究证实这些多肽可以明显抑制HBx的活性，具有明显抑制乙肝病毒感染后的慢性肝病的发生和发展的作用，更重要的是，这些多肽可以抑制感染有乙肝病毒的肝癌细胞的生长和增殖。所述抑制在分子水平、细胞水平和动物水平均有体现。如，所述多肽在分子水平上可以抑制由HBx激活的核因子B(NF-B)的启动子活性，从而体现所述多肽对HBx的有效抑制，且其抑制效果呈量效关系；所述多肽在细胞水平也体现出对含HBx基因的肝癌细胞的 生长和增殖功能的有效抑制，且其抑制效果也呈量效关系；通过裸鼠接种方法显示，所述多肽在动物水平能有效抑制表达HBx的肝癌细胞的成瘤能力。然而，所述多肽对无表达HBx肝癌细胞中NF-B的启动子活性无影响，对无表达HBx肝癌细胞的生长和增殖也无影响。本发明还提供所述本发明多肽的各种功能片段。所述功能片段可以为本发明的多肽的连续氨基酸序列的任何片段，条件是其与亲本多肽相比，能以相似程度、相同程度、或更高程度保留亲本多肽的生物活性，例如，抑制HBx的活性。参照亲本多肽，所述功能片段可以包括，例如，亲本多肽的约 10 % ,20 % ,30 % ,40 % ,50 % ,60 % ,70 % ,80 % ,90 % ,95 %,100%,105%,110%,120%,150%,200%或更高的活性。所述功能片段还可以在上述连续氨基酸序列片段的氨基或羧基端、或其氨基以及羧基两端，包含额外的氨基酸，例如，与亲本多肽的氨基酸序列中不同的氨基酸。如果所述额外的氨基酸不妨碍所述功能片段的生物学功能是理想的，例如，抑制HBx的活性，并有效地抑制癌细胞，优选是肝癌细胞，尤其是感染有乙肝病毒的肝癌细胞的生长和增殖。更为理想的是，当与所述亲本多肽的生物学活性相比较时，所述额外的氨基酸能够导致增强的生物学活性。本发明的多肽的功能片段包括与所述亲本多肽具有至少70%的序列同一性的氨基酸序列为优选序列。在一个具体的实施例中，本发明的功能片段包括在所述亲本多肽的N端和/或C端添加氨基酸，例如一个或两个氨基酸。另外，本发明的多肽及其功能片段的功能变体也包括在本发明范围之内。所述本发明的多肽及其功能片段的功能变体保留与所述亲本多肽或亲本功能片段基本相似或相同的生物活性，例如，抑制HBx的活性，以及有效地抑制肝癌细胞，尤其是感染有乙肝病毒的肝癌细胞的生长和增殖。参照所述亲本多肽或亲本功能片段，所述功能变体可以与所述亲本多肽或亲本功能片段的氨基酸序列至少有约50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或100%的同一性。优选地，本发明的多肽及其功能片段的功能变体包含，与所述亲本多肽或亲本功能片段具有至少70%的序列同一性。更优选的，本发明的多肽及其功能片段的功能变体包含与所述亲本多肽或亲本功能片段只有1-3个氨基酸的区别。最优选地，本发明的多肽及其功能片段的功能变体包含与所述亲本多肽或亲本功能片段只有I个氨基酸的区别。所述本发明的多肽及其功能片段的功能变体可以包括，例如，包含具有至少一个保守氨基酸置换的亲本多肽或亲本功能片段氨基酸序列。具体来说，所述本发明的多肽及其功能片段的功能变体可以包含具有2个、3个、4个、5个、或更多个保守氨基酸置换的亲本多肽或亲本功能片段的氨基酸序列。另外，所述本发明的多肽及其功能片段的功能变体也可以包括具有至少一个非保守氨基酸置换的亲本多肽或亲本功能片段的氨基酸序列。具体来说，可以包括具有2个、3个、4个、5个、或更多个非保守氨基酸置换的亲本多肽或亲本功能片段的氨基酸序列。在这些情形中，对于所述的氨基酸置换，优选的是不妨碍或抑制所述功能变体的生物学功能或活性。更优选地，所述氨基酸置换提高本发明的多肽及其功能片段的功能变体的生物学功能或活性，以致当与所述亲本多肽或亲本功能片段相比较时，所述功能变体的生物学功能或活性提高。优选地，本发明的多肽及其功能片段的功能变体包括一个或多个保守氨基酸置换。在本领域内，保守氨基酸置换是公知的，它指的是这样的氨基酸置换，即，其中一个具有某种物理和/或化学特性的氨基酸被换为另一个具有相同化学或物理特性的氨基酸。本领域技术人员了解，保守性的氨基酸置换可以不造成蛋白质的结构或功能的显著改变。典型 的保守性置换包括，例如，用酸性氨基酸置换另一个酸性氨基酸(例如，AsP或Glu)，用具有非极性侧链的氨基酸置换另一个具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala，Gly, Val, He, Leu,Met, Phe, Pro, Trp，Val，等)，用碱性氨基酸置换另一个碱性氨基酸(Lys，Arg,等)，用具有极性侧链的氨基酸置换另一个具有极性侧链的氨基酸(Asn, Cys, Gin, Ser, Thr, Tyr,等),用芳香氨基酸(Trp，Phe，Tyr，等)置换另一个芳香氨基酸，等。另外，本发明的多肽及其功能片段的功能变体还可以包括本发明的任意多肽或功能片段的逆反类似物。本发明中，“逆反类似物”是指包括反转的亲本多肽氨基酸序列的多肽，以致所述逆反类似物的氨基酸序列(当从N端向C端读取时)与当从C端向N端读取时的亲本多肽的氨基酸序列相同。此外，关于逆反类似物，每一个氨基酸是该氨基酸的D异构体，D异构体与L异构体相反。例如，三肽Val-Ala-Gly的逆反类似物具有氨基酸序列Gly-Ala-Val，其中每个氨基酸是D异构体。本发明中，所述功能变体优选包括SEQ ID NOI的逆反类似物。本发明的多肽(包括功能片段)及其功能变体可以是任意长度的，即，可以包括任意数目的氨基酸，条件是所述多肽(包括功能片段)及其功能变体保留必要的生物学活性，例如，抑制HBx的活性，以及有效地抑制癌细胞，优选是肝癌细胞，尤其是感染有乙肝病毒的肝癌细胞。举例来说，本发明的多肽(包括功能片段和功能变体)可以是4-2000个氨基酸长，如长度为 5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，18，20，25，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，175，200，300，400，500，700，800，1000 或更多。优选地，本发明的多肽长度为6-20个氨基酸，并满足作为多肽药物的药效学和半衰期的要求。在一个实施例中，本发明的多肽及其功能片段的功能变体与亲本多肽SEQ ID NO:I具有一个氨基酸的差别，其具有与亲本多肽SEQ ID NO 1相似的生物学活性和功能，例如，抑制HBx的活性，以及有效地抑制癌细胞，优选是肝癌细胞，尤其是表达HBx的肝癌细胞。更具体地，本发明的多肽及其功能片段的功能变体包括SEQ ID NOs 2-60本发明还提供所述多肽(包括功能片段和功能变体)的肽模拟物。在一个优选的实施方案中，所述肽模拟物是拟肽。拟肽是指这样的肽模拟物，其中每个氨基酸的侧链粘附在氨基酸的氮原子上而不是α碳上。例如，拟肽可以被视为N-置换的甘氨酸，其具有NRCH2CO通用结构的重复单位，并且其具有与相对应的多肽相同或基本相同的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，所述肽模拟物包括改变的主链，其中在每个氨基酸之间的键是甲基化的。在这一点上，所述肽模拟物可以包括下述结构的甲基化肽主链
权利要求
1.分离的多肽或肽模拟物，其包含如SEQID NO :1所示的氨基酸序列、或其功能片段或功能变体，所述多肽或肽模拟物具有抑制こ型肝炎病毒X蛋白的功能，井能抑制こ型肝炎病毒感染后的慢性肝病的发生和发展。
2.权利要求I所述的多肽或肽模拟物，所述こ肝病毒感染后的慢性肝病包括肝炎、肝硬变和肝癌。
3.权利要求I所述的多肽或肽模拟物，其包含的氨基酸序列、其功能片段或功能变体具有与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列至少70%的相同性。
4.权利要求I所述的多肽或肽模拟物，其包含的氨基酸序列、其功能片段或功能变体具有与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列至少80%的相同性。
5.权利要求I所述的多肽或肽模拟物，其包含的氨基酸序列、其功能片段或功能变体具有与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列至少90%的相同性。
6.权利要求I所述的多肽或肽模拟物，其包含如SEQID NOs :1_6中所不的任ー种氨基酸序列。
7.分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自下组中的ー种 a)编码SEQID NO :1所示的氨基酸序列、其功能片段或功能变体的多核苷酸；或者 b)与多核苷酸a)互补或严格杂交的多核苷酸。
8.权利要求7的多核苷酸,所述多核苷酸包含选自下组中的ー种 a)编码SEQID NOs :1_6所示的任一种氨基酸序列的多核苷酸；或者 b)与多核苷酸a)互补或严格杂交的多核苷酸。
9.重组表达载体,其包含权利要求7或8所述的多核苷酸。
10.包括如权利要求9所述的重组表达载体的宿主细胞。
11.权利要求1-6中任一所述多肽在制造抗こ肝病毒感染后的慢性肝病的药物中的应用。
12.权利要求7-8中任一所述核苷酸在制造抗こ肝病毒感染后的慢性肝病的药物中的应用。
13.权利要求9中所述重组表达载体在制造抗こ肝病毒感染后的慢性肝病的药物中的应用。
14.权利要求11-13中的任ー种应用，所述应用为制造抗こ型肝炎的治疗性疫苗。
15.药物组合物，其包含权利要求1-6中任一所述的多肽或肽模拟物，以及任选的药物载体。
16.药物组合物，其包含权利要求7-8中任一所述的多核苷酸，以及任选的药物载体。
17.药物组合物，其包含权利要求9中所述的重组表达载体，以及任选的药物载体。
全文摘要
本发明涉及多肽药物领域，具体涉及抗乙型肝炎病毒X蛋白的多肽和编码此多肽的多核苷酸，以及它们的应用。具体来说，本发明涉及一种具有抑制乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)功能活性的多肽，其在分子水平、细胞水平和动物水平上具有抑制HBx的活性，因而能抑制乙型肝炎病毒感染所造成的肝炎，由肝炎反复发作引起的肝硬变，以及在肝硬变基础上发生的肝癌。该多肽和它的肽模拟物，包括它们的功能片段和功能变体，以及编码这些多肽、肽模拟物或它们的功能片段、功能变体的基因，可广泛用于防治乙型肝炎感染后的肝病，包括肝炎、肝硬变和肝癌。
文档编号C07K7/08GK102675423SQ20111006185
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月15日 优先权日2011年3月15日
发明者叶丽虹, 张晓东 申请人:天津托普泰克生物科技有限公司