值至5-8，无菌滤过，滤液分装于灭菌西林瓶 中，冷冻干燥，制备成冻干粉针制剂1000瓶，每瓶规格：70 μ g。
[0027] 本发明又一目的还提供了本发明所述的眼镜蛇毒神经毒素及其制剂，主要用于治 疗各种慢性疼痛、血管性头痛、三叉神经痛、坐骨神经痛、晚期癌疼痛、关节痛及麻风反应神 经痛。
[0028] 为了使本领域普通技术人员更好的理解本发明，本申请人进行了一系列实验研 究，以证明本发明的效果： 实验1工艺研究 本发明人为了探索出一种便捷、快速的眼镜蛇毒神经毒素的分离提取工艺，进行了大 量的筛选试验，最终发现用Sephadex G-50柱分子筛加 CM-32柱阳离子交换层析的技术方 案，工艺简单、操作方便，比我公司传统的提取工艺缩短了近60%的洗脱时间，大大缩短了 生产周期。为进一步优化本技术方案，本发明人又进行大量的工艺研究，发现影响本发明提 取物质量的关键因素主要有洗脱液的浓度、pH值、洗脱流速等，本发明人对提取工艺进行了 参数的设计和选择，最终以提取物的性状、水分、有效成分含量、纯度和收率以及生产周期 为考察指标进行考察。
[0029] 1. 1磷酸缓冲液pH值的选择： 药物1 :按照本发明实施例1的方法制备； 药物2 :按照本发明实施例1的方法制备，将各步骤pH8. 0的磷酸缓冲溶液换成pH7. 9 的缓冲溶液。
[0030] 药物3 :按照本发明实施例1的方法制备，将各步骤pH8. 0的磷酸缓冲溶液换成 pH8. 1的缓冲溶液。
[0031] 药物4 :按照本发明实施例1的方法制备，将各步骤pH8. 0的磷酸缓冲溶液换成 PH7. 8的缓冲溶液。（pH较低的磷酸缓冲液） 药物5 :按照本发明实施例1的方法制备，将各步骤pH8. 0的磷酸缓冲溶液换成pH8. 2 的缓冲溶液。（pH较高的磷酸缓冲液） 试验结果： 表1磷酸缓冲液pH值对提取工艺的影响_
_结果表明：本发明工艺洗脱液：磷酸缓冲液pH值对提取物质量的影响较为敏感(药物 4和药物5质量、收率均不理想)，因此，为确保本发明工艺的稳定性，优选本发明洗脱液为： pH7. 9-8. 1磷酸缓冲液。
[0032] 1. 2 Sephadex G-50柱洗脱流速的选择： 药物1 :按照本发明实施例1的方法制备； 药物2 :按照本发明实施例1的方法制备，将步骤4的流速40ml/h，换成30ml/h。
[0033] 药物3 :按照本发明实施例1的方法制备，将步骤4的流速40ml/h，换成50ml/h。
[0034] 药物4 :按照本发明实施例1的方法制备，将步骤4的流速40ml/h，换成25ml/h。
[0035] 药物5 :按照本发明实施例1的方法制备，将步骤4的流速40ml/h，换成55ml/h。
[0036] 试验结果： 表2 S印hadex G-50柱洗脱流速考察
结呆衣明：? S印hadex G-b(J枉沉貺mm^brnl/h时，提斗乂约物4的质重个埋，而且洗脱 速度较慢；洗脱流速调为55ml/h时，虽然洗脱速度很快，但是提取药物5的质量也不理想， 因此，为确保提取药物质量安全，根据筛选结果确定本发明Sephadex G-50柱洗脱流速优选 30-50ml/h。
[0037] 1. 3 CM-32柱洗脱流速选择： 药物1 :按照本发明实施例1的方法制备； 药物2 :按照本发明实施例1的方法制备，将步骤6的流速60ml/h，换成50ml/h。
[0038] 药物3 :按照本发明实施例1的方法制备，将步骤6的流速60ml/h，换成70ml/h。
[0039] 药物4 :按照本发明实施例1的方法制备，将步骤6的流速60ml/h，换成25ml/h。
[0040] 药物5 :按照本发明实施例1的方法制备，将步骤4的流速40ml/h，换成55ml/h。
[0041] 试验结果： 表3 :CM-32柱洗脱流速考察 结呆衣明：刍（JM-犯枉沉貺mm 4bml/h
时，提斗乂约物4的质重个埋，而沉貺速度 较慢；洗脱流速调为75ml/h时，虽然洗脱速度很快，但是提取药物5的质量也不理想，因 此，为确保提取药物质量安全，根据筛选结果确定本发明Sephadex G-50柱洗脱流速优选 30-50ml/h。
[0042] L 4 CM-32柱洗脱方式的选择： 药物1 :按照本发明实施例1的方法制备； 药物2 :按照本发明实施例1的方法制备：将步骤6洗脱方式改为：收集的E峰上平衡 后的CM-32柱，用含0. 10M氯化钠磷酸缓冲液洗脱，流速为60ml/h，24小时后开始检测收 集目的峰。收集的目的峰进行冷冻干燥，即得科博肽。
[0043] 药物3 :按照本发明实施例1的方法制备；将步骤6洗脱方式改成为：收集的E峰 上平衡后的CM-32柱，0. 01M磷酸缓冲液洗脱16h后，换含0. 08M氯化钠的磷酸缓冲液洗脱， 流速60ml/h，24小时后开始检测收集目的峰。收集的目的峰进行冷冻干燥，即得科博肽。
[0044] 试验结果： 表4: CM-32柱洗脱方式考察：
结果表明：本发明提取工艺步骤6采用制得药物2、3的洗脱方式，提取药物纯度低，达 不到要求；因此，本发明步骤6优选制得药物1的洗脱方式。
[0045] 1. 5本发明工艺的综合评价： 为了考察本发明提取工艺的有益效果，本发明人以提取物的性状、水分、有效成分含 量、纯度以及纯神经毒素收率（l〇〇g蛇毒中纯神经毒素重量）为考察指标，进行了一系列的 考察试验。
[0046] 药物A :按照中国专利申请"一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神 经毒性的方法" CN101845089A (公开日期2010年9月29日）中实施例的方法制备； 药物B:按照中国专利申请"博肽的提取方法、由该方法提取得到的科博肽以及包含该 科博肽的制剂" CN101381408A (开公告：2009. 03. 11 )中的实施例的方法制备； 药物C :按照文献"浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素的分离纯化及其镇痛作用研究"（李范 珠等，中国药师，2004年09期，P659~661)中公开的浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素的分离纯 化方法制备； 药物D:本发明实施例1的方法制备； 上述方法制得的药物A-D进行质量考察： 表5 :提取药物质量考察评价:_
上表数据表明，按照上述方法提取的眼镜蛇毒神经毒素性状一致，均为白色粉末，水分 均未超过5. 0%，满足法定标准的要求。而本发明方法制得药物D，在有效成分含量、收率、纯 度等制备均较其他制备方法制得的药物优，提取的药物品质更好；并且本发明提取工艺简 单、在生产过程中，易于操作，质量较好控制，整个生产周期较其他提取工艺大大缩短了生 产周期。
[0047] 实验例3、急性毒性试验 4. 1动物及药物 动物：小白鼠，云南省动物研究所提供，体重18-20克。
[0048] 药物：按照实施例6、7的方法分别制备得到注射液、冻干粉针剂，规格： 2ml:70 μ g ； 市售科博肽注射液，吉林省辉南辉发制药股份有限公司生产，规格同上，批号： 20140402。
[0049] 4. 2 方法 按照Meier方法，取经12h禁食不禁水的小鼠，分剂量组，每组10只，尾静脉或腹腔注 射不同浓度的药物，注射量为〇. lml/10体重，记录注射剂量（D :mg/kg)和小鼠存活时间（T : min)，以D/T为横坐标，D为纵坐标作图，进行线性回归，得方程D=aXD/T+b，截距b即为近 似LD5。，计算LD 5。的平均值及标准差（X土 s) 4. 3结果：注射20分钟后出现坚毛、畏缩、呼吸困难和频率加快并逐渐转为腹式呼吸， 最后死于呼吸麻痹，死前有挣扎踢腿现象，呼吸停止后心跳仍可维持一段时间。近似LD 5。如 下： 表7急性毒性试验结果
结果表明采用本发明方法制得的蛇毒神经毒素，毒性较市售产品显著小，说明本发明 方法制得的蛇毒神经毒素低毒，临床用药安全性更好。
[0050] 实验例5、科博肽镇痛实验 1. 1材料： 1. 1. 1药品： 本发明制剂：技照本发明的制备方法制备成注射液和冻干剂(技实施例6、7制备)，注 射液规格：2ml: 70 μ g，冻干规格：每瓶：70 μ g。
[0051] 对照药品：科博肽注射液，吉林省辉南辉发制药股份有限公司生产，规格同上，批 号：20140402。
[0052] 1. 1.2试验对象：昆明种小鼠18~22g，雌雄各半，购于大理医学院实验动物中心。
[0053] 1. 2试验方法及结果 取若干只小鼠禁食12h不禁水，将小鼠放在55土 1°C的恒温金属板上，密切观察小鼠 反应，以小鼠舔后足为痛觉指标，用秒表记录小鼠从放置热板上到出现舔后足反应的时间 为基础痛阈值，将基础痛阈不在l(T30s范围内的小鼠剔除；取40只符合要求的小鼠随机分 成四组，分别是实验注射液组、实验冻干剂组、对照组、空白对照组，每组10只。按体重分别 给小鼠腹腔注射本发明制剂、对照药品，实验组给本发明制剂，剂量为0. 05mg/kg，对照组给 相同剂量对照药品，空白对照组给等容量的0.9%氯化钠溶液作空白对照。测定各组给药 后4h的痛阈，计算各组给药前后的平均痛阈值，用t检验对各组给药前后的平均痛阈值的 差别作显著性检验。结果见表8。
[0054] 表8表小鼠痛阈反应时间 ^ w. wo r、ιλ vj 丄
以上数据表明，实验组药物对热板法建立的小鼠急性疼痛模型具有镇痛作用，且效果 优于对照组。
[0055]
【具体实施方式】： 实施例1 :眼镜蛇神经毒素的制备： (1 )、S印hadex G-50用注射用水膨胀，装柱后用pH8. 0的0. 01M磷酸缓冲液平衡。