恒河猴ny-eso-1蛋白、其编码基因及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属分子生物学和基因工程领域，涉及源自恒河猴肿瘤抗原NY-ESO-1蛋白、其编码基因及应用。本发明所述的恒河猴NY-ESO-1蛋白可用于制备抗肿瘤疫苗，编码该蛋白的基因可用于制备抗肿瘤核酸疫苗；上述抗肿瘤疫苗或核酸疫苗可融入颗粒白细胞-巨噬细胞集落刺激因子、γ干扰素、白介素2、转化生长因子β4等一种或多种细胞因子或微生物的成分作为免疫佐剂；所述的恒河猴NY-ESO-1蛋白可与其它源自恒河猴的肿瘤-睾丸抗原联合免疫或制备多价亚单位疫苗。进一步，本发明还提供了一种免疫原性组合物或疫苗，为抗肿瘤免疫治疗提供了一种新手段，应用前景广阔。
【专利说明】恒河猴NY-ES0-1蛋白、其编码基因及应用
【技术领域】
[0001]本发明属分子生物学和基因工程领域，涉及源自恒河猴肿瘤抗原NY-ES0-1蛋白、其编码基因及应用，特别涉及包含衍生自恒河猴肿瘤抗原NY-ES0-1中的抗原的多肽和载体。
【背景技术】
[0002] NY-ES0-1是1997年由Chen等人使用重组cDNA文库血清学分析法(Serologicalanalysis of recombinant cDNA expression libraries, SEREX)筛选来自食管癌组织的cDNA表达文库而发现的；NY-ES0_1属于肿瘤-睾丸抗原(Cancer-Testis Antigen, CT)家族，在正常人中其表达仅限于睾丸、卵巢及胚胎滋养层细胞，在其它成年体细胞组织中不表达(Simpson, Nat.Rev.Cancer,5(8):615-625 (2005);Chen, PNAS USA, 1997，94(5):1914-1918;Lethe, Int J Cancer, 1998，76(6):903-908)。
[0003]研究显示，人源(Homo sapiens) NY_ES0_1在多种组织类型肿瘤中呈不同程度的表达，包括但不限于神经母细胞瘤、恶性黑色素瘤、卵巢上皮癌、前列腺癌、肝细胞癌、食管癌和子宫癌等(Nicholaou T, Tmmunol Cell Biol.2006Jun;84(3):303-17; Jungbluth, Int.J.Cancer,2001, 92(6):856-860;Odunsi, Cancer Res, 2003, 63:6076-6083;Perez, Int.J.Cancer, 2008, 123:1551-1555)。NY-ESO-1抗原在癌症患者中引起较强的免疫原性，因而被广泛应用于肿瘤疫苗的开发，在肿瘤治疗中配合手术及放疗、化疗等手段，能有效的限制癌组织的转移、复发。
[0004]有研究报道，所述NY-ES0-1既能诱导体液免疫应答，又能激活⑶4+T和⑶8+T淋巴细胞，血清NY-ES0-1抗体阳性的患者中超过90%会产生NY-ES0-1特异性细胞毒性T细胞(Jager，PNAS USA2000 (9): 4760-4765)。NY-ES0-1的强免疫原性可能与它存在多个能被人白细胞抗原(HLA)识别的表位有关。目前，已经鉴定出多条HLA-1类和HLA-1I类限制的妝(Jager, J.Exp, Med, 1998，187 (2): 265-270; Yamaguchi, Clinical Cancer Res.,2004, 10(3):890-961;Davis, PNAS USA, 2004, 101(29): 10697-10702)。在临床试验中，具有对于HLA-A2的结合基序的3种部分重叠的NY-ES0-1衍生肽(pl57_165、pl57_167和P155-163)已在疫苗中使用，用于治疗表达NY-ES0-1的转移性肿瘤的患者；上述研究证实，合成NY-ES0-1肽可安全地使用，且能产生潜在有利的T细胞应答(Jager，PNASUSA 2000(9):4760-4765)。国内外对NY-ES0-1疫苗在多种肿瘤中的免疫治疗临床实验报道包括:多肽疫苗和全长蛋白疫苗；如，Odunsi K等人将多肽NY-ES0-lpl57-170与不完全弗氏佐剂联合使用作为疫苗，发现该疫苗可诱导多数患者产生体液免疫和细胞反应，部分患者在接种后I年仍可检测出特异性T细胞反应，且在所报告的治疗过程中，除接种部位的红肿、疼痛之外，尚未发现与试验疫苗相关的严重不良反应(Odunsi，PNASUSA, 2007，104:12837-12842)。
[0005]现有技术公开了恒河猴(Macaca mulatta)基因组已于2007年完成测序(Gffeinstock, Science 2007, 13; 316 (5822):222-34.)，与人(Homo sapiens)基因组同源性约为93%。据美国国立生物技术信息中心(Center of Biotechnology Information,网址http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)数据库检索显示，NY-ESO-1仅在灵长类动物中有高度同源性mRNA表达，其中恒河猴NY-ES0-1的mRNA与人源NY-ES0-1同源性为87%，蛋白同源性为89%。本发明拟研究开发恒河猴NY-ES0-1全蛋白潜在的肿瘤疫苗价值，及其含有的未知的HLA-1和HLA-1I限制性多肽表位，期望含有恒河猴NY-ES0-1基因的核酸疫苗将具有抗肿瘤免疫治疗的应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种新的来源于恒河猴(Macaca mulatta)的NY-ES0-1蛋白。
[0007]本发明的第二个目的在于提供一种新的恒河猴蛋白基因NY-ES0-1。
[0008]具体的，本发明所述的来源于恒河猴的NY-ES0-1蛋白，为具有以下氨基酸序列之一的多肽:
[0009](I)具有序列表SEQ ID NO:1氨基酸序列的蛋白质；
[0010](2)序列表SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与SEQ ID NO:1蛋白质序列相同活性的、由SEQ ID NO:1衍生的蛋白质，且所述的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有90%以上同源性。
[0011]本发明所述的恒河猴NY-ES0-1基因，其核苷酸序列为以下核苷酸序列之一:
[0012](I)序列表中SEQ ID N0:2的核苷酸序列；
[0013](2)编码具有序列表 SEQ ID NO:1蛋白质活性多肽的核苷酸序列，且所述的核苷酸序列与SEQ ID: 2具有90%以上同源性；
[0014](3)与序列表中SEQ ID NO:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
[0015]本发明还提供了含有上述基因的重组表达载体，及含有该重组表达载体的宿主细胞；其中，所述重组表达载体包含核酸分子，该核酸分子为编码所述恒河猴蛋白、具有所述核苷酸序列；所述宿主细胞由上述重组表达载体转化。
[0016]本发明中，所述重组表达载体优选真核表达载体pCMVTNT-rESO,其通过下述的方法构建，包括步骤:
[0017]设计引物
[0018]rES0-Fl:5’ -CCCTCTAGATCACCATGCAGGCTGCAGGCCAG-3’
[0019]rESO-Rla:
[0020]5， -CTTGTAGTCGATGTCATGATCTTTATAATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTCGCGCCTTTGTCCTGAGGG-3，
[0021]rE0S-Rlb:
[0022]5，-CCCGGATCCTCATTACTCGAGCCCGGGCTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGATGTCATGATCTTT-3’
[0023]以pMD19T-rNY-ES0-l为模板，扩增恒河猴NY-ES0-1连接3FLAG标签的片段，克隆至真核表达载体pCMVTNT (Promega)上，测序鉴定，使用QIAGEN公司EndoFree PlasmidGiga Kit (Catalog N0.12391)提取无内毒素质粒，用于转染细胞及动物免疫；使用Thermo公司Nanodrop 1000测定质粒的浓度和纯度，质粒用PBS稀释至I μ g/ μ I ;制得真核表达载体 pCMVTNT-rESO。
[0024]本发明还提供了一种表达所述蛋白的方法，其包括步骤:将所述含有编码恒河猴NY-ES0-1基因的重组表达载体倒入宿主细胞内，从而表达恒河猴NY-ES0-1蛋白；
[0025]所述宿主可为任意可表达外源基因的原核或真核细胞，如大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞等；所述大肠杆菌可为E.coli DH5a、E.coli BL21 (DE3)、E.coliToplO、E.coli JM109等；所述真核细胞可为哺乳动物细胞或昆虫细胞，包括HEK293T、C0S-7、CH0、Vero, HeLa 和 Sf9 等；
[0026]本发明中，用于构建含有编码恒河猴NY-ES0-1蛋白的基因的重组大肠杆菌表达载体的出发载体可为PET载体系列、pQE载体系列、pGEX载体系列与IMPACT?系统等；
[0027]本发明中，用于构建含有编码恒河猴NY-ES0-1蛋白的基因的重组真核表达载体的出发载体可为pcDNA3.1、pCMVTNT、pSVl.0等；
[0028]本发明中，表达载体和表达菌株或细胞系均可按照常规方法构建。
[0029]本发明所述的恒河猴NY-ES0-1蛋白可用于制备抗肿瘤疫苗，编码该蛋白的基因可用于制备抗肿瘤核酸疫苗；所述的抗肿瘤疫苗或核酸疫苗可加入颗粒白细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Y干扰素(IFN-Y )、白介素2(IL-2)、转化生长因子0 4(TGF_3 4)等一种或多种细胞因子或微生物的成分(CpG、霍乱毒素、脂蛋白、脂质A)作为免疫佐剂。
[0030]本发明所述的恒河猴NY-ES0-1蛋白可与其它源自恒河猴的肿瘤-睾丸抗原联合免疫或制备多价亚单位疫苗。
[0031]本发明提供了恒河猴NY-ES0-1蛋白及其编码基因，经实验结果表明，所述的蛋白在BALB/c小鼠体内产生特异性抗体，并能刺激T细胞免疫反应；本发明为抗肿瘤免疫治疗提供了一种新手段，应用前景广阔。
[0032]进一步，本发明提供了一种蛋白，其包含恒河猴NY-ES0-1蛋白及其片段，或包括恒河猴NY-ES0-1蛋白的一个或是多个表位的片段；
[0033]其中，所述恒河猴NY-ESO-1蛋白选自全长恒河猴NY-ESO-1蛋白、部分截短的恒河猴NY-ESO-蛋白I或截短的恒河猴NY-ES0-1蛋白或其任何片段，所述片段包括恒河猴NY-ES0-1蛋白的一个或多个表位；所述恒河猴NY-ES0-1蛋白与天然存在的恒河猴NY-ES0-1蛋白至少90%以上等同；
[0034]上述蛋白进一步包含亲和标记物；所述亲和标记物为包含1-10个组氨酸残基的组氨酸尾，或包含重组Flag标签DYKDHD⑶YKDHDIDHKDDDDK ；
[0035]上述蛋白包含选自所述的氨基酸序列SEQ ID N0:1。
[0036]以及，提供了一种核酸分子，其编码上述蛋白，为以下核苷酸序列之一:
[0037](I)包含但不限于选自下述的核苷酸序列:序列表中SEQ ID NO: 2的DNA序列；
[0038](2)与序列表SEQ ID NO:2限定的DNA序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；
[0039](3)在高严谨条件下下可与序列表中SEQ ID N0:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
[0040]以及，提供了一种免疫原性组合物或疫苗，其包含上述蛋白、上述核酸分子或上述载体；该免疫原性组合物还可包含佐剂、和/或免疫细胞刺激因子或趋化因子；免疫原性组合物或疫苗中所述的蛋白存在于水包油或油包水乳剂媒介物中；所述免疫原性组合物或疫苗包含一种或多种佐剂:3-0-脱酰基单磷酰脂质A (3D-MPL)、QS21或CpG寡核苷酸；该免疫原性组合物或疫苗还可包含一种或多种其它抗原；所述的免疫原性组合物或疫苗可用于医学领域。
[0041]更进一步，本发明中所提供的蛋白、核酸分子、载体、免疫原性组合物或疫苗均可用于制备治疗癌症的药物，所述癌症包括乳腺黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌包括非小细胞肺癌(NSCLC)、头与颈癌包括食管癌、鳞状细胞癌、胃肠道癌、肝癌、脑肿瘤、白血病及各种肉瘤；还能用于治疗对于Her2/neU靶向治疗不合格的患者；
[0042]所述的蛋白、核酸分子、载体、免疫原性组合物或疫苗均可用于临床癌症诊断，所述的蛋白、核酸分子、载体、免疫原性组合物或疫苗可用于但不限于制备商品化诊断试剂盒、或ELISA试验中的包被抗原。
[0043]为了便于理解，以下将通过具体的实施例和附图对本发明的进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
【专利附图】
【附图说明】
[0044]图1为自恒河猴脑、骨髓、骨骼肌、心肌、肺、肝、胃、脾、小肠、肾、前列腺、胸腺和睾丸组织cDNA中扩增出的NY-ES0-1基因片段和内参GAPDH基因片段的DNA凝胶电泳图。
[0045]图2为真核表达载体pCMVTNT-rESO示意图。
[0046]图3为真核表达载体pCMVTNT-rESO转染HEK293T细胞后表达的恒河猴NY-ES0-1蛋白表达western blotting电泳图。
[0047]图4显示了真核表达载体pCMVTNT-rESO免疫后的BALB/c小鼠脾细胞在人源NY-ES0-1多肽刺激后，分泌Y干扰素的结果(总)。
[0048]图5显示了真核表达载体pCMVTNT-rESO免疫后的BALB/c小鼠脾细胞在人源NY-ES0-1多肽刺激后，分泌Y干扰素的结果(阳性肽段)。
[0049]图6为真核表达载体pCMVTNT-rESO免疫BALB/c小鼠后,血清中恒河猴NY-ES0-1蛋白特异性抗体的检测电泳图。
【具体实施方式】
[0050]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见:((Molecular Cloning:A Laboratory Manual))(Sambrook, J., Russell, David W.,MolecularCloning:A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。
[0051]本发明涉及的细胞HEK293T参见文献Cannon SC等人，Functional expressionof sodium channel mutations identified in families with periodic paralysis.Neuron, 1993，10(2):317-326。HEK293T细胞可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从美国标准菌株收藏所ATCC购得。
[0052]本发明涉及的表达载体pCMVTNT参见文献Kohrer C等人，Complete set oforthogonal 21st aminoacyl-tRNA synthetase-amber, ochre and opal supperssor tRNApairs: concomitant suppression of three different termination codons in an mRNAin mammalian cells.Nucleic Acids Res.，2004，32 (21):6200_6211。表达载体 pCMVTNT可通过公开市售的商业渠道取得，如，可从美国Promega公司购得。
[0053]本发明所用引物及测序工作均由上海博尚生物工程有限公司完成。
[0054]本发明涉及的BALB/c小鼠由中国科学院上海动物实验中心下辖上海斯莱克实验动物有限公司提供，由上海市公共卫生临床中心动物中心SPF实验室饲养。
[0055]实施例1、检测及克隆恒河猴组织中的恒河猴NY-ESO-1蛋白基因
[0056]1、提取恒河猴组织总RNA
[0057]取离体的恒河猴脑、骨髓、骨骼肌、心肌、肺、肝、胃、脾、小肠、肾、前列腺、胸腺和睾丸组织，按常规方法处理，如包括液氮处理，无菌处理等，使用QIAGEN公司RNeasy PlusMini Kit (Catalog N0.74104)提取组织 RNA。
[0058]2、合成恒河猴组织cDNA片段及检测NY-ES0-1
[0059]用SuperScript?III First-Strand Synthesis System (Catalog N0.18080-051)系统合成恒河猴各组织cDNA第一链，作为NY-ES0-1基因检测PCR模板；根据Genebank公布的恒河猴基因组序列，设计引物如下:
[0060]rES0-F:5’ -GGGATGCAGGCTGCAGGCCAGGGC-3’
[0061 ] rESO-R: 5，-GGTTAGCGCCTTTGTCCTGAGGGA-3，
[0062]内参GAPDH引物:
[0063]GAPDH-FI40 :5， -GTATTGGGCGCCTGGTCACC-3’
[0064]GAPDH-R766:5， -GGATGACCTTGCCCACAGCC-3’
[0065]对恒河猴各组织cDNA扩增，在所有组织中得到627bp的GAPDH片段，在且仅在睾丸组织中得到约550bp大小的特异性片段，结果如图1所示。
[0066]3、克隆恒河猴 NY-ES0-1
[0067]分离纯化该特异性片段，并与pMD19T_easy (takara)载体连接,转化大肠杆菌DH5 α，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，提取质粒pMD19T-rNY-ES0-l，酶切鉴定后进行测序。得到561bp片段在Genebank上运行Blast比对，发现与恒河猴Macaca mulatta的cancer/testis antigen IA 序列完全相同，和人 Homo sapiens NY-ESO-l 基因序列 87% 同源。证实该特异性片段为恒河猴NY-ES0-1。
[0068]4、鉴定恒河猴NY-ES0-1全长mRNA
[0069]使用BD SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, Catalog 634914)进行cDNA全长克隆，得到恒河猴NY-ES0-1的mRNA全长序列。
[0070]实施例2、构建及鉴定真核表达载体[0071 ] 1、构建真核表达载体pCMVTNT-rESO
[0072]设计引物
[0073]rES0-F 1:5’ -CCCTCTAGATCACCATGCAGGCTGCAGGCCAG-3’
[0074]rESO-Rla:
[0075]5， -CTTGTAGTCGATGTCATGATCTTTATAATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTCGCGCCTTTGTCCTGAGGG-3，
[0076]rE0S-Rlb:
[0077]5，-CCCGGATCCTCATTACTCGAGCCCGGGCTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGATGTCATGATCTTT-3’[0078]以pMD19T-rNY-ES0-l为模板，扩增恒河猴NY-ES0-1连接3FLAG标签的片段，克隆至真核表达载体pCMVTNT (Promega)上，测序鉴定，使用QIAGEN公司EndoFree PlasmidGiga Kit (Catalog N0.12391)提取无内毒素质粒，用于转染细胞及动物免疫；使用Thermo公司NanodroplOOO测定质粒的浓度和纯度,质粒用PBS稀释至I μ g/ μ I ;得到质粒，其图谱如图2所示。
[0079]2、鉴定真核表达载体pCMVTNT-rESO
[0080](I)细胞转染
[0081]Lipofectamine2000每孔1.5 μ 1，溶解在100 μ I无血清DMEM培养基中，充分混合后室温孵育5min ；pCMVTNT-rESO质粒或pCMVTNT空载体每孔2 μ g溶解在100 μ I DMEM培养基中，充分混合后室温孵育5min ;两者混合均匀，室温孵育20min。HEK293T细胞用无血清DMEM洗涤两次后，加入孵育过的混合物，放入5%C02孵箱37°C培养4_6h。补充培养基，使其成为DMEM含10%小牛血清和1%PS抗生素完全培养基。继续培养48h后收集细胞，PBS洗漆一遍后，用200μ1 RIPA裂解液处理5min,用于western blotting检测。
[0082](2)免疫印迹杂交法(western blotting)检测
[0083]以Monoclonal ANT1-FLAG?M2 antibody produced in mouse(Sigma-Aldrich 公司，Catalog N0.F1804)和 Mouse Ant1-beta actin Monoclonal Antibody(北京中杉金桥,Catalog N0.TA-O9)作为一抗，Peroxidase-Conjugated AffiniPure Goat Ant1-Mouse IgG(北京中杉金桥，Catalog N0.ZB-2305)作为二抗,western blotting 检测恒河猴 NY-ES0-1蛋白的表达；检测结果如图3所示。
[0084]实施例3、真核表达载体pCMVTNT-rESO免疫BALB/c小鼠后，脾细胞分泌Y干扰素分析`
[0085]1、真核表达载体免疫BALB/c小鼠
[0086]将BALB/c小鼠分为两组，空载体组3只，实验组5只。取去内毒素质粒pCMVTNT-rESO和pCMVTNT空载体，按照每只小鼠100 μ g DNA的量分别于第0、2、4、7周小鼠后肢胫前肌注射。
[0087]2、小鼠脾细胞分离
[0088]于第10周将小鼠眼球取血后颈椎脱臼法处死，无菌条件下分离脾淋巴细胞。用1640完全培养基(10%小牛血清，1%PS抗生素)重悬。
[0089]3、ELISP0T检测小鼠脾细胞分泌Y干扰素
[0090]操作参照BD Mouse IFN-Y ELI SPOT Kit (BD 公司，Catalog N0.551083)说明，具体步骤如下:
[0091](I)处死小鼠前I天，ELISP0T平板每孔加入100 μ I包被抗体，4°C过夜；
[0092](2)1640完全培养基200 μ I洗涤2次，加入1640完全培养基200 μ I/孔，室温封闭2h ；
[0093](3)弃封闭液，将分离的小鼠脾细胞按2X IO5/孔加入ELISP0T板中，实验孔加入合成的人源NY-ES0-1多肽(共42条肽段，每条肽段15氨基酸)4μ g/ml，阳性孔加入PMA(终浓度50ng/ml)和ionomycin (终浓度I μ g/ml),空白对照孔不加；补充1640完全培养基至 100 μ 1，5%C02 培养箱 37 °C 20h ；
[0094](4)弃细胞，每孔加入去离子水浸泡，PBST洗涤3次；[0095](5)每孔加入 100 μ I 生物素标记 INF- Y 抗体(biotinylated detectionantibody),室温孵育 2h ；
[0096](6) PBST洗涤3次，每孔加入100 μ I亲和素偶联辣根过氧化物酶，室温孵育Ih ；
[0097](7) PBST洗涤4次，PBS洗涤2次，拍干，每孔加入100 μ I显色底物，室温避光孵育 30min ；
[0098](8)出现斑点后用自来水冲洗终止反应。干燥后，用ELISP0T读板仪(赛智公司，ChampSpot III)计数,统计每孔有反应的斑点形成细胞(Spot Forming Cells, SFCs),结果换算成SFCs/106个脾细胞(结果如图5、图6所示)；
[0099](9)分析反应结果阳性的肽段共6段，序列如下，
[0100]刺激真核表达载体pCMVTNT-rESO免疫后的BALB/c小鼠脾细胞分泌Y干扰素的6条肽段:
[0101]N0.23:EFYLAMPFATPMEAE (Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro MetGlu Ala Glu),
[0102]N0.24:AMPFATPMEAELARR(Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Phe Ala Glu LeuAla Arg Arg),
[0103]N0.29:APPLPVPGVLLKEFT(Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Glu Val Leu Leu LysGlu Phe Thr),
[0104]N0.30:PVPGVLLKEFTVSGN(Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr ValSer Gly Asn),
[0105]N0.34:LTIRLTAADHRQLQL(Leu Thr He Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg GlnLeu Gln Leu),
[0106]N0.35:LTAADHRQLQLSISSCLeu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln Leu Gln Leu SerHe Ser SerX
[0107]实施例4、检测真核表达载体pCMVTNT-rESO免疫BALB/c小鼠后，血清中恒河猴NY-ES0-1蛋白特异性抗体
[0108]1、免疫小鼠血清分离
[0109]小鼠处死后眼球取血约500 μ 1，置37 °C孵育lh，4°C、5000g离心20分钟，取上层血清约100 μ I，实验组5只小鼠血清混合，1:50稀释待用；
[0110]2、小鼠血清中恒河猴NY-ES0-1蛋白特异性抗体的免疫印迹杂交法(westernblotting)检测
[0111]以1:50 稀释后小鼠混合血清和 Mouse Ant1-beta actin Monoclonal Antibody(北京中杉金桥，Catalog N0.TA-09)作为一抗，Peroxidase-Conjugated AffiniPure GoatAnt1-Mouse IgG (北京中杉金桥，Catalog N0.ZB-2305)作为二抗,western blotting 检测恒河猴NY-ES0-1蛋白的表达(检测结果如图6所示)。
【权利要求】
1.一种蛋白，其包含恒河猴NY-ESO-1及其片段，或包括恒河猴NY-ESO-1的一个或是多个表位的片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.按权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述的恒河猴NY-ES0-1选自:全长恒河猴NY-ES0-1、部分截短的恒河猴NY-ES0-1或截短的恒河猴NY-ES0-1或其任何片段，所述片段包括恒河猴NY-ES0-1的一个或多个表位。
3.按权利要求1或2所述的蛋白，其特征在于，所述的蛋白包括所述恒河猴NY-ES0-1及与其90%以上同源的天然存在或人工突变的恒河猴NY-ES0-1。
4.按权利要求1或2或3所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白包含亲和标记物。
5.根据权利要求4的蛋白，其特征在于，所述亲和标记物是包含1-10个组氨酸残基的组氨酸尾，或包含重组Flag标签DYKDHD⑶YKDHDIDHKDDDDK。
6.一种核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1-5中任一项的蛋白，是下述核苷酸序列之一: 1)包含但不限于选自下述的核苷酸序列:序列表中SEQID NO: 2的DNA序列； 2)与序列表SEQID NO: 2限定的DNA序列具有90%以上同源性的核苷酸序列； 3)在高严谨条件下下可与序列表中SEQID NO: 2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
7.一种载体，其特征在于，其包含权利要求6的核酸分子，所述载体包括但不限于真核表达质粒载体、原核表达载体、病毒载体或细菌载体。
8.一种真核细胞，其特征在于，其用权利要求7的载体转化，所述真核细胞包括但不限于真核细胞293T、Vero、从人或动物体内分离的树突状细胞(Dendritic Cells，DC)与其他抗原递呈细胞、体外诱导产生或人工制作的抗原递呈细胞。
9.一种真核细胞，其特征在于，其用权利要求1-5中蛋白与多肽孵育过的抗原递呈细胞，包括但不限于树突状细胞DC。
10.一种免疫原性组合物或疫苗，其特征在于，其包含根据权利要求1-5中任一项的蛋白、权利要求6的核酸分子、权利要求7的载体或权利要求8-9的细胞。
11.如权利要求10所述的免疫原性组合物或疫苗，其特征在于，所述的免疫原性组合物还包含颗粒白细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Y干扰素(IFN-Y )、白介素2(IL-2)、转化生长因子β4 (TGF-β 4)等一种或多种细胞因子或微生物的成分，如CpG寡聚核苷酸、霍乱毒素、脂蛋白、脂质A作为免疫佐剂。
12.如权利要求10或11所述的免疫原性组合物或疫苗，其特征在于，其中所述蛋白存在于水包油或油包水乳剂媒介物中。
13.如权利要求10-11中任一项的免疫原性组合物或疫苗，其特征在于，其还包含一种或多种其它抗原。
14.权利要求1-5的蛋白、或权利要求6的核酸分子、或权利要求7的载体、或权利要求10-13的免疫原性组合物或疫苗在制备治疗癌症的药物中的用途，所述癌症例如乳腺黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌包括非小细胞肺癌(NSCLC)、头与颈癌包括食管癌、鳞状细胞癌、胃肠道癌、肝癌、脑肿瘤、白血病及各种肉瘤。
15.如权利要求14的用途，其特征在于，所述的药物包括但不限于与其它治疗癌症药物或手术、放疗、化疗治疗方案联合使用。
16.如权利要求14用途，其特征在于，所述的药物用于治疗对于Her2/neu靶向治疗不合格的患者。
17.权利要求1-5的蛋白、或权利要求6的核酸分子、或权利要求7的载体、或权利要求8与9的细胞、或权利要求10-13的免疫原性组合物或疫苗在制备诊断癌症的制剂中的用途，所述的诊断癌症的制剂包含但不限于商品化诊断试剂盒或ELISA试验中的包被抗原。
18.权利要求1-5的蛋白、或权利要求6的核酸分子、或权利要求7的载体、或权利要求8与9的细胞、10-13的免疫原性组合`物或疫苗在制备单克隆抗体中的用途。
【文档编号】A61K39/00GK103483441SQ201210189590
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年6月10日 优先权日:2012年6月10日
【发明者】徐建青, 曾刚, 周明哲, 徐军 申请人:复旦大学