专利名称：人免疫功能重建鼠子宫内膜异位症模型及建模方法
技术领域：
本发明涉及子宫内膜异位症模型及模型的建立方法
背景技术：
EM是一种常见的良性妇科疾病，多发生于生育年龄妇女；近年来，其发病率有明显上升趋势，迄今为止，关于内异症的发病机制尚不明确，需依靠腹腔镜检查或手术病理组织学检查确诊，且药物治疗和术后复发率较高。
EM模型可以通过狒狒、家兔、猕猴和大鼠同源自体内膜移植来建立，但由于这些动物的内膜和人的内膜存在系统发生和生化特征方面的巨大差异，这类模型有诸多局限。
NOD-SCID小鼠即非肥胖性糖尿病严重联合免疫缺陷小鼠，为先天性T、B淋巴细胞联合免疫缺陷动物，可以克服异种间的免疫排斥反应，接受人类正常和肿瘤组织移植，移植后的组织仍保持原有的组织形态及生化特征，更接近人类疾病的病理变化；但是由于NOD-SCID鼠的免疫缺陷，不能进行免疫调控，而且正常人的分泌期子宫内膜并不容易获得。
上述原因的存在，极大地限制了对于该疾病的研究。
发明内容
本发明是为避免上述现有技术所存在的不足，提供一种人免疫功能重建鼠子宫内膜异位症模型，并提供该模型的建模方法，为研究子宫内膜异位症的发病机制、治疗及预防策略提供基础。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是本发明人免疫功能重建鼠子宫内膜异位症模型的特点是将早孕人外周血单个核细胞(PBMC)输入非肥胖性糖尿病严重联合免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠体内，重建人的免疫功能；将同一人蜕膜组织种植在所述(NOD-SCID)小鼠体内建立的人免疫功能重建鼠子宫内膜异位症模型。
本发明所述模型建模方法的特点是按如下步骤操作a、外周血处理外周血采自妊娠妇女，分离外周血单个核细胞(PBMC)，作台盼蓝计数，用培养液(RPMI1640)调至2×107～2×108个细胞/毫升的细胞浓度，呈悬液；b、蜕膜取自行人工流产术的同一妇女，妊娠45-50天，妇检证实无先兆流产征象，术后见明显绒毛，蜕膜组织新鲜；所取蜕膜置入培养液(RPMI1640)无菌瓶，随即置于冰盒；取小鼠(NOD-SCID)，6-8周龄，性成熟，雌性；c、接种前处理所取蜕膜用2-6℃磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗去血块和黏液，于无菌培养皿内剪成小块，分装在盛有培养液(RPMI1640)的无菌管内为备用标本；d、种植小鼠采用直线加速器全身照射；照射后输注已备好的外周血单个核细胞(PBMC)悬液，按每只小鼠所需细胞总数在1×107～1×108注射外周血单个核细胞(PBMC)悬液0.2-0.8毫升；随后麻醉小鼠，待小鼠麻醉后固定于操作板上，消毒备皮，并做小口，将已备标本种植于体内，无菌丝线缝合即成。
子宫内膜就组织学观察可以分为3期其一为增生期，内膜细胞增生，内膜逐渐生长变厚；其二为分泌期，子宫内膜继续增厚，内膜细胞分泌糖原；其三为月经期，内膜组织变性、坏死、出血；受精卵着床后，子宫内膜迅速发生蜕膜变，此时子宫内膜称蜕膜；本发明模形因选取早孕人蜕膜组织建立人免疫功能重建NOD-SCID鼠子宫内膜异位症动物模型，因而具备如下优点1、蜕膜组织属于正常生理妊娠的一部分，稳定可靠，不受其他疾病因素的影响。
2、采用妊娠40-50天的蜕膜组织，不受子宫内膜周期性变化的影响。
3、机体免疫系统对蜕膜呈现免疫豁免状态，由此导致子宫内膜容易异位种植，为造模提供了更好的理论依据。
4、蜕膜比增生期内膜厚，易刮取，获取组织较多，可以一次种植多只NOD-SCID鼠。
5、人工流产是避孕失败的有效补救措施，蜕膜取自人工流产妇女，其来源丰富。
6、小鼠具有人的免疫功能，能够进行子宫内膜异位症免疫方面的研究。
NOD-SCID小鼠即非肥胖性糖尿病严重联合免疫缺陷小鼠，为先天性T、B淋巴细胞联合免疫缺陷动物，可以克服异种间的免疫排斥反应，接受人类正常和肿瘤组织移植，移植后的组织仍保持原有的组织形态及生化特征，更接近人类疾病的病理变化；此类小鼠虽然T、B淋巴细胞缺陷，而造血功能正常，对放射线极为敏感，全身照射可以清除小鼠内源性造血系统而不损伤其骨髓微环境，后者可以支持人类造血干细胞的生长，所以可以在NOD-SCID小鼠中重建人的免疫功能；NOD-SCID小鼠遗传背景明确，体内微生物可控制，模型性状显著且稳定，质量和规格可选择，价格适中，来源丰富；本发明NOD-SCID小鼠具有人的免疫功能，移植后的蜕膜仍保持子宫内膜的组织形态，模型性状显著且稳定，观察周期短，实验结果具有较大的临床参考意义。
图1为本发明移植物HE染色×200
具体实施例方式本实施例中人免疫功能重建鼠子宫内膜异位症模型是将早孕人外周血单个核细胞PBMC输入非肥胖性糖尿病严重联合免疫缺陷NOD-SCID小鼠体内，重建人的免疫功能；将同一人蜕膜组织种植在所述NOD-SCID小鼠体内建立的人免疫功能重建鼠子宫内膜异位症模型。
模型的建立按如下步骤操作1、外周血处理外周血采自妊娠妇女，分离外周血单个核细胞PBMC，作台盼蓝计数，用培养液RPMI1640调至2×107～2×108个细胞/毫升的细胞浓度，呈悬液。
2、取材蜕膜取自行人工流产术的同一妇女，妊娠45-50天，妇检证实无先兆流产征象，术后见明显绒毛，蜕膜组织新鲜；所取蜕膜置入5毫升RPMI1640培养液无菌瓶，随即置于冰盒；具体实施中，PMRI1640培养液中可含有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素，用于预防小鼠感染。
取NOD-SCID，6-8周龄，性成熟，雌性。
3、接种前处理所取蜕膜用2-6℃磷酸缓冲盐溶液PBS洗去血块和黏液，于无菌培养皿内剪成1×2毫米小块，分装在盛有RPMI1640培养液的无菌管内为备用标本。
4、种植小鼠采用直线加速器全身照射，按照剂量率1戈瑞-1.5戈瑞，照射时间为2-3分钟，照射总剂量为2戈瑞-3戈瑞进行操作；要求照射达到清除小鼠内源性造血系统而不损伤其骨髓微环境，如照射剂量过小，就可能没有将小鼠内源性造血系统全部清除，不利于免疫功能重建；如果照射剂量过大，则可能损伤小鼠骨髓微环境，导致其死亡。
照射后输注已备好的外周血单个核细胞PBMC悬液，腹腔或尾静脉注射外周血单个核细胞PBMC悬液0.2-0.8毫升，具体可以按每只0.5毫升PBMC悬液注射，其中含PBMC数为5×107；随后，以氯胺酮100毫克/千克腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠麻醉后固定于操作板上，将已备标本种植于其体内，包括种植在其皮下或腹腔内。具体实施中，可以是对其腹部进行消毒备皮，并做一只0.5厘米长小口，将已备标本种植于皮下，无菌丝线缝合即成，皮下种植更有利于观察。
关于输注的细胞浓度由于每只小鼠输注的外周血单个核细胞PBMC是一定的，体积太小(低于0.1毫升)，则细胞浓度太大，可能会堵塞注射器针孔，影响注射；如体积太大(超过1毫升)，可能会引起小鼠死亡。
关于输注的细胞数量如果输入细胞过少，可能会导致免疫功能重建失败；如果输入细胞过多，可能会导致小鼠死亡。
分组NOD-SCID鼠分组A组为8只小鼠，照射后输注外周血、种植蜕膜；B组为8只小鼠，照射后种植蜕膜，未输注外周血；C组4只小鼠，为不作任何处理的空白对照。
移植后处理移植4周，小鼠颈椎脱臼处死，取小鼠肝、脾、胸腺、淋巴结、外周血、腹腔液细胞悬液测定人CD3、CD19、HLA-ABC阳性细胞比例；取出腹部皮下病灶，10％福尔马林固定，乙醇逐级脱水，常规石蜡包埋，做HE染色。
结果1、NOD-SCID鼠存活及生长情况A组有4只于照射后第5天和8天死亡，另4只存活至28天后被处死；B组8只先后于照射后7天内死亡；C组4只均存活，可以排除饲养条件引起的感染。
2、外周血移植后人源性细胞测定外周血移植4周后，采用人特异单克隆抗体CD3-CY、CD19-FITC、HLA-ABC-PE测定小鼠骨髓、肝脏、脾脏、胸腺、淋巴结、外周血、腹腔液的人源性细胞情况。结果显示肝脏CD3+细胞占16.33％-31.75％、HLA-ABC阳性细胞占17.56％-32.98％，脾脏CD3+细胞占3.84％-5.37％、HLA-ABC阳性细胞占4.06％-5.53％，淋巴结CD3+细胞占5.03％-5.15％、HLA-ABC阳性细胞占5.21％-5.36％，外周血CD3+细胞占2.47％-6.05％、HLA-ABC阳性细胞占4.25％-7.16％，腹腔液CD3+细胞占25.85％-51.43％、HLA-ABC阳性细胞占71.35％-87.80％，胸腺CD3+细胞6.05％-9.26％、HLA-ABC阳性细胞占6.50％-9.64％，骨髓CD3+细胞、HLA-ABC阳性细胞所占比例＜1％。各器官组织中CD19+细胞比例＜1％。说明重建人免疫功能是成功的。
3、蜕膜移植物病理第4周从小鼠腹部皮下取出病灶，常规石蜡包埋，HE染色，镜检见到子宫内膜腺体和间质(附图所示)。说明移植后蜕膜的形态结构没有发生改变。
权利要求
1.一种人免疫功能重建鼠子宫内膜异位症模型，其特征是将早孕人外周血单个核细胞(PBMC)输入非肥胖性糖尿病严重联合免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠体内，重建人的免疫功能；将同一人蜕膜组织种植在所述(NOD-SCID)小鼠体内建立的人免疫功能重建鼠子宫内膜异位症模型。
2.一种权利要求1所述模型的建立方法，其特征是按如下步骤操作a、外周血处理外周血采自妊娠妇女，分离外周血单个核细胞(PBMC)，作台盼蓝计数，用培养液(RPMI1640)调至2×107～2×108个细胞/毫升的细胞浓度，呈悬液；b、蜕膜取自行人工流产术的同一妇女，妊娠45-50天，妇检证实无先兆流产征象，术后见明显绒毛，蜕膜组织新鲜；所取蜕膜置入培养液(RPMI1640)无菌瓶，随即置于冰盒；取小鼠(NOD-SCID)，6-8周龄，性成熟，雌性；c、接种前处理所取蜕膜用2-6℃磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗去血块和黏液，于无菌培养皿内剪成小块，分装在盛有培养液(RPMI1640)的无菌管内为备用标本d、种植小鼠采用直线加速器全身照射；照射后输注已备好的外周血单个核细胞(PBMC)悬液，按每只小鼠所需细胞总数在1×107～1×108注射外周血单个核细胞(PBMC)悬液0.2-0.8毫升；随后麻醉小鼠，待小鼠麻醉后固定于操作板上，消毒备皮，并做小口，将已备标本种植于体内，无菌丝线缝合即成。
3.根据权利要求2所述模型的建立方法，其特征是在所述步骤d中，所述小鼠直线加速器进行全身照射，按照剂量率1戈瑞-1.5戈瑞，照射时间为2-3分钟，照射总剂量为2戈瑞-3戈瑞。
4.根据权利要求2所述方法，其特征是所述步骤b的培养液(PMRI1640)中含有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。
全文摘要
人免疫功能重建鼠子宫内膜异位症模型及建模方法，其特征是将早孕人外周血单个核细胞输入非肥胖性糖尿病严重联合免疫缺陷小鼠体内，重建人的免疫功能；将同一人蜕膜组织种植在所述小鼠体内建立的人免疫功能重建鼠子宫内膜异位症模型。建模方法的特征是外周血和蜕膜皆取自同一行人工流产术的妇女，妇检证实无先兆流产征象，术后见明显绒毛，蜕膜组织新鲜；将外周血单个核细胞输入小鼠体内，蜕膜接种在小鼠腹部皮下，无菌丝线缝合即成；本发明NOD－SCID小鼠具有人的免疫功能，移植后的组织仍保持子宫内膜的组织形态，模型性状显著且稳定，观察周期短，实验结果具有较大的临床参考意义。
文档编号G09B23/00GK1648966SQ20051003768
公开日2005年8月3日 申请日期2005年1月10日 优先权日2005年1月10日
发明者凌斌, 王群华, 陈峥峥, 赵卫东, 祝怀平, 周颖, 沈国栋, 许恬怡, 姚凤球, 朱园园, 陈敏 申请人:安徽省立医院