人源化小鼠模型的构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及人源化小鼠模型的构建方法和应用，具体涉及人源Nbs1c.657del5基因的转基因小鼠模型的构建方法和应用，包括构建人源Nbs1基因中含5bp缺失突变的BAC载体，原核显微注射，筛选获得高表达和低表达人源Nbs1基因的3个稳定转基因系。本发明的转基因小鼠在其中一个系中以一定比例出现了发育延迟、体长均匀缩短、骨发育异常的表型，为奈梅亨破碎综合症疾病建立了新的小鼠模型。同时，由于Nbs1基因功能损伤与癌症密切相关，因此该转基因模型可应用于药物临床前安全性评价中的短期致癌实验，为传统的两年期致癌实验提供了有潜力的替代模型，也为癌症发生机理的研究提供了有效的工具。
【专利说明】人源化小鼠模型的构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种转基因小鼠模型，具体涉及一种在不同发育阶段和器官中较高水平表达NBSlpro的转基因小鼠模型的构建方法，以及该动物模型以及由其衍生的胚胎、细胞、组织和器官在药物临床前安全性评价、致癌物筛选及治疗NBS (奈梅亨破碎综合症)药物筛选中的用途。
【背景技术】
[0002]DNA修复系统和细胞周期检测点系统与基因组的稳定性直接相关。若细胞无法正常发挥DNA双链断裂修复功能(同源重组修复和非同源末端连接修复)，会导致染色体重排和突变积累，进而激活细胞周期检测点，抑制生长。但若作为最后的检测，细胞周期检测点阻止功能也同时受损，才使细胞更容易恶性增殖和组织癌变，如奈梅亨破碎综合症(K.K.Khanna 等，2001，Nature, 27:247-254 ;Μ.0，Driscoll 等，2006，Nature ReviewsGenetics, 7:45-54)。
[0003]95%的奈梅亨破碎综合征病人为Nbslc.657del5突变的纯合子(缺失cDNA657_661位点5nt，属常染色体隐性遗传)。携带Nbslc.657del5突变的杂合子人群与正常人群相比也表现出癌症发生机率的显著性提高(E.Seemanovdi等，2007，J Natl CancerInst.，99:1875-1880 ；E.Seemanova 等，2006，Cas LekCesk.，145:138-143)，因此研究人员推断:与经典“two- hit”肿瘤发生模型中的肿瘤抑制基因不同，Nbsl属于单倍不足肿瘤抑制基因群，肿瘤的发生仅仅取决于基因剂量的下降程度(M.Santarosa等，2004, B1chimB1phys Acta, 1654:105-122)。该疾病的主要症状可概括如下:倾向在青年时期患淋巴癌、血液系统或固态恶性肿瘤(C.Cybulski 等,2004, Cancer Research, 64:1215-1219 ；J.P.Ehlers 等，2005，Cl in Cancer Res., 11:1849-1853 ；B.Gorski等，2003，Internat1nal Journal of Cancer., 106:379-381 ；J.Steffen 等，2004，Int.J.Cancer.，111:67-71 ；H.Tauchi 等，2002，Oncogene.，21:8967-8980)，成长缓慢，体长均匀缩短，头小畸形，面部特征异常，骨发育异常，染色体不稳定，免疫系统缺陷，易反复感染，脑发育异常，皮肤异常(K.H.Chrzanowska 等，2012，Orphanet Journal of RareDiseases, 7:1-19 ；K.Szczaluba等，2012，Journal of Applied Genetics, 53:189-191)，女性卵巢发育障碍(1.v.d.Burgt 等,1996, J Med Genet., 33:153-156 ;Κ.H.Chrzanowska等，2010，J Clin Endocrinol Metab.，95:3133-3140)、男性第二性征发育推迟(http://www.emedicine.com/ derm/ topic725.htm)。奈梅亨破碎综合征病人的细胞具有如下显著特点:intra-S期、G1到S期、G2期到M期的检测功能缺陷，即在离子射线或类福射药物(如bleomycin)处理后，无法停止DNA的合成和阻止细胞进入S期(或M期)。导致这些病人对直接或间接引起DNA双链断裂的所有致变剂敏感(1.Demuth等，2007，Oncogene, 26:7792-7798)。
[0004]Nbsl与Mrell、Rad50相互结合形成的MRN复合物是DNA的同源重组修复和非同源末端连接修复系统中双链断裂的识别和启始元件，并参与信号传导和修复(R.S.Williams等，2009，Cell., 139:87-99)。此外，NbsI在细胞周期检测点和端粒稳定性维持系统中也发挥了重要的功能(S.E.R.P.，2009，GENES&DEVELOPMENT.，23:171-180 ；Y.L.ErinR.P.Shull, Hironobu Nakane, 2009, Genes Dev, 23:171-180 ;Β.J.Lamarche 等,2010, FEBSLetters.,584:3682-3695)。
[0005]Nbsl蛋白由N-端的FHA结构域及两个相邻的BRCT结构域(BRCT1、BRCT2)(J.Lloyd等，2009，Cell.，139:100-111)，和C-端的Mre11结合结构域及ATM结合结构域组成。FHA-BRCT1-BRCT2协助MdcI和CtpI绑定在DSB位置，进行同源重组修复(R.S.Wi Iliams等，2009, Cell.，139:87-99);该结构域还介导与ATR的相互作用，其缺失不仅抑制正常的同源重组修复，也会使S期检测点的功能受损(E.0lson等，2007, Journal of B1logicalChemistry.，282:22939-22952)。T细胞、卵母细胞的发育或其它体内或外界压力造成DNA双链断裂引起的G2/M、S期检测点停滞均依赖于N-端FHA结构域的功能，而非ATM的磷酸化激活和 C-端区域的功能(S.Difilippanton1 等，2007，Journal of ExperimentalMedicine.，204:1003-1011)。
[0006]Nbsl的c.657del5突变导致表达:N端26KD蛋白片段(包括FHA-BRCT1，不能与其它蛋白相互作用)和翻译起始位点移位的70KD片段(有完整的MrelUATM的结合基序)(R.S.Maser 等，2001，Nature Genetics.，27:417-421)。这种不连续导致FHA-BRCT1-BRCT2介导的相互作用与Mre 11、ATM间的相互作用隔离(R.S.Wi 11 iams等，2009，Cell.，139:87-99)。而且使蛋白质不稳定和丰度降低，导致NBS病人具有离子射线敏感性和易发癌症(L.Kruger 等，2007，Carcinogenesis., 28:107-111 ；R.S.Maser 等,2001, Nature Genetics., 27:417-421)。已有体内数据表明:hNbslp70 可以与mMre 11、mRad50 (鼠源Mre 11和Rad50 )形成部分功能损伤的MRN复合物，对ATM及ATM下游信号通路的激活有一定程度的影响(S.Difilippanton1等，2005, Nature CellB1logy., 7:675-685) 。
[0007]已有体内外数据表明:Nbsl过表达或单倍不足均与肿瘤的发生率联系紧密。40-52%的晚期头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、肝癌和食管癌病人被检测出NBSl呈过表达状态。Nbsl杂合子敲除小鼠模型(Nbsl+/_)与野生型小鼠相比，肿瘤的自发率和Y-辐射诱导的肿瘤发生率都显著性提高(V.Dumon-Jones等，2003, Cancer Res, 63:7263-7269)。与对照组相比，NBSl过表达细胞系的克隆形成能力、迁移和入侵活性及恶性转化能力都显著性上升(Y.-C.Chen 等，2005，Journal of B1logical Chemistry, 280:32505-32511 ；C._Υ.Wu等，2011，Journal of B1medical Science, 18:1-6 ;M._H.Yang等，2006，ClinicalCancer Research, 12:507-515)。
[0008]比较已有的NBS疾病模型发现，虽暗示了 NBS细胞具有恶性增殖的倾向，但在人源化地模拟因Nbsl的突变(c.657del5)，导致肿瘤易发方面还有改进的空间(如模型不育、未用致癌剂诱导等)。
[0009]致癌性实验是药物临床前安全性评价中的重要内容，是为评价人体长期用药的致癌风险，以考察药物对动物的潜在致癌作用为主进行的实验研究(宋征等，2010，中国药理学与毒理学杂志.，6:557-561)。1997年，ICH的SlB发布了可采用遗传修饰小鼠模型作为临床前致癌性评价中大鼠长期致癌性实验附加试验的指导原则(Testing for carcinogenicity of pharmaceuticals[S], 1997, CurrentStep4versonl-7)。通过将致癌基因或抑癌基因转入(或敲除)而建立的5种遗传修饰小鼠模型(包括 CB6F「Tg RasH2、Tg.AC、C57BL/6 (N5) -Trp53+/\ Xpav' Xpa+/P53+/0 虽然有实验周期仅需24-26周、假阳性和假阴性的发生率较低等优点，但它们也普遍存在对基因毒性和非基因毒性致癌物的反应不一致、对鼠类致癌剂而非人类致癌剂区分界限不明显等缺陷(E.M.Agency, 2004, Evaluat1n of Medicines for Human Use, CPMP/SWP/2592/02Revl:1-12 ；J.MacDonald 等，2004，Toxicological Sciences.，77:188-194 ；J.B.Pritchard 等，2003，Environmental Health Perspectives, 111:444-454)。我国在利用遗传修饰动物进行致癌性评价领域，目前仍处于“四无”状态:无商业化动物模型可售，无技术标准可查，无关键技术可用，无背景数据可考(范昌发等，2009，实验动物科学，26:59-61)。
[0010]本申请将来源于人的Nbsle 657del5基因整合到小鼠基因组中，然后通过基因型鉴定、表达分析和回交繁殖建立了 3个稳定转基因系。以期通过致癌剂的诱导来筛选出具有理想短期致癌特点的人源化模型。本发明弥补了 NBS模型方面的空白，同时具有区分鼠类致癌剂而人类非致癌剂和在各个器官(含内分泌、生殖器官)的致癌敏感性上获得比较一致表型的潜力。有利于最终实现借助药物的化学结构信息、基因毒性实验(如Ames突变实验)、大鼠的2-年致癌性实验等其它体内外实验来充分且真实地预测待上市药物对人体致癌的潜在威胁(J.B.Pritchard等，2003，Environmental Health Perspectives, 111:444-454)。
【发明内容】
[0011]本发明的目的是提供基于BAC显微注射技术，产生可稳定表达不同水平NBSlpro的人源化转基因小鼠， 弥补现有NBS疾病模型的缺陷，并为药物临床前安全性评价中的短期致癌实验建立替代模型。
[0012]本发明的目的部分通过提供一种基因载体而实现。具体而言，本发明的基因载体含有人的Nbsr 657tte15基因，通过显微注射该基因载体、使之整合到小鼠基因组，产生人源Nbsl基因表达特征与内源Nbsl —致的转基因小鼠，进而使部分功能受损的NBSIp7q参与到影响染色体的稳定性、细胞周期检测点等相关信号通路中，提高细胞和个体恶性转化和癌变的概率。
[0013]本发明借助rpsl-neo反向筛选系统将Nbsl基因的大量上下游调控元件(如c_Myc介导的转录诱导结合位点，该位点位于Nbsl基因的转录起始位点上游493-439bp的启动子区和其第I个内含子中)与Nbsl的c.657del5突变串联起来，从而构建本发明的基因载体。
[0014]因此，本发明第一方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列含有人的Nbsla 657de15 基因。
[0015]在一【具体实施方式】中，所述多核苷酸含有Nbsl基因的上下游调控元件。
[0016]在一【具体实施方式】中，所述多核苷酸含有Nbsl及其上下游至少40kb、至少50kb、或至少60kb的DNA序列。在一【具体实施方式】中，所述多核苷酸序列长度在40-60kb的范围内。
[0017]在一【具体实施方式】中，所述多核苷酸序列还含有人源CALBl和DECRl。
[0018]在一【具体实施方式】中,所述多核苷酸序列是载体。
[0019]在一【具体实施方式】中，所述载体是BAC载体。
[0020]在一【具体实施方式】中，所述BAC载体是CH17-246C15。
[0021]本发明第二方面提供一种构建小鼠模型的方法，所述方法包括:
[0022](1)将本发明的BAC载体显微注射到小鼠受精卵的雄原核内，体外培育该受精卵至2细胞期后，移植入假孕受体输卵管内，获得Nbsl基因5’、3’端调控序列以及突变位点均为阳性的子代小鼠；和
[0023](2)将步骤(1)所得的子代小鼠分别与WT C57BL/6N品系小鼠进行回交，通过基因的自由组合与分离来获得稳定表达的转基因系。
[0024]在一【具体实施方式】中，所述方法还包括:筛选人源Nbsl呈不同水平转录的、且BAC载体上同时存在的CALBl和DECRl基本不表达的、稳定的Nbsle 657de15转基因系。
[0025]本发明还涉及Nbsle 657del5人源化转基因小鼠及其后代。
[0026]在一个实施方式中，Nbsr 657tte15人源化转基因小鼠及其后代采用本发明构建小鼠模型的方法获得。
[0027]在一个实施方式中，本发明的Nbsr 657de15人源化转基因小鼠及其后代表现为人源Nbsl呈不同水平转录、BAC载体上同时存在的CALBl和DECRl基本不表达、具有稳定的
NbsIa 657de15转基因特征。
[0028]在一个实施方式中，本发明的Nbsle 657del5人源化转基因小鼠及其后代中，人源Nbsl可以在胸腺、脾脏、睾丸、脑中较高水平地转录，在肝脏、肌肉、心脏、肾脏、肺脏和结肠中也可以被活跃地转录，其转录特征与内源Nbsl—致，可参与到相关功能的信号通路中。
[0029]在一个实施方式中，本发明的Nbsle 657del5人源化转基因小鼠及其后代中，NBSlp70在所述小鼠或其后代的胚胎期、成年期的胸腺组织、脾脏组织和激活的B细胞中表达；其表达水平接近内源NBSl或高于内源NBSl的表达水平。暗示人源Nbslp7tl在胎鼠和成年鼠的免疫器官中可代替部分内源的NBSl蛋白，影响DNA DSB引起的同源重组修复、非同源末端连接或细胞周期检测点等功能的正常发挥。
[0030]在一个实施方式中，本发明的Nbsr 657de15人源化转基因小鼠及其后代中，人源CALBl和DECRl基本不表达或表达水平非常微弱，基本可忽略。
[0031 ] 在一个实施方式中，本发明的NbsI657de15人源化转基因小鼠及其后代具有发育迟缓、体长均匀缩短和骨发育异常(如上肢或下肢脚趾弯曲)的表型，与临床上NBS病人的症状类似。
[0032]在一个实施方式中，本发明的Nbsle 657del5人源化转基因小鼠及其后代还可在长时间,例如至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或更长时间的生长期间内不发生自发肿瘤。
[0033]本发明也包括本发明Nbsr 657tte15人源化转基因小鼠或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物，所述小鼠后代、其细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物的特征是人源Nbsl呈不同水平转录的、且BAC载体上同时存在的CALBl和DECRl基本不表达的、以及具有稳定的Nb s Ia 657de15 转基因。
[0034] 本发明还涉及本发明多核苷酸序列，尤其是BAC载体，在构建Nbsle 657del5人源化转基因小鼠中的应用，包括用于制备构建Nbsr 657tte15人源化转基因小鼠用的物质中的应用。
[0035]本发明还涉及本发明的Nbsle 657del5人源化转基因小鼠及其后代、Nbsle 657del5人源化转基因小鼠或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物作为模型的用途，包括用于检测化合物在如下实验或疾病中的效果或用来研究可诱发下述疾病化合物的敏感性:药物临床前安全性评价；基因毒性和非基因毒性致癌物或抑癌物的广泛性检测；双链断裂修复失常与癌症或其它相关疾病发生的关系研究；免疫毒理学实验；发育障碍如头小畸形、发育迟缓；面部特征异常如前额退化、下颌骨退化、耳大、头发稀疏；骨发育异常如趾畸形、髋骨发育不良、骶骨发育不良；性发育障碍如卵巢早熟性发育不足、雄性不育；易反复感染如窦炎、肺炎；免疫缺陷如体液免疫缺陷、细胞免疫缺陷；脑发育异常如脑积水、大脑额叶发育不良；认知功能变差；皮肤异常如浅褐色斑点、白癜风斑点。
[0036]本发明也提供方法，所述方法包括给予本发明的Nbsr 657de15人源化转基因小鼠及其后代、Nbslc-657de15人源化转基因小鼠或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物某些物质、化合物、分子，例如化学物质、蛋白质、抗体、核酸分子等等，以检测和/或评价所述物质、化合物、分子等在如下实验或疾病中的效果或用来研究可诱发下述疾病化合物的敏感性:药物临床前安全性评价；基因毒性和非基因毒性致癌物或抑癌物的广泛性检测；双链断裂修复失常与癌症或其它相关疾病发生的关系研究；免疫毒理学实验；发育障碍如头小畸形、发育迟缓；面部特征异常如前额退化、下颌骨退化、耳大、头发稀疏；骨发育异常如趾畸形、髋骨发育不良、骶骨发育不良；性发育障碍如卵巢早熟性发育不足、雄性不育；易反复感染如窦炎、肺炎；免疫缺陷如体液免疫缺陷、细胞免疫缺陷；脑发育异常如脑积水、大脑额叶发育不良；认知功能变差；皮肤异常如浅褐色斑点、白癜风斑点。
[0037]特别地，本发明提供一种检测药物致癌性的方法，所述方法包括对本发明的Nbsr 657de15人源化转基因小鼠及其后代、Nbsr 657de15人源化转基因小鼠或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物施加所述药物；和检测所述Nbsr 657tte15人源化转基因小鼠及其后代、Nbsr 657de15人源化转基因小鼠或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物中与癌症发生、发展相关的因子的水平，从而确定该药物的致癌性。
[0038]本发明还包括来自本发明提供的Nbsr 657de15人源化转基因小鼠或其后代的细胞系或原代细胞培养物；组织或器官型切片培养物；组织外植体或器官外植体或其培养物；组织提取物或细胞提取物作为工具的用途，包括用于评定评定环境致癌因子(如电离辐射、核辐射和紫外辐射等污染物)的强度是否达到了致癌水平、分析人和鼠源Nbsl功能的一致和差异性、确定作用于NBS1p7°的化合物的特异性、研究NBSlpro或其他与NBS1p7°相关联细胞成分的核内转运和鉴定NBSlpro的未知配体。
[0039]本发明还提供评定环境致癌因子(如电离辐射、核辐射和紫外辐射等污染物)的强度是否达到了致癌水平的方法，所述方法包括:对本发明的Nbsr 657de15人源化转基因小鼠或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、组织提取物或细胞提取物施与所述环境致癌因子；检测所述Nbsr 657de15人源化转基因小鼠或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、组织提取物或细胞提取物的与癌发生相关的因子的水平；以及评价所述环境致癌因子(如电离辐射、核辐射和紫外辐射等污染物)的强度是否达到了致癌水平。
[0040]本发明构建了人源Nbsl基因中含5bp缺失突变的BAC载体，原核显微注射后，获得了人源Nbsl的表达特征与内源Nbsl —致的人源化转基因小鼠。人源NBSlp7tl可以在不同转基因系后代的胚胎期，成年期的胸腺、脾脏和激活的B细胞中表达。通过筛选不同的转基因系，获得了高表达和低表达人源Nbsl基因的3个稳定转基因系。在这3个稳定的转基因系中，BAC载体上同时存在的人源CALBl和DECRl基本不转录。经过表型统计发现，上述转基因小鼠在其中一个稳定低表达系中以一定比例出现了发育延迟、体长均匀缩短、骨发育异常的表型。本发明的有益结果在于:建立了一个新的NBS (奈梅亨破碎综合症)疾病小鼠模型。同时，部分功能受损的NBSlp7tl影响染色体的稳定性、细胞周期检测点等与癌症发生密切相关的信号通路，因此Nbsr 657tte15人源化转基因小鼠为药物临床前安全性评价中的短期致癌实验提供了有潜力的替代模型，也为癌症发生机理的研究提供了有效的工具。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1为BAC克隆的结构示意图。+表示:基因型鉴定的上下游引物所在的位置。
[0042]图2为利用rpsl-neo反向筛选系统进彳丁两步同源重组的基本原理不意图。
[0043]图3为测序峰值结果(上)和比对结果(下)，表明ACAAA5bp的缺失突变成功修饰在BAC载体上的人源Nbsl 基因c.657-661位点。
[0044]图4为Nbsle 657de15人源化转基因小鼠Founder的基因型鉴定图。BAC:作为阳性对照的BAC载体DNA，G:作为阴性对照的WT C57BL/6N小鼠的基因组DNA，hNbsl-5’:引物位于人源Nbsl基因的5’端调控序列，hNbsl-3’:引物位于人源Nbsl基因的3’端调控序列，hNbsl-M:引物位于人源Nbsl基因突变位点的附近，mNbsl:引物位于内源Nbsl编码序列中。
[0045]图5为在WT C57BL/6N和Nbs 1。_657de15人源化转基因小鼠中，人源Nbs I及内源Nbs I在10种组织中的转录情况RT-PCR结果图。L1:肝脏，Th:胸腺，Mu:肌肉，He:心脏，Br:大脑,Lu:肺，Co:结肠，K1:肾脏，Sp:脾脏，Te:睾丸，N:未加cDNA模板的阴性对照，hNbslm_5:引物位于突变位点的5’端，hNbslm-3’:引物位于突变位点的3’端，GAPDH:作为内参基因。
[0046]图6为在Nbsle 657de15人源化转基因小鼠后代的WT和转基因胎鼠中，人源NBSlp7tl及内源NBSl的表达情况Western blot结果图。27#FQ:胎鼠为转基因27#FQ与WT C57BL/6N回交第一代的阳性胚胎，1SN1:胎鼠为转基因1ftN1与WT C57BL/6N回交第二代的阳性胚胎，WT:胎鼠为基因型鉴定结果为阴性的胚胎，mNbsl:内源Nbsl，hNbslm:人源NBSlp'
[0047]图7为在成年的WT和Nbsle 657de15人源化转基因小鼠中，人源NBSlp7ci及内源NBSl在胸腺(A)、脾脏(B)和激活的B细胞(C)中的表达情况Westernblot结果图。
[0048]图8为在成年WT和I个稳定高表达、2个稳定低表达的Nbsle 657de15人源化转基因小鼠中，人源Nbsl及内源Nbsl的转录水平Real-time PCR结果图。20#TG:稳定高表达的转基因系，“22#TG”和“94#TG”分别代表2个稳定低表达的转基因系，WT:WT C57BL/6N小鼠作为阴性对照。
[0049]图9为在成年WT和I个稳定高表达、2个稳定低表达及I个作为阳性对照的Nbsle 657del5人源化转基因小鼠中，人源CALBl和DECRl的转录情况Real-time PCR结果图。3#TG:人源CALBl和DECRl转录水平较高的阳性对照转基因系。
[0050]图10为同窝4周龄雄性WT C57BL/6N (左)和NbsIe 657de15人源化转基因小鼠(右)的发育迟缓表型的代表图。
【具体实施方式】
[0051]本发明的多核苷酸序列含有人的Nbsle 657del5基因。人Nbsl基因的Genbank登陆号为 NG_008860。
[0052]本文中，人Nbsle 657del5基因指缺失cDNA第657-661位点共5个碱基(即ACAAA)的人的Nbsl基因。
[0053]本发明的多核苷酸序列为分离的多核苷酸序列。术语“分离的”意味着所指的分子从发现该分子天然存在的整个生物体中分离和分开，或基本不存在其它相同类型的生物大分子。术语“分离”对于多核苷酸序列是指一种核酸分子，它完全或部分缺乏与其天然结合的序列；或一条序列，因为它天然存在，但具有与其结合的异源序列；或从染色体分离的分子。
[0054]本发明的多核苷酸序列优选为基因载体，其含有Nbsl基因的上下游调控元件，例如，含有Nbsl及其上下游至少40kb、至少45kb、至少50kb、或至少55kb的DNA序列。通常，所述多核苷酸序列长度可在40-60kb的范围内。
[0055]本发明的基因载体可以是例如BAC载体。BAC载体可从市售途径获得，例如购自Children’ s Hospital Oakland Research Institute (BACPAC Resource at CHORI)? 如本文所述，可借助rpsl-neo反向筛选系统进行两步同源重组，在BAC载体上造成上述5bp的缺失，从而构建得到本发明的载体。
[0056]在一具体实施例中，载体构建可如下进行:
[0057]1.扩增含有rpsl-neo的同源片段用于反向筛选，合成含点突变的同源序列并退火获得双链；和
[0058]2.将可发挥同源重组功能的PSM18质粒电转入BAC载体的宿主菌，然后采用rpsl-neo反向筛选系统进行两步同源重组，将5bp缺失突变制作在BAC载体的目的位置(见图1)。
[0059]此外，还可实施PCR和测序来验证所构建的BAC载体修饰是否正确，以及在已修饰好的BAC载体上随机选择10个500bp左右的片段进行测序验证BAC载体内部未发生大片段同源重组。
[0060]获得本发明的BAC载体后，可将过柱纯化。使用时可先稀释。
[0061]进行显微注射的BAC载体上除完整的Nbsl的序列外还存在CALBl和DECRl的完整序列。由于转基因在随机插入的过程中会发生断裂和部分片段的丢失，因此可通过Genotyping和Real-time PCR来筛选CALBl和DECRl未插入或基本不表达、但目的基因可表达的转基因系来进行深入研究。
[0062]阳性Founder小鼠的筛选和后代的繁殖可如下进行:
[0063]1.将本发明的BAC载体显微注射到小鼠受精卵的雄原核内，之后将体外培养到2细胞期的胚胎，移植入假孕受体输卵管内；
[0064]2.使用分别对应于位于Nbsl基因-5’、3’端调控序列和突变位点附近的3对特异性引物鉴定基因型，三阳性的小鼠称为Founder ；
[0065]3.将每只Founder分别与WT C57BL/6N品系小鼠进行回交，通过基因的自由组合与分离来获得稳定表达的转基因系，即本发明的人源Nbsr 657tte15转基因小鼠。
[0066]在一具体实施例中，对应于位于Nbsl基因_5’、3’端调控序列和突变位点附近的3对特异性引物选自SEQ ID NO:27-32ο
[0067]本发明也涉及SEQ ID NO:27_32和/或本文所公开的其它引物中的一条或任意多条的组合在构建、筛选和鉴别本发明的阳性Founder小鼠或在构建、筛选和鉴别本发明Nbslc-657de15转基因小鼠及其后代中的应用。
[0068]进一步地，可采用以下的方法来分析Nbsle 657del5转基因小鼠中人源Nbsl的转录特征及NBSIp7q的表达情况:
[0069]1.分别提取WT和不同转基因系鼠中10个组织的RNA，进行RT-PCR，检测人源Nbsl在不同组织中的转录特征。
[0070]2.分别提取WT和不同转基因系的后代胎鼠蛋白，进行Western blot，检测NBSIp7q在转基因小鼠胚胎期的表达情况。
[0071]3.分别提取W T和不同转基因系小鼠的胸腺，脾脏和激活的B细胞中的蛋白，进行Western blot，检测NBSlp7tl在成年转基因小鼠免疫器官中的表达情况。
[0072]最后，筛选人源Nbsl呈不同水平转录的、且BAC载体上同时存在的CALBl和DECRl基本不表达的，稳定的Nbsr 657tte15转基因系，并对相关的表型进行统计，包括:
[0073]1.分别提取不同转基因系小鼠的RNA，反转录后进行Real-time PCR，分析并筛选出可稳定转录人源Nbsl的转基因系。
[0074]2.通过Real-time PCR检测筛选出的转基因系中，人源CALBl和DECRl的转录情况。
[0075]3.统计这几个系中，发育迟缓、体长均匀缩短、骨发育异常等NBS疾病相关症状的表型出现率。
[0076]本发明的Nbsr 657de15人源化转基因小鼠指转化了人Nbsr 657de15基因且稳定表达人Nbsr_657de15基因的小鼠。
[0077]本发明的Nbsr 657de15人源化转基因小鼠及其后代具有以下一种或多种特征:
[0078](I)人源Nbsl呈不同水平转录；
[0079](2) BAC载体上同时存在的CALBl和DECRl基本不表达，或表达水平非常微弱，基本可忽略；
[0080](3)具有稳定的Nbsr 657de15转基因特征；
[0081](4)人源Nbsl可以在胸腺、脾脏、睾丸、脑中较高水平地转录，在肝脏、肌肉、心脏、肾脏、肺脏和结肠中也可以被活跃地转录，其转录特征与内源Nbsl—致，可参与到相关功能的信号通路中；
[0082](5)NBS1P7°在所述小鼠或其后代的胚胎期、成年期的胸腺组织、脾脏组织和激活的B细胞中表达；其表达水平接近内源NBSl或高于内源NBSl的表达水平；
[0083](6)具有发育迟缓、体长均匀缩短和骨发育异常(如上肢或下肢脚趾弯曲)的表型，与临床上NBS病人的症状类似；
[0084](7)在长时间，例如至少I个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或更长时间的生长期间内不发生自发肿瘤。
[0085]本发明包括本发明Nbsr 657de15人源化转基因小鼠或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物，所述小鼠后代、其细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物的特征是人源Nbsl呈不同水平转录的、且BAC载体上同时存在的CALBl和DECRl基本不表达的、以及具有稳定的Nb s Ia 657de15 转基因。
[0086]本发明中，来自所述Nbsr 657de15人源化转基因小鼠或其后代可以是具有分化功能的干细胞，也可以是体细胞。所述细胞培养物可以是干细胞培养物，也可以是体细胞培养物。所述组织或器官可以是各种组织器官，包括但不限于胚胎、胸腺、脾脏、睾丸、脑、肝脏、肌肉、心脏、肾脏、肺脏和结肠等。
[0087]下文将以具体实施例的方式产生本发明。应理解，除非另有说明，否则所采用的方法、条件、试剂等都是本领域常规的技术手段。
[0088]实施例
[0089]实施例1:人源BAC克隆的查询、订购和PCR鉴定。
[0090]通过搜索Ensemble Genome Browser来确定Nbsl及其上下游至少50kb的DNA序列在染色体上的区域，并将其它基因的存在降到最低，从NCBI Clone DB中筛选出编号为CH17-246C15的人源BAC克隆符合条件(见图1)。订购的BAC克隆(CHORI)保存在DHlOB的宿主细胞中，以琼脂为载体邮寄过来。将该菌种划线培养，接种后扩增培养。然后使用位于c.657del5突变位点5’、3’的2对特异性引物对购回的BAC菌种进行菌液PCR鉴定，引物序列如下:
[0091]hNbsl-657tF:TGTCACCTGCCACCATATTTCTAG (SEQ ID NO:1)
[0092]hNbsl-657tR:CCGTAATCACAGCCATGATCACT (SEQ ID NO:2)
[0093]PCR 扩增条件:94°C 5min，35* (94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 30sec),72°C 5min,4°C保温(dNTP、Mg2+、Taq酶、10*buffer均购自博彩)。产物片段为494bp，鉴定结果表明BAC克隆正确。
[0094]实施例2:基因载体的构建
[0095]步骤一、以pRpsl-neo质粒(由南京大学模式动物研究所载体组惠赠)为模板，通过 PrimeSTAR 高保真性 PCR (TaKaRa)获得 rpsl-neo 片段，其包含:1319bp 的 rpsl-neo,c.657del5突变位点5’端61bp同源臂(l_hm)和其3’端61bp同源臂(r_hm)。引物序列如下:
[0096]hNbsl-657hF:CTCTTGATGAACCATCTATTGGAAGTAAAAATGTTGATCTGTCAGGACGGCAGGAAAGAAAGGCCTGGTGATGATGGCGGGATCG (SEQ ID NO:3)
[0097]hNbsl-657hR:TTAGCTTATAACATAATTACCTGTTTGGCATTCAAAAATATAAATGTTTTCCCTTTGAAGATCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG (SEQ ID NO:4)
[0098]PCR 扩增条件:95 °C 5min，5* (98 °C 15sec，55 °C 15sec，72 °C 2min)，26*(98°C 15sec，65°C 15sec，72°C 2min)，72°C 5min，4°C保温。产物片段为 1441bp，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收(B1Flux)并确定回收产物浓度。
[0099]步骤二、人工合成携带突变的序列，其包含引入的c.657del5缺失突变、突变位点5’端51bp同源臂(1-hm)和其3’端51bp同源臂(r_hm)。合成的序列如下:
[0100]hNbsl-657mF:ACCATCTATTGGAAGTAAAAATGTTGATCTGTCAGGACGGCAGGAAAGAAATCTTCAAAGGGAAAACATTTATATTTTTGAATGCCAAACAGGTAATTATGT (SEQ ID NO:5)
[0101]hNbsl-657mR:ACATAATTACCTGTTTGGCATTCAAAAATATAAATGTTTTCCCTTTGAAGATTTCTTTCCTGCCGTCCTGACAGATCAACATTTTTACTTCCAATAGATGGT (SEQ ID NO:6)
[0102]将20ull0uM的上述序列混合，95°C变性lOmin，室温退火2h，形成双链。
[0103]步骤三、制作BAC宿主菌的电转感受态，转入PSM18质粒(由南京大学模式动物研究所载体组惠赠，也可使用其它已知的用于同源重组的质粒，例如pSC101-BAD-gbaA质粒)，用具有 Hygromycin B (150ug/ml,溶于 MilliQ 水，上海生工)、Chloramphenicol (50ug/ml，溶于无水乙醇，上海生工)的LB平板筛选，并用特异性引物pSiml8-F/pSiml8-R (由南京大学模式动物研究所载体组惠赠，或可根据所使用的用于同源重组的质粒的序列设计其特异性引物)进行菌落PCR鉴定。PCR扩增条件-MV 5min，28* (94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 30sec)，72°C 5min，4°C保温。产物片段约为 550bp。
[0104]制作已含pSM18质粒的BAC宿主菌电转感受态，转入rpsl-neo片段，用具有Kanamycin (50ug/ml，溶于MilliQ水，上海生工)、C+的LB平板筛选，并用特异性Nbsl-657tF/Nbsl-657tR(序列同“实施例1”)进行菌落PCR鉴定。PCR扩增条件:94°C 5min，28* (94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 2min)，72°C 5min，4°C保温。产物片段为 1809bp。然后将K+、C+并PCR鉴定正确的菌株在K+、Streptomycin (50ug/ml，溶于Mi 11 iQ水，上海生工)LB平板上划线验证菌株对链霉素敏感。
[0105]制作已完成第一步同源重组的BAC宿主菌电转感受态，转入携带突变的合成片段，用S+、C+抗性的LB平板筛选，并用Nbsl-657tF/Nbsl-657tR (序列同“实施例1”)进行菌落 PCR 鉴定。PCR 扩增条件:94°C 5min，28* (94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 30sec),72°C 5min，4°C保温。产物片段为490bp。然后将S+、C+并PCR鉴定正确的菌株在K+C+LB平板上划线验证菌株失去卡那霉素抗性。
[0106]将已完成第二步同源重组的菌株，用Nbsl-657tF/Nbsl_657tR(序列同“实施例1”)进行 PrimeSTAR 高保真性 PCR。PCR 扩增条件:94°C 5min，35* (98 °C 15sec，55°C 15sec,72°C 30sec), 72°C 5min,4°C保温。回收PCR产物、送与上海invitrogen公司测序,验证BAC修饰成功(见图3)。
[0107]以上步骤的原理为利用rpsl-neo反向筛选系统进行两步同源重组(见图2)。更详细的实验操作步骤可以参考 Counter-Select1n BAC Modificat1n KitCGene Bridges)。
[0108]步骤四、将修饰正确的BAC宿主菌于37°C培养，通过菌落或菌液PCR筛选pSM18质粒完全丢失的菌株(PSM18质粒在30°C以上复制终止，随着分裂而丢失)。并再次测序证实在37°C培养的过程中目的位置未引入其它突变(Invitrogen，结果与图3相同)。
[0109]步骤五、获得修饰正确且完全丢失pSM18质粒的BAC宿主菌后，随机选择10个500bp左右的片段测序，结果与NCBI的序列信息一致，表明BAC载体正确且内部未发生大片段同源重组。10对引物的序列信息如下:
【权利要求】
1.一种多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列含有人Nbsl及其上下游长40 —60kb的序列，其中，所述人Nbsl基因为人Nbsr 657d615基因。
2.如权利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列为BAC载体。
3.权利要求1或2所述的多核苷酸序列在制备构建Nbsr657tte15人源化转基因小鼠及其后代用的物质中的用途。
4.一种细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、或组织提取物或细胞提取物，其特征在于， 所述细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物来自经权利要求2所述的BAC载体转基因的Nbslc-657de15人源化转基因小鼠或其后代；和 所述细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物的特征是人源Nbsl呈不同水平转录的、且BAC载体上同时存在的CALBl和DECRl基本不表达的、以及具有稳定的Nbsle 657de15转基因。
5.如权利要求4所述的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、或组织提取物或细胞提取物，其特征在于，所述Nbsr 657tte15人源化转基因小鼠或其后代具有以下一种或多种特征: (1)人源Nbsl呈不同水平转录； (2)BAC载体上 同时存在的CALBl和DECRl基本不表达，或表达水平非常微弱，基本可忽略； (3)具有稳定的Nbsr_657de15转基因特征； (4)人源Nbsl在胸腺、脾脏、睾丸、脑中高水平地转录，在肝脏、肌肉、心脏、肾脏、肺脏和结肠中被活跃地转录，其转录特征与内源Nbsl —致，参与到相关功能的信号通路中； (5)NBS1P70在所述小鼠或其后代的胚胎期、成年期的胸腺组织、脾脏组织和激活的B细胞中表达；其表达水平接近内源NBSl或高于内源NBSl的表达水平； (6 )具有发育迟缓、体长均匀缩短和骨发育异常(如上肢或下肢脚趾弯曲)的表型，与临床上NBS病人的症状类似；和 (7)在至少12个月的生长期间内不发生自发肿瘤。
6.权利要求4或5所述的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、或组织提取物或细胞提取物的用途，包括用于检测化合物在如下实验或疾病中的效果或用来研究可诱发下述疾病化合物的敏感性， 其中，所述实验选自:药物临床前安全性评价；基因毒性和非基因毒性致癌物或抑癌物的广泛性检测；双链断裂修复失常与癌症或其它相关疾病发生的关系研究；免疫毒理学实验； 所述疾病选自:发育障碍，如头小畸形、发育迟缓；面部特征异常，如前额退化、下颌骨退化、耳大、头发稀疏；骨发育异常，如趾畸形、髋骨发育不良、骶骨发育不良；性发育障碍，如卵巢早熟性发育不足、雄性不育；易反复感染，如窦炎、肺炎；免疫缺陷，如体液免疫缺陷、细胞免疫缺陷；脑发育异常，如脑积水、大脑额叶发育不良；认知功能变差；皮肤异常，如浅褐色斑点、白癜风斑点。
7.权利要求4或5所述的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、或组织提取物或细胞提取物的用途，包括用于评定环境致癌因子(如电离辐射、核辐射和紫外辐射等污染物)的强度是否达到了致癌水平、分析人和鼠源Nbsl功能的一致和差异性、确定作用于NBSlpro的化合物的特异性、研究NBSlp7tl或其他与NBS1p7°相关联细胞成分的核内转运和鉴定NBS1p7°的未知配体。
8.—种构建小鼠模型的方法，所述方法包括: (1)将权利要求2所述的BAC载体显微注射到小鼠受精卵的雄原核内，体外培育该受精卵至2细胞期后，移植入假孕受体输卵管内，获得Nbsl基因5’、3’端调控序列以及突变位点均为阳性的子代小鼠；和 (2)将步骤(1)所得的子代小鼠分别与WTC57BL/6N品系小鼠进行回交，通过基因的自由组合与分离来获得稳定 表达的转基因系。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括:筛选人源Nbsl呈不同水平转录的、且BAC载体上同时存在的CALBl和DECRl基本不表达的、稳定的Nbsle 657de15转基因系。
10.采用权利要求8或9所述的方法构建得到的Nbsr657de15人源化转基因小鼠及其后代。
【文档编号】C12N5/10GK104046644SQ201310082116
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年3月14日 优先权日:2013年3月14日
【发明者】魏勤, 徐平 申请人:中国科学院上海生命科学研究院