专利名称：人源重建鼠模型及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及组织工程移植物或其材料的免疫原性，尤其涉及一种人源重建 鼠模型及其在检测组织工程移植物或其材料的免疫原性中的应用。
背景技术：
干细胞具有自我更新和多向分化性，再生医学与组织工程也尝试运用干细 胞来构建修复缺损病变的组织与器官，因此需要充沛、稳定、安全的种子细胞 来源。
胚胎千细胞具有的全能分化特性给再生医学带来了曙光，但是胚胎干细胞 由于伦理学的限制使得来源有限，而且由于潜在致瘤性以及调控机制的尚未明 了，使得应用也受到很大的限制。成体干细胞作为一种新的干细胞来源，也具 有多向分化的特性并且来源广泛，文献报道在人体的几乎所有器官都发现并分 离了干细胞。无疑成体干细胞是具有巨大临床应用潜能的种子细胞。
目前异体成体干细胞作为组织工程的种子细胞已经成为世界各国的研究 热点。但是对于人的异体千细胞的免疫原性研究多停留在体外实验，体内研究 较少。原因在于动物模型不完善，而对于临床应用，确定人体来源细胞或者组
织在体内是否激发免疫应答，更为重要的依赖于基于动物模型的体内6'" 实验。
因此，本领域迫切需要提供一种可以检测来自异体的干细胞作为种子细胞 构建的组织工程移植物的免疫原性的动物模型，以及相应的检测方法。
发明内容
本发明旨在提供一种建立人源重建鼠的方法。
本发明的另一个目的是提供一种检测组织工程移植物的免疫原性的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种建立人源重建鼠的方法，所述的方法包括步 骤..给免疫缺失的鼠施用人外周血单个核细胞(PBMC)。在另一优选例中，所述的免疫缺失的鼠是非肥胖型糖尿病鼠与重症联合免疫
缺陷鼠反交鼠(NOD-SCID)。
在另一优选例中，施用40 —200"06个人外周血单个核细胞。 在另一优选例中，施用60—150xl()6个人外周血单个核细胞。 在另一优选例中，通过腹腔注射施用人外周血单个核细胞。
在本发明的第二方面，提供了一种检测组织工程移植物的免疫原性的方法， 所述的方法包括步骤-
(a) 将人外周血单个核细胞施用于免疫缺失的鼠，得到人源重建鼠；
(b) 给予该人源重建鼠组织工程移植物；和
(c) 检测该人源重建鼠的体液和/或细胞免疫水平。
在另一优选例中，所述的组织工程移植物的种子细胞为人骨髓基质干细胞和/ 或人成体干细胞；更佳地，来自于异体的人骨髓基质干细胞和/或人成体干细胞。
在另一优选例中，所述的免疫缺失的鼠是非肥胖型糖尿病鼠与重症联合免疫 缺陷鼠反交鼠(NOD-SCID)。
在另一优选例中，施用40 — 200><106个人外周血单个核细胞；更佳地，施用 60—150xl(T个人外周血单个核细胞。
在另一优选例中，通过腹腔注射施用人外周血单个核细胞。
据此，本发明提供了一种可以检测来自异体的干细胞作为种子细胞构建的 组织工程移植物的免疫原性的动物模型，以及相应的检测方法。
图l显示了 NOD-SCID鼠体液及细胞免疫水平检测的结果；其中，
A为NOD-SCID鼠血清IgG水平，B为NOD-SCID鼠脾脏细胞CD3+CD4+/CD3+CD8+
数量比与C57的比较。
图2显示了人源化NOD-SCID鼠体内观察人-CD4+、人-CD8+的变化情况；
其中，
A为人源化鼠外周血及脾脏CD4/CD8数量比例，B为人源化鼠外周血及脾 脏流式。
图3显示了人源鼠植入皮肤局部炎性细胞明显浸润的情况；其中，A为1周取材的情况，B为4周取材的情况。
图4显示了利用人源化N0D-SCID小鼠体内植入各种材料后的的病理检查 结果；其中
A中的箭头所示炎性细胞浸润的情况，Al是细胞加材料植入一周的情况， A2是细胞加材料植入四周的情况；B、 C中箭头是细胞与材料骨架，B是材料植 入一周的情况，C是硅胶(材料)植入四周的情况。
具体实施例方式
发明人经过广泛而深入的研究，发现将PBMC施用于NOD-SCID鼠可以建立 人源化N0D-SCID小鼠，通过该人源化NOD-SCID小鼠可以检测组织工程移植物 的免疫原性，尤其是可以对将来自于异体的干细胞作为种子细胞的移植物进行 其免疫原性的体内评估，从而为其进一步的临床应用奠定基础。
如本文所用，术语"PBMC"是人外周血单个核细胞，即Peripheral Blood Mononuclear Cell。外周血单核细胞包括单核细胞和淋巴细胞，一般外周血单 个核细胞分离出来贴壁几个小时后，贴壁的就是单核细胞，非贴壁的就是淋巴 细胞。可以使用本领域熟知的方法分离、保存PBMC，也可以通过商业渠道获得。
如本文所用，术语"NOD-SCID" 、 "NOD-SCID鼠"或"NOD-SCID小鼠" 可以互换使用，都是指非肥胖型糖尿病鼠与重症联合免疫缺陷鼠反交鼠。可以 通过本领域技术 人员熟知的商业渠道获得。
如本文所用，术语"人源重建鼠"或"人源化NOD-SCID小鼠"可以互换 使用，都是指NOD-SCID在施用PBMC后形成的体内带有PBMC并重新获得免疫 能力的小鼠。
如本文所用，术语"组织工程移植物"是指将体外培养扩增的正常组织细 胞(即种子细胞)吸附于一种具有优良细胞相容性并可被机体降解吸收的生物 材料上形成的复合物。所述的种子细胞是干细胞和/或体细胞，优选干细胞。所 述的干细胞是骨髓基质干细胞和/或成体干细胞，优选成体干细胞，更优选人成 体干细胞。所述的人成体干细胞来自于自体或异体，优选自于异体。
如本文所用，术语"组织工程材料"、"生物可降解材料"或"具有细胞 相容性并可被机体降解吸收的生物材料"可互换使用，都是指医学上可接受的 生物可降解材料，包括(但并不限于)(a) 可降解性合成高分子材料，例如聚a-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基 乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮 (polyphosphazenes)、 聚氨基酸(polyamino acid)、 假聚氨基酸 (pesudo—polyamino acid)、 聚原酸酉旨(polyorthoesters)、 聚酉旨尿院 (polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚对二氧六 环酮(polydioxanone)等；
(b) 天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖 (glycosaminoglycan， GAGs)、壳聚糖(chitosan)、 甲壳素(chitin)、海藻酸
盐、藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质；
(c) 可注射性材料，如Pluronic(—种市售的聚环氧乙丙烯商品)、藻酸钙 凝胶等；
(d) 上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合 材料，以及固体材料与可注射性材料的复合材料。
在本发明的方法中，首先是制备人源化N0D-SCID小鼠的动物模型，即将 PBMC施用于N0D-SCID。施用方法没有特别限制，优选的方法包括(但不限于) 腹腔注射、静脉注射、肌肉注射等，更优选腹腔注射。
在本发明的方法中，其次是检测组织工程移植物的免疫原性的方法，所述 的方法包括步骤(a)将人外周血单个核细胞施用于鼠，得到人源重建鼠； (b)给予该人源重建鼠组织工程移植物；和(C)检测该人源重建鼠的体液和
/或细胞免疫水平。为了更好地进行比较，宜设置用于比较的对照组，包括阳 性对照和阴性对照。通常，阳性对照是给予人源重建鼠哺乳动物的皮肤，优选
人的皮肤；阴性对照是给予单纯组织工程材料，优选硅胶。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所 揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何 可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特 征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于
1、首次建立了人源化NOD-SCID小鼠的动物模型。
62、首次通过所建立的人源化N0D-SCID小鼠动物模型检测组织工程移植物 的免疫原性，具有优良的体内评估价值。
下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
建立人源化NOD-SCID小鼠
材料和方法 1、材料
1. 1动物、细胞
NOD-SCID鼠购自中国军事医学科学院动物中心 PBMC购自上海市血液中心 干细胞购自上海市组织工程重点实验室 1.2试剂和仪器
细胞基础培养液RPMI1640(美国Hyclone公司) Cellquest software 96孔培养板(美国BD公司) 离心机(美国Sigma公司) 淋巴细胞分离液(挪威Lymphopr印)。
2、 方法
2. 1人PBMC的分离
首先血站成分血1: 5生理盐水(N.S)稀释；然后用淋巴细胞分离液Ficoll (密度1.077，上海试剂二厂)稀释血液(2: 1) ， 2000r/m离心20分钟，温
7度控制在18 — 20'C，吸出分离层交界处的白毛层，N.S洗涤2次，计数，待用。 2.2 NOD-SCID鼠腹腔注射(ip) 80—100X 106PBMC。
统计学分析
本发明实验数据采用SPSS软件分析。两样本均数的比较采用t检验， 代O. 05差异有显著性。
结果
NOD-SCID鼠体液免疫、细胞免疫的缺失
为了保证人源重建鼠模型的成功构建，我们首先检测了所采用NOD-SCID 小鼠本身的免疫系统状况。我们对NOD-SCID鼠血清IgG水平以及脾脏淋巴细 胞进行检测，检测野生型(wild type, wt)与NOD-SCID IgG水平的吸光度值 (0. D)白色柱、黑色柱分别代表wt与NOD-SCID血清的O. D值，NOD-SCID鼠 外周IgG ELISA吸光度的值在0.25左右而野生型C57BL/6J鼠血清吸光度在 1.00左右，两者有显著性差异(; =0.0036)(图1A) 。 C57 CD3+CD8+所占比 例为19% (图IB上左)CD3+CD4+所占比例为45% (图IB上右)，NOD-SCID鼠 CD3+CD4+所占比例为0. 48%(图IB下左)，CD3+CD8+所占比例为0. 57% (图IB 下右)，以上结果证明该鼠免疫系统是完全缺失的。
实施例2
组织工程移植物免疫原性检测
材料和方法 1、材料
1.1动物、细胞
NOD-SCID鼠购自中国军事医学科学院动物中心
PBMC购自上海市血液中心
干细胞购自上海市组织工程重点实验室
1.2试剂和仪器
细胞基础培养液RPMI1640(美国Hyclone公司) Cellquest software96孔培养板(美国BD公司) 离心机(美国Sigma公司) 淋巴细胞分离液(挪威Lymphopr印)。 2、方法
2. 1人PBMC的分离
首先血站成分血1: 5生理盐水(N. S)稀释；然后用淋巴细胞分离液Ficoll (密度1.077，上海试剂二厂)稀释血液(2: 1) , 2000r/m离心20分钟，温 度控制在1 一2(TC，吸出分离层交界处的白毛层，N.S洗涤2次，计数，待用。 2.2 NOD-SCID鼠腹腔注射(ip) 80—100X 106PBMC。
2.3于接种人PBMC的次日，接种人皮肤于各种材料无菌手术小鼠背部皮 肤钝性分离皮肤，接种人皮肤以及各种材料。
2.4分别在1周、2周、3周、4周4个时间点取出植入的材料，进行组织 化学染色；每周取材的同时小鼠剪尾取血，FACS (BD Calibur美国)流式细 胞仪检测人和小鼠CD4/CD8 (CD3-APC(画se)/CD3-PE (human) 、 CD4-FITC、 CD8-PE (mouse) /CD8-PE-Cy5 (美国BD Pharmingen公司)，最后一次取材的 时候，处死人源化N0D-SCID小鼠，取脾脏细胞进行FACS检测人CD4/CD8。
统计学分析
本发明实验数据采用SPSS软件分析。两样本均数的比较采用t检验， 代0.05差异有显著性。
结果
1、 材料植入后重建鼠体内人PBMC的动态变化
植入各种材料后，留取外周血检测不到人CD4/8 (1、 2、 3、 4周)(图2A: 标注为PBL，图2B:上左与上右所示)，4周时，检测外周血的同时处死小鼠， 取脾脏并分离单个核细胞检测。
结果表明，脾脏细胞中可以检测到人CD4/CD8细胞，但是所占比例有较明 显的个体差异(图2A: SP所示；图2B:下左及下右所示)。
2、 异体人皮肤移植局部见明显免疫细胞浸润
植入人源鼠的异体皮肤在1周、4周经取材，病理H&E染色，见真皮下层 有明显炎性细胞浸润(图3A、 B箭头所示)3、异体干细胞的组织工程材料植入局部无明显的免疫细胞浸润 在人源鼠体内，对于覆有干细胞的组织材料，病理结果未见炎性细胞浸润
(图4A， Al、 A2箭头所示)，而对于单纯材料和硅胶在植入后的病理检查也 未见炎性细胞的浸润(图4B和图4C箭头所示)。
结果表明，利用N0D-SCID构建的人源鼠是一种很好的体内实验模型用来 研究移植物在体内的免疫原性的变化。
本发明的初步结果，说明异体来源的成体干细胞可以作为组织工程的种子 细胞。
讨论
免疫原性是限制异体移植和种子库的关键，利用构建的人源化鼠可以在体 内观察研究移植物包括目前干细胞构建的组织工程材料的免疫原性的动态变 化过程。
人源鼠模型的构建，能够在体内观察更为真实的移植物与宿主的免疫应答 反应，本发明实验结果说明在4周的观察周期内重建鼠体内仍旧存在人的PBMC。 本发明实验结果表明利用NOD-SCID重建的人源化鼠在脾脏存在人的PBMC，并 且具有一定时相(4周)。表明本方法建立的人源鼠可以模拟体内细胞免疫， 观察移植物的免疫原性。
在不同的时间点取回植入的组织工程材料，进行病理组织化学检测，同时 留取血液样品(第4周同时取脾脏)流式检测。因为病理阳性对照植入皮肤局 部发现了炎性细胞的浸润，干细胞加材料和单独材料未见炎性细胞浸润，以上 结果首先说明输入N0D-SCID体内的人PBMC仍旧可以识别异己抗原并行使免疫 清除的功能，植入的异体皮肤真皮下层有残留的白细胞，也称为过路细胞。其 中的树突细胞和巨噬细胞，两者均高表达MHC-II分子和包括B7在内的多种分 子。异体皮肤植入人源鼠后，其表面的MHC-II类分子以及MHC-II类分子复合 物可以不经受者的APC处理直接为受者的CD4细胞识别，继而发生免疫细胞的 活化和炎性细胞的浸润，最终导致移植物的排斥。而对于不同组织材料组的结 果说明实验中所采用的空材料支架，免疫原性低下，人源鼠对其不识别；用成 体干细胞构建的细胞加材料人源鼠同样也无法识别，说明成体干细胞作为种子 细胞的组织工程材料保持了成体干细胞的低免疫原性，人源鼠对其不识别。
10以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
权利要求
1.一种建立人源重建鼠的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤给免疫缺失的鼠施用人外周血单个核细胞(PBMC)。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的免疫缺失的鼠是非肥胖型 糖尿病鼠与重症联合免疫缺陷鼠反交鼠(NOD-SCID)。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，施用40—200xl(/个人外周血单个 核细胞。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，施用60—150xK)6个人外周血单个 核细胞。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过腹腔注射施用人外周血单个 核细胞。
6. —种检测组织工程移植物的免疫原性的方法，其特征在于，所述的方法包 括步骤(a) 将人外周血单个核细胞施用于免疫缺失的鼠，得到人源重建鼠；(b) 给予该人源重建鼠组织工程移植物；和(c) 检测该人源重建鼠的体液和/或细胞免疫水平。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的组织工程移植物的种子细 胞为人骨髓基质干细胞和/或人成体干细胞；优选来自于异体的人骨髓基质干细胞和/或人成体干细胞。
8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的免疫缺失的鼠是非肥胖型 糖尿病鼠与重症联合免疫缺陷鼠反交鼠(NOD-SCID)。
9. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，施用40—200><106个人外周血单个 核细胞；优选施用60—150><106个人外周血单个核细胞。
10. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，通过腹腔注射施用人外周血单个 核细胞。
全文摘要
本发明公开了人源重建鼠模型及其应用。本发明公开了一种建立人源重建鼠的方法，所述的方法包括步骤给免疫缺失的鼠施用人外周血单个核细胞(PBMC)。本发明还公开了一种检测组织工程移植物的免疫原性的方法，所述的方法包括步骤(a)将人外周血单个核细胞施用于免疫缺失的鼠，得到人源重建鼠；(b)给予该人源重建鼠组织工程移植物；和(c)检测该人源重建鼠的体液和/或细胞免疫水平。
文档编号A61B19/00GK101653377SQ20081004184
公开日2010年2月24日 申请日期2008年8月19日 优先权日2008年8月19日
发明者刘枚华, 焱 王 申请人:杭州万明生物科技有限公司