人源化的通用轻链小鼠的制作方法

人源化的通用轻链小鼠的制作方法
【专利摘要】本申请提供了一种小鼠、组织、细胞和遗传物质，其包括人源化的重链免疫球蛋白基因座、表达通用轻链的人源化的轻链基因座和编码ADAM6或其直系同源物或同系物或功能性片段的基因。本申请提供了一种小鼠，其表达包括人可变结构域的人源化的重链，并且其表达包括人可变结构域的人源化的轻链，其中所述轻链衍生自不超过一个，或不超过两个轻链V和J或重排的V/J序列。本申请提供了表达具有通用轻链和人源化重链的抗体的可生育的雄性小鼠。本申请提供了用于制备双特异性结合蛋白的方法和组合物。
【专利说明】人源化的通用轻链小鼠
【技术领域】
[0001]用于制备编码人免疫球蛋白重链可变结构域的序列和抗体包括双特异性抗体和包括包含通用轻链的双特异性抗体的基因修饰小鼠、细胞、胚胎、组织和分离的核酸。包括具有在内源性小鼠重链可变基因座的种系取代的基因修饰小鼠的组合物和方法，所述小鼠包括经修饰的轻链基因座，所述轻链基因座表达衍生自不超过一个或两个不同的轻链V基因片段的轻链，其中所述小鼠在其种系进一步经基因修饰以使得具有这些修饰的雄性小鼠能够繁殖。本申请提供了表达通用轻链和人源化的重链可变结构域的基因修饰小鼠，其中所述小鼠包含在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性。
【背景技术】[0002]用于人类治疗的抗体的发展具有漫长而复杂的历史。一个显著的进步已经使基本上完全人抗体序列能够用于设计有效的人用疗法，其具有降低的潜在免疫原性。现已存在的小鼠是在其种系中进行修饰以产生衍生自未经重排的基因片段(轻链和重链)的人抗体序列，所述未重排的基因片段要么作为基因修饰，要么作为在内源性小鼠的免疫球蛋白基因座的取代。在小鼠的内源性基因座中使用人的可变序列取代小鼠的可变序列，如VELOC丨MMUME?人源化的小鼠，使得小鼠免疫系统的功能基本上正常。其结果是,将这些小鼠暴露于所选择抗原会产生种类繁多、亚群丰富的克隆选择的B细胞，所述B细胞表达高亲和性体细胞突变的人可变结构域，所述结构域能够用于制备针对所选择抗原的完全人抗体。
[0003]在人源化小鼠中制备的人可变结构域能够用于设计完全的人双特异性抗体，即结合蛋白，其是重链的异源二聚体，其中重链可变结构域的识别和结合特异性不同。但是选择能够有效地与重链异源二聚体结合并表达的轻链尚没有简单的解决方案。在人源化的小鼠中开发用于人类治疗的人轻链可变结构域当然是有可能的，但是选择与具有所需结合特性的重链有效地结合和表达的轻链并没有简单的解决方案，其中所述轻链不利于两条重链的表达或结合性能。
[0004]因此，本领域仍需要用于开发供人类治疗使用的人免疫球蛋白可变区的组合物和方法，包括由内源性小鼠免疫球蛋白基因座的核酸序列产生的人免疫球蛋白可变区。
[0005]发明概述
[0006]本申请描述了一种小鼠，所述小鼠表达人免疫球蛋白可变结构域，所述结构域适用于双特异性结合蛋白，包括双特异性抗体，其中所述小鼠包含内源性小鼠重链可变基因座的人源化，其中包含人源化的雄性小鼠具有生育能力，并且其中所述小鼠进一步包含内源性免疫球蛋白轻链基因座的人源化，其结果为使得小鼠表达免疫球蛋白轻链库，所述库衍生自不超过一个，或者不超过两个，λ和/或K V基因片段。
[0007]所提供的基因工程小鼠选择适宜的亲和成熟的人免疫球蛋白重链可变结构域，所述结构域衍生自未经重排的人重链V、D和J片段的库，其中所述亲和成熟的人重链可变结构域与人源化的通用轻链结合并表达。人源化的通用轻链由一个基因座表达，所述基因座包含 不超过一个或不超过两个人轻链V片段和人J片段，其可操作地与轻链恒定基因连接，或者不超过一个或不超过两个编码与轻链恒定基因可操作地连接的轻链可变结构域的重排的(νλ/JA、Vk/Jk、VA/JK或VK/JX)人核酸序列。在不同实施方式中，通用人源化的轻链结构域与多种亲和成熟的人重链可变结构域配对，其中所述的多种重链可变结构域与不同表位或抗原特异性的结合。
[0008]在一个方面，提供了用于制备小鼠的核酸构建体、细胞、胚胎、小鼠和方法，所述小鼠包括人源化的重链免疫球蛋白可变基因座和人源化的轻链免疫球蛋白可变基因座，其中所述小鼠表达不超过两个通用轻链中的一个，并且雄性的小鼠表现出野生型的生育能力。
[0009]在一个方面，提供了一种经过修饰的小鼠，在其种系中在内源性的小鼠重链基因座中包含人源化的重链免疫球蛋白可变基因座和人源化的轻链免疫球蛋白可变基因座，其中所述小鼠表达通用轻链，并且其中所述小鼠包含编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同系物或功能性片段的核酸序列。在不同实施方式中，所述人源化的轻链免疫球蛋白可变基因座在内源性的小鼠轻链基因座中。
[0010]在一个实施方式中，人源化的重链免疫球蛋白可变基因座包含在内源性小鼠重链可变基因座中全部或基本上全部有功能的小鼠免疫球蛋白重链V、D和J基因片段被一个或多个人V、人D和人J基因片段所取代，其中所述的一个或多个人V、D和J片段可操作地被连接并且能够重排以形成可操作地与重链恒定序列连接的重排V/D/J基因。
[0011]在一个实施方式中，所述小鼠包含设计成制备通用轻链的轻链基因座，其中所述通用轻链是衍生自包含不超过一个轻链V片段和不超过一个轻链J片段的轻链基因座或者包含单一重排的轻链V/J序列的轻链基因座的轻链。在一个实施方式中，所述小鼠包含包括单一人免疫球蛋白轻链V片段的免疫球蛋白轻链基因座，所述的V片段能够与人轻链J基因片段(选自一个或多个J片段)重排并且编码人轻链可变结构域。在另一个实施方式中，所述小鼠在轻链基因座包含不超过两个人轻链V片段，其中各V片段均能够与人J基因片段(选自一个或多个轻链J片段)重排并且编码重排的人轻链可变结构域。
[0012]在一个实施方式中，单一的人轻链V片段可操作地与人轻链J片段连接，所述J片段选自J K 1、J K 2、J K 3、J K 4和J K 5，其中所述的单一人轻链V片段能够重排以形成编码具有任意所述一个或多个人轻链J片段的轻链可变区域基因的序列。
[0013]在一个实施方式中，所述小鼠包含内源性的轻链基因座，其包含全部或基本上全部的小鼠V和J基因片段被不超过一个或不超过两个重排(V/J)的核酸序列所取代。在一个实施方式中，所述的不超过一个或不超过两个重排(V/J)的核酸序列选自人
VK 1-39J K 5,Vk 3-20J κ I 及其组合。
[0014]在一个实施方式中，所述小鼠缺乏有功能的内源性轻链基因座，所述基因座能够表达小鼠轻链可变结构域。在一个实施方式中，所述小鼠在κ基因座包含编码通用轻链可变结构域的核酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠在λ基因座包含编码通用轻链可变结构域的核酸序列。
[0015]在一个实施方式中，所述人V片段(或重排的V/J序列)可操作地与人或小鼠前导序列连接。在一个实施方式中，所述前导序列是小鼠前导序列。在一个特定实施方式中，所述小鼠前导序列是小鼠V K 3-7前导序列。
[0016]在一个实施方式中，所述人V片段(或重排的V/J序列)可操作地与免疫球蛋白启动子序列连接。在一个实施方式中，所述启动子序列是人启动子序列。在一个特定实施方式中，所述人免疫球蛋白启动子是人Vk 3-15启动子。
[0017]在一个实施方式中，所述未经重排的V和J片段或者重排的(V/J)序列可操作地与轻链免疫球蛋白恒定区基因连接。在一个特定实施方式中，所述恒定区基因是小鼠Ck基因。
[0018]在一个实施方式中，所述未经重排的V和J片段或者重排的(V/J)序列存在于κ轻链基因座，并且所述K轻链基因座包含小鼠K内含子增强子、小鼠K 3’增强子或者即包含内含子增强子又包含3’增强子。在一个特定实施方式中，所述κ基因座是内源性κ基因座。
[0019]在一个实施方式中，所述小鼠包含K基因座，其包含编码通用轻链的可变结构域的序列，并且所述小鼠包含不具有功能的免疫球蛋白λ轻链基因座。在一个特定实施方式中，所述λ轻链基因座包含一个或多个基因座的序列缺失，其中所述一个或多个缺失使得λ轻链基因座不能重排形成轻链基因。在另一个实施方式中，λ轻链基因座中的全部或基本上全部的V片段缺失。在另一个实施方式中，所述小鼠包含全部或基本上全部内源性轻链可变基因座的缺失。
[0020]在一个实施方式中，所述小鼠在其种系中进一步包含选自下述的序列:针对重排的免疫球蛋白轻链序列或未经重排的基因片段的小鼠κ 5’内含子增强子、小鼠κ 3’增强子及其组合。 [0021]在一个实施方式中，所述小鼠的通用轻链可变结构域序列包括一个或多个体细胞超突变；在一个实施方式中，所述可变结构域序列包括多个体细胞超突变。
[0022]在一个实施方式中，所述小鼠产生包含体细胞突变的人可变结构域的通用轻链。在一个实施方式中，所述轻链包含衍生自人V片段、人J片段和小鼠C K基因的体细胞突变的人可变结构域。在一个实施方式中，所述小鼠不表达λ轻链。
[0023]在一个实施方式中，所述人可变序列是重排的人V κ 1-39JK 5序列，并且所述小鼠表达反向嵌合轻链，所述反向嵌合轻链包含(i)衍生自Vk1-39Jk5的可变结构域和(?)小鼠其中所述轻链与反向嵌合重链结合，所述反向嵌合重链包含(i)小鼠
(?)体细胞突变的人重链可变结构域。在一个实施方式中，所述小鼠表达体细胞突变的轻链。在一个实施方式中，所述Clj是小鼠Ck。
[0024]在一个实施方式中，所述人可变序列是重排的人Vk 3-20J κ I序列，并且所述小鼠表达反向嵌合轻链，所述反向嵌合轻链包含(i)衍生自Vk3-20Jk I的可变结构域和(?)小鼠其中所述轻链与反向嵌合重链结合，所述反向嵌合重链包含(i)小鼠(?)体细胞突变的人重链可变结构域。
[0025]在一个实施方式中，所述小鼠包含重排的人Vk 1-39J κ 5序列和重排的人
Vκ 3-20 J κ I序列，并且所述小鼠表达反向嵌合轻链，所述反向嵌合轻链包含(i)包含衍生自Vk 1-39JK 5序列或Vk 3_20Jk I序列的可变结构域的轻链，和(ii)小鼠Q ;其中所述轻链与反向嵌合重链结合，所述反向嵌合重链包含(i)小鼠C1^P (ii)体细胞突变的人重链可变结构域。在一个实施方式中，所述小鼠表达体细胞突变的轻链。在一个实施方式中，所述Clj是小鼠C κ。
[0026]在一个实施方式中，所述小鼠表达反向嵌合抗体，所述反向嵌合抗体包含包括小鼠Ck和衍生自重排的人V k 1-39JK 5序列或重排的人Vk 3-20JK I序列的体细胞突变的人可变结构域的轻链，以及包括小鼠Ch和体细胞突变的人重链可变结构域的重链，其中所述小鼠不表达完全的小鼠抗体，也不表达完全的人抗体。在一个实施方式中，所述小鼠包含包括内源性的小鼠κ轻链基因片段被重排的人V κ 1-39J κ 5序列或重排的人V κ 3-20J κ I序列取代的κ轻链基因座，并且包含全部或基本上全部的内源性小鼠重链V、D和J基因片段被完全或基本上完全人重链V、D和J基因片段的库所取代。
[0027]在一个方面，提供了基因修饰小鼠，所述小鼠表达衍生自不超过一个或不超过两个重排的κ轻链序列的单一 κ轻链，其中所述小鼠在使用抗原免疫接种后显示出的血清滴度与使用相同抗原免疫的野生型小鼠相当。在一个特定实施方式中，所述小鼠表达单一κ轻链序列，其中所述单一 κ轻链序列衍生自不超过一个重排的κ轻链序列。在一个实施方式中，所述血清滴度以总免疫球蛋白表征。在一个特定实施方式中，所述血清滴度以IgM特异性滴度表征。在一个特定实施方式中，血清滴度以IgG特异性滴度表征。在一个更特别的实施方式中，所述重排的κ轻链序列选自V κ 1-39J κ 5和V κ 3-20J κ I序列。在一个实施方式中，所述重排的κ轻链序列是κ 1-39JK5序列。在一个实施方式中，所述重排的κ轻链序列是V κ 3-20J κ I序列。
[0028]在一个方面，提供了表达多种与单一轻链序列结合的免疫球蛋白重链的基因修饰小鼠。在一个实施方式中，所述重链包含人序列。在不同实施方式中，所述人序列选自可变序列、CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述单一轻链包含人序列。在不同实施方式中，所述人序列选自可变序列、恒定序列及其组合。在一个实施方式中，所述小鼠包含无效的内源性免疫球蛋白基因座并且通过基因修饰或染色体外游离基因表达重链和/或轻链。在一个实施方式中，所述小鼠包含取代，所述取代是指一些或全部内源性小鼠重链基因片段(即，V、D、J)，和/或一些或全部内源性小鼠重链恒定序列(例如，CH1、铰链、CH2、CH3或其组合)，和/或一些或全部内源性小鼠轻链序列(例如，V、J、恒定区或其组合)的内源性小鼠基因座被一个或多个人免疫球蛋白序列取代。
[0029]在一个实施方式中，经过一个或多个V、D和J基因片段，或者一个或多个V和J基因片段重排后，所述小鼠在其基因组中包含至少一个编码小鼠ADAM6基因或其直系同源物或同系物或功能性片段的核酸序列。在一个实施方式中，经过重排后，所述小鼠在其基因组中包含至少两个编码小鼠ADAM6基因或其直系同源物或同系物或功能性片段的核酸序列。在一个实施方式中，经过重排后，所述小鼠在其基因组中包含至少一个编码小鼠ADAM6基因或其直系同源物或同系物或功能性片段的核酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠在B细胞中包含ADAM6基因或其直系同源物或同系物或功能性片段。
[0030]在一个实施方式中，所述雄性小鼠在内源性ADAM6基因座包含单一未经修饰的内源性ADAM6等位基因或其直系同源物或同系物或功能性片段。
[0031]在一个实施方式中，所述雄性小鼠在小鼠基因组大致位于内源性小鼠ADAM6等位基因的位置包含ADAM6序列或其同系物或其直系同源物或功能性片段，例如在最后一个V基因片段序列的3’和第一个D基因片段的5’。
[0032] 在一个实施方式中，所述雄性小鼠在编码免疫球蛋白可变区基因片段的上游、下游或者上游和下游(相对于ADAM6序列的转录方向)的翼侧包含ADAM6序列或其同系物或直系同源物或功能性片段。在一个特定实施方式中，所述免疫球蛋白可变区基因片段是人基因片段。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白可变区基因片段是人基因片段，并且在小鼠中编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同系物或功能性片段的序列在人V基因片段之间；在一个实施方式中，所述小鼠包含两个或多个人V基因片段，并且所述序列位于最后一个V基因片段和倒数第二个V基因片段之间；在一个实施方式中，所述序列位于最后一个V基因片段和第一个D基因片段之间。
[0033]在一个实施方式中，所述人源化的重链免疫球蛋白可变基因座缺乏内源性的小鼠ADAM6基因。在一个实施方式中，所述人源化的重链免疫球蛋白可变基因座包含在雄性小鼠中具有功能的ADAM6基因。在一个特定实施方式中，在雄性小鼠中具有功能的ADAM6基因是小鼠ADAM6基因，并且所述小鼠ADAM6基因位于人源化的重链免疫球蛋白可变基因座内部或与之紧邻。
[0034]在一个实施方式中，所述人源化的重链免疫球蛋白可变基因座缺乏内源性的小鼠ADAM6基因，并且所述小鼠包含在雄性小鼠中具有功能的异位ADAM6序列。在一个实施方式中，在雄性小鼠中具有功能的异位ADAM6基因是小鼠ADAM6基因。在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6基因与所述人源化的重链免疫球蛋白可变基因座在相同的染色体上。在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6基因与所述人源化的重链免疫球蛋白可变基因座在不同的染色体上。在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6基因在游离基因上。
[0035]在一个实施方式中，所述小鼠包含第一内源性的重链等位基因和第二内源性的重链等位基因，并且所述第一内源性的重链等位基因包含小鼠ADAM6基因座的缺失，而且所述第一内源性的重链等位基因包含全部或基本上全部的有功能的小鼠V、D和J片段被一个或多个人V、D和J片段取代。在一个实施方式中，所述第一和第二内源性的重链等位基因均包含内源性小鼠ADAM6基因座的缺失，并且所述第一和第二内源性的重链等位基因包含全部或基本上全部的有功能的小鼠V、D和J片段被一个或多个人V、D和J片段取代。在一个实施方式中，所述第一和/或第二等位基因包含编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同系物或功能性片段的异位核酸序列。在一个实施方式中，所述异位核酸序列位于最后一个小鼠V基因片段的3’(相对于重链可变基因座的转录方向)和位于小鼠(或嵌合的人/小鼠)重链恒定基因或其片段(例如，编码人和/或小鼠的核酸序列=ChI和/或铰链和/或Ch2和/*Ch3)的5’(相对于恒定序列的转录方向)。在一个实施方式中，所述异位核酸序列位于V片段的下游(相对于V片段基因座的转录方向)和D片段的上游。在一个实施方式中，所述异位核酸序列位于倒数第二个最靠3’的V片段与最后一个最靠3’的V片段之间。在一个特定实施方式中，所述异位核酸序列位于人V片段Vh1-2与人V片段Vh6-1之间。在一个实施方式中，在两个人V基因片段之间的核苷酸序列与人V基因片段相比位于相反的转录方向。在一个特定实施方式中，相对于ADAM6基因的转录方向，核苷酸序列从5’至3’依次编码ADAM6a序列和ADAM6b序列。在一个特定实施方式中，ADAM6基因的转录方向与V片段翼侧的上游和下游相反。
[0036]在一个实施方式中，所述核酸序列包含编码小鼠ADAM6a或其功能性片段的序列和/或编码小鼠ADAM6b或其功能性片段的序列，其中所述ADAM6a和/或ADAM6b或其功能性片段可操作地与启动子连接。在一个实施方式中，所述启动子是人启动子。在一个实施方式中，所述启动子是小鼠ADAM6启动子。在一个特定实施方式中，所述ADAM6启动子包含序列，所述序列位于与小鼠最靠5’的Dh基因片段最接近的第一个ADAM6基因的第一个密码子与最靠5’的011基因片段的重组信号序列之间，其中5’指相对于小鼠免疫球蛋白基因转录的方向。在一个实施方式中，所述启动子是病毒启动子。在一个特定实施方式中，所述病毒启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。在一个实施方式中，所述启动子是泛素启动子。
[0037]在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6a和/或ADAM6b选自如SEQ IDNO:1所示的ADAM6a和/或如SEQ ID NO:2所示的ADAM6b序列。在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6启动子是如SEQ ID NO:3所示的启动子。在一个特定实施方式中，所述小鼠ADAM6启动子包含紧靠ADAM6a的第一个密码子上游的(相对于ADAM6a转录的方向)如SEQ ID N0:3所示的核酸序列，并且延伸至ADAM6编码区的上游的SEQ ID NO:3的末端。在另一个特定实施方式中，ADAM6启动子是从ADAM6a起始密码子上游约5至约20个核苷酸延伸至ADAM6a起始密码子上游约0.5kb、lkb、2kb或3kb或更多的片段。
[0038]在一个实施方式中，所述核酸序列包含SEQ ID NO:3或其片段，当将其置于由于缺乏ADAM6而不育或生育能力较低的小鼠中时，可以改善生育能力或将生育能力恢复至约野生型生育能力水平。在一个实施方式中，SEQ ID NO:3或其片段赋予雄性小鼠产生能够穿过雌性小鼠的输卵管以使得小鼠的卵子受精的精子细胞的能力。[0039]在一个实施方式中，所述小鼠包含编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或者其直系同源物或同系物或功能片段的核酸序列。在一个特定实施方式中，所述核酸序列在包含一个或多个免疫球蛋白可变区基因片段的人核酸序列内或与之邻近。在一个实施方式中，所述一个或多个免疫球蛋白可变区基因片段在经过修饰的内源性小鼠免疫球蛋白重链可变基因座中。在一个实施方式中，所述修饰包括全部或基本上全部有功能的小鼠免疫球蛋白重链可变基因片段被多个与内源性小鼠恒定区基因可操作地连接的未重排的人重链基因片段取代。在一个特定实施方式中，所述核酸序列在两个人V片段之间。在一个特定实施方式中，所述核酸序列在人V片段与人D片段之间。在一个特定实施方式中，所述核酸序列在人D片段与人J片段之间。在一个特定实施方式中，所述核酸序列在最靠5’端的人V片段上游(相对于V片段转录的方向)。在一个特定实施方式中，所述核酸序列在人J片段与内源性小鼠重链恒定区基因序列之间。
[0040]在一个实施方式中，所述雄性小鼠能够通过交配产生后代，其频率大致与野生型小鼠相同。在一个实施方式中，所述雄性小鼠产生能够由小鼠的子宫转移至小鼠的输卵管使小鼠卵子受精的精子；在一个特定实施方式中，小鼠的精子转移通过输卵管的效率与野生型小鼠的精子相当。在一个实施方式中，在小鼠中产生的约50%或更多的精子能够进入和/或穿过输卵管以使小鼠的卵子受精。
[0041]在一个实施方式中，所述小鼠缺乏有功能的内源性ADAM6基因座，其中所述小鼠包含补偿了雄性小鼠中缺失的小鼠ADAM6功能的异位核苷酸序列。在一个实施方式中，所述异位核苷酸序列使雄性小鼠产生后代的能力，该能力与含有有功能的内源性ADAM6基因的野生型雄性小鼠相当。在一个实施方式中，所述序列使小鼠能够在小鼠的精子细胞表面上形成ADAM2和/或ADAM3和/或ADAM6的复合物。在一个实施方式中，所述序列使小鼠的精子能够穿过小鼠子宫进入小鼠输卵管与小鼠卵子接触使得小鼠卵子受精。
[0042]在一个实施方式中，所述小鼠缺乏有功能的内源性ADAM6基因座并且包含编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6或其直系同源物或同系物或片段的异位核苷酸序列，并且其中所述雄性小鼠在6个月内产生的胎仔数为同龄和同品系野生型小鼠的至少约50%、60%、70%、80%或 90%。
[0043]在一个实施方式中,所述缺乏有功能的内源性ADAM6基因并且包含异位核苷酸序列的小鼠在喂养6个月时间段内与缺乏有功能的内源性ADAM6基因且缺乏异位核苷酸序列并且在基本上相同的条件下饲养基本上相同时间的同龄和相同或相近品系的小鼠相比产生的后代多至少约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约4倍、约6倍、约7倍、约8倍或约10倍或者更多。
[0044]在一个实施方式中,所述缺乏有功能的内源性ADAM6基因并且包含异位核苷酸序列的小鼠在4或6个月的饲养期内与缺乏有功能的内源性ADAM6基因且缺乏异位核苷酸序列且饲养相同时间的小鼠相比每窝产生平均高至少约2倍、3倍或4倍的胎仔数。
[0045]在一个实施方式中,所述缺乏有功能的内源性ADAM6基因并且包含异位核苷酸序列的小鼠是雄性小鼠，并且所述雄性小鼠产生的精子当在交配后约5-6小时从输卵管中回收后其反映出的输卵管迁移为缺乏有功能的内源性ADAM6基因并且缺乏异位核苷酸序列的小鼠精子的至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、100倍、110倍或120倍或者更高。
[0046]在一个实施方式中,所述缺乏有功能的内源性ADAM6基因并且包含异位核苷酸序列的小鼠当与雌性小鼠交配时产生的精子能够在约6小时内以与野生型小鼠大致相等的效率穿过子宫并且进入和穿过输卵管。
[0047]在一个实施方式中,所述缺乏有功能的内源性ADAM6基因并且包含异位核苷酸序列的小鼠在相当的时间段内与缺乏有功能的ADAM6基因并且缺乏异位核苷酸序列的小鼠相比产生约1.5倍、约2倍、约3倍或约4倍或者更多的胎仔。
[0048]在一个方面，提供了包含人源化的内源性小鼠重链可变免疫球蛋白基因座和经修饰的小鼠轻链免疫球蛋白基因座的小鼠，其中所述小鼠表达包含可操作地与人或小鼠重链恒定区基因序列连接的重排的人重链免疫球蛋白序列的B细胞，并且所述B细胞在其基因组中(例如，在B细胞的染色体中)包含编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6或其直系同源物或同系物或片段的基因(例如小鼠ADAM6基因，例如小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b)，其中所述小鼠免疫球蛋白λ或κ轻链的可变结构域衍生自不超过一个或不超过两个轻链V基因片段。
[0049]在一个实施方式中，可操作地与重链恒定区基因序列连接的重排的免疫球蛋白序列包含人重链V、D和/或J序列；小鼠重链V、D和/或J序列；人或小鼠轻链V和/或J序列。在一个实施方式中，所述重链恒定区基因序列包含选自由CH1、铰链、Ch2、Ch3及其组合组成的组的人或小鼠重链序列。
[0050]在一个方面，提供了适于制备具有相同轻链的抗体的小鼠，其中在小鼠中制备的全部或基本上全部的抗体同相同的轻链一起表达，其中所述轻链包含人可变结构域，并且其中所述抗体包含包括人可变结构域的重链。
[0051]在一个方面，提供了一种小鼠，其特征为所述小鼠不能产生表达衍生自非人
VK 1-39J K 5或人V K 3-20J k1序列的重排轻链序列的免疫球蛋白轻链可变结构域的B细胞。
[0052]在一个实施方式中，所述小鼠的k:λ轻链比大致与包含野生型免疫球蛋白轻链V和J基因片段互补染色体的小鼠相同。[0053]在一个方面，本申请所描述的小鼠表达衍生自人Vk 1-39JK 5或人V κ 3-20J κ I序列的免疫球蛋白链，其中所述小鼠包含全部或基本上全部的内源性小鼠重链可变区基因片段被一个或多个人重链可变区基因片段所取代，并且所述小鼠显示出的(a)表达具有入轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞与(b)表达具有κ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞之比为约I至约20。
[0054]在一个实施方式中，所述小鼠表达单一的κ轻链，其中所述单一的κ轻链衍生自人Vk 1-39JK 5序列，并且表达具有λ轻链的免疫球蛋白的⑶19+Β细胞与表达具有κ轻链的免疫球蛋白的⑶19+Β细胞之比为约I至约20 ;在一个实施方式中，所述比率为约I至至少约66 ;在一个特定实施方式中，所述比率为约I至66。
[0055]在一个实施方式中，所述小鼠表达单一的κ轻链，其中所述单一的κ轻链衍生自人Vk 3-20Jk 5序列，并且表达具有λ轻链的免疫球蛋白的⑶19+Β细胞与表达具有κ轻链的免疫球蛋白的⑶19+Β细胞之比为约I至约20 ;在一个实施方式中，所述比率为约I至约21。在特定实施方式中，所述比率为I至20，或者I至21。
[0056]在一个实施方式中，小鼠中的IgK+Ig λ+B细胞百分率大致与野生型小鼠相同。在一个特定实施方式中，在小鼠中IgK+IgX+B细胞的百分率为约2%至约6%。在一个特定实施方式中，在单一重排的κ轻链衍生自Vk 1-39JK 5序列的小鼠中IgK+IgA+B细胞的百分率为约2至约3 ;在一个特定实施方式中，约2.6。在一个特定实施方式中,在单一重排的κ轻链衍生自Vk 3-20JK I序列的小鼠中IgK+IgX+B细胞的百分率为约4至约8 ;在一个特定实施方式中，约6。
[0057]在一个实施方式中，所述小鼠不包含降低或消除小鼠体细胞突变任意有功能的轻链基因座的能力的修饰。在一个实施方式中，在小鼠中所述仅有的功能性轻链基因座表达包含人可变结构域的轻链，所述人可变结构域衍生自选自人Vk 1-39JK5序列、人
Vκ 3-20J κ I序列及其组合的重排序列。
[0058]在一个方面，提供了表达单一 κ轻链的基因修饰小鼠，所述κ轻链衍生自不超过一个，或不超过两个重排的K轻链序列，其中所述小鼠显示出的K轻链的使用比携带完整的或基本完整的人K轻链基因座的小鼠显示出的相同K轻链(即，衍生自相同V片段和相同J片段，或者衍生自相同重排的V/J片段)的使用多至少约100倍或更高、至少约200倍或更高、至少约300倍或更高、至少约400倍或更高、至少约500倍或更高、至少约600倍或更高、至少约700倍或更高、至少约800倍或更高、至少约900倍或更高、至少约1000倍或更高。在一个特定实施方式中，携带完整的或基本完整的人κ轻链基因座的小鼠缺乏有功能的未经重排的小鼠κ轻链序列。在一个特定实施方式中，所述小鼠表达来自不超过一个重排的κ轻链序列的单一 κ轻链。在一个实施方式中，所述小鼠包含一个拷贝的重排的κ轻链序列(例如，杂合子)。在一个实施方式中，所述小鼠包含两个拷贝的重排的κ轻链序列(例如，纯合子)。在更特定的实施方式中，所述重排的κ轻链序列选自Vk 1-39JK 5和Vk 3-20JK I序列。在一个实施方式中，所述重排的κ轻链序列是Vk 1_39Jk 5序列。在一个实施方式中，所述重排的κ轻链序列是Vk 3-20JK I序列。
[0059]在一个方面，提供了表达衍生自不超过一个或不超过两个重排的κ轻链序列的单一轻链的基因修饰小鼠，其中在基因修饰小鼠中所述轻链的表达水平比携带完整的或基本完整的人κ轻链可变基因座的小鼠显示出的相同重排轻链的表达高至少10倍至约1000倍、100倍至约1000倍、200倍至约1000倍、300倍至约1000倍、400倍至约1000倍、500倍至约1000倍、600倍至约1000倍、700倍至约1000倍、800倍至约1000倍或900倍至约1000倍。在一个实施方式中，所述轻链包含人序列。在一个实施方式中，所述轻链衍生自选自人Vk 1-39JK 5、人Vk 3-20JK I及其组合的重排的κ轻链序列。
[0060]在一个实施方式中，出于对轻链的表达与在包含基本上完整的人源化轻链可变基因座小鼠中的表达进行比较的目的，通过对转录的轻链序列(来自一个或两个重排的序列)的mRNA进行定量表征所述轻链的表达水平，并且将其与携带完整的或基本上完整的轻链基因座的小鼠所转录的轻链序列进行比较。
[0061]在一个方面，提供了一种制备抗体的方法，所述方法包括在细胞中表达(a)与人Ch基因序列融合的如本申请所述的免疫小鼠的第一人重链可变结构域核酸序列；(b)与人Cl基因序列融合的如本申请所述的免疫小鼠的人轻链可变结构域核酸序列；和(C)将所述细胞保持在足以表达全人抗体的条件下，并且分离所述抗体。在一个实施方式中，所述细胞包含与人Ch基因序列融合的如本申请所述的第二免疫小鼠的第二人重链可变结构域核酸序列，所述第一重链核酸序列编码识别第一表位的第一重链可变结构域，并且所述第二重链核酸序列编码识别第二表位的第二重链可变结构域，其中所述第一表位和第二表位是不同的。 [0062]在一个方面，提供了一种制备表位结合蛋白的方法，所述方法包括将本申请所述的小鼠与包含所关注的表位的抗原接触，将小鼠保持在足以使小鼠产生与所关注的表位特异性结合的免疫球蛋白的条件下，并且分离与所关注的表位特异性结合的免疫球蛋白分子；其中所述表位结合蛋白包括重链，所述重链包括体细胞突变的人可变结构域和小鼠CH，所述小鼠Ch与包含小鼠Q和衍生自重排的人V κ 1-39J κ 5或重排的人V κ 3-20J κ I的人可变结构域的轻链结合。
[0063]在一个方面，提供了一种制备双特异性抗原结合蛋白的方法，所述方法包括将如本申请所述的第一小鼠与包含第一表位的所关注的第一抗原接触，将如本申请所述的第二小鼠与包含第二表位的所关注的第二抗原接触，使所述第一和第二小鼠均针对所关注的抗原产生免疫应答，鉴定在第一小鼠中与所关注的第一抗原的第一表位结合的第一人重链可变区，鉴定在第二小鼠中与所关注的第二抗原的第二表位结合的第二人重链可变区，制备编码与所关注的第一抗原的第一表位结合的第一重链的第一全人重链基因，制备编码与所关注的第二抗原的第二表位结合的第二重链的第二全人重链基因，在表达衍生自人
Vκ 1-39或人V κ 3-20基因片段的单一全人轻链的细胞中表达第一重链和第二重链以形成双特异性抗原结合蛋白，并且分离所述双特异性抗原结合蛋白。
[0064]在一个实施方式中，所述第一抗原和第二抗原是不同的。
[0065]在一个实施方式中，所述第一抗原和第二抗原是相同的,但所述第一表位和第二表位是不同的。在一个实施方式中，所述第一重链可变区与第一表位的结合不会阻断所述第二重链可变区域与第二表位的结合。
[0066]在一个实施方式中，所述第一抗原选自可溶性抗原和细胞表面抗原(例如，肿瘤抗原)，并且所述第二抗原包含细胞表面受体。在一个特定实施方式中，所述细胞表面受体是免疫球蛋白受体。在一个特定实施方式中，所述免疫球蛋白受体是Fe受体。在一个实施方式中，所述第一抗原和第二抗原是相同的细胞表面受体，并且所述第一重链与第一表位的结合 不会阻断所述第二重链与第二表位的结合。
[0067]在一个实施方式中，所述轻链的轻链可变结构域包含2至5个体细胞突变。在一个实施方式中，所述轻链可变结构域是体细胞突变的同源轻链，所述同源轻链在第一或第二小鼠的B细胞中同第一或第二重链可变结构域一同表达。
[0068]在一个方面，提供了表达表位结合蛋白的细胞，其中所述细胞包括:(a)编码衍生自重排的人V κ 1-39J κ 5或重排的人V κ 3-20J κ I的人轻链可变结构域的人核苷酸序列，其中所述人核酸序列(直接或通过接头)与人免疫球蛋白轻链恒定结构域核酸序列(例如，人κ恒定结构域DNA序列)融合；和(b)编码衍生自第一人重链可变结构域核苷酸序列的人重链可变结构域的第一人重链可变结构域核酸序列，其中所述第一人重链可变结构域核苷酸序列(直接或通过接头)与人免疫球蛋白重链恒定结构域核酸序列(例如，人IgGU IgG2、IgG3、IgG4或IgE序列)融合；其中所述表位结合蛋白识别第一表位。在一个实施方式中，所述表位结合蛋白结合第一表位的解离常数低于10_6M、低于10_8M、低于10_9M、低于ΙΟ,Μ、低于IO-11M或低于10_12Μ。在一个实施方式中，所述细胞包含编码第二人重链可变结构域的第二人核苷酸序列，其中所述第二人序列(直接或通过接头)与人免疫球蛋白重链恒定结构域核酸序列融合，并且其中所述第二人重链可变结构域不特异性地识别第一表位(例如，显示出例如10_6Μ、10_5Μ、10_4Μ或更高的解离常数)，并且其中所述表位结合蛋白与第一表位和第二表位结合，并且其中所述第一和第二免疫球蛋白重链均与(a)的轻链结合。在一个实施方式中，所述第二 Vh结构域与第二表位结合的解离常数低于10-6Μ、低于10_7Μ、低于 10_8Μ、低于 10_9Μ、低于 10_10Μ、低于 KT11M 或低于 10-12Μ。
[0069]在一个实施方式中，所述表位结合蛋白包含第一免疫球蛋白重链和第二免疫球蛋白重链，其均与通用轻链(例如，衍生自选自人Vk 1-39JK 5或人Vk 3-20JK I的重排的人轻链可变序列的轻链)结合，其中所述第一免疫球蛋白重链与第一表位结合的解离常数在纳摩(例如，InM至IOOnM)至皮摩(例如，IpM至IOOpM)范围内，所述第二免疫球蛋白重链与第二表位结合的解离常数在纳摩至皮摩范围内(例如，IpM至IOOnM)，所述第一表位和第二表位是不同的，所述第一免疫球蛋白重链不与第二表位结合或与第二表位以弱于微摩范围(例如，毫摩范围)的解离常数结合，所述第二免疫球蛋白重链不与第一表位结合或与第一表位以弱于微摩范围(例如，毫摩范围)的解离常数结合，并且所述第二免疫球蛋白重链的一个或多个可变结构域(即，一个或多个轻链可变结构域、第一免疫球蛋白重链的重链可变结构域和重链可变结构域)是体细胞突变的。在一个实施方式中，所述表位结合蛋白与第一表位的结合不会阻断所述表位结合蛋白与第二表位的结合。
[0070]在一个实施方式中，所述第一免疫球蛋白重链包含野生型蛋白A结合决定簇，并且所述第二重链缺乏野生型蛋白A结合决定簇。在一个实施方式中，在分离条件下所述第一免疫球蛋白重链结合蛋白Α，并且在分离条件下所述第二免疫球蛋白重链不结合蛋白A或者其与蛋白A的结合比第一免疫球蛋白重链与蛋白A的结合弱至少10倍、百倍或千倍。在一个特定实施方式中，所述第一和第二重链是IgGl同种型，其中所述第二重链包含选自95R(EU435R)、96F(EU436F)及其组合的修饰，并且其中所述第一重链缺乏这种修饰。
[0071]在一个方面，本申请所述的小鼠、胚胎或细胞包含保留了内源性调节或控制元件的K轻链基因座，例如小鼠K内含子增强子、小鼠K 3’增强子或者内含子增强子和3’增强子，其中所述调节或控制元件促进κ轻链基因座表达的序列的体细胞突变和亲和突变。[0072]在一个方面，提供了分离自本申请所述的小鼠的小鼠细胞。在一个实施方式中，所述细胞是ES细胞。在一个实施方式中，所述细胞是淋巴细胞。在一个实施方式中，所述淋巴细胞是B细胞。在一个实施方式中，所述B细胞表达嵌合重链，其包含衍生自人V基因片段的可变结构域；和轻链，其衍生自(a)重排的人V κ 1-39/J序列，(b)重排的人Vk 3-20/J序列或(C)其组合；其中所述重链可变结构域与小鼠的恒定区融合并且所述轻链可变结构域与小鼠或人的恒定区融合。在一个实施方式中，所述小鼠细胞包含至少一个编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同系物或功能性片段的基因。在一个实施方式中，所述细胞是B细胞且B细胞包含编码重排的人重链免疫球蛋白可变结构域的序列和编码通用轻链可变结构域的序列，其中所述B细胞在染色体上包含编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或其直系同源物或同系物或片段的核酸序列；在一个实施方式中，所述小鼠B细胞包含核酸序列的两个等位基因。
[0073]在一个方面，提供了一种小鼠细胞，其包含包括人源化的免疫球蛋白重链基因座的第一染色体，所述基因座包含未经重排的人V、D和J片段；包含人源化的免疫球蛋白轻链基因座的第二染色体，所述轻链基因座编码或能够重排以编码轻链，其中所述轻链基因座包含与轻链恒定区基因可操作地连接的不超过一个V片段(或不超过两个V片段)和不超过一个J片段(或不超过两个J片段)，或者与轻链恒定基因可操作地连接的不超过一个或不超过两个重排的轻链V/J序列；和包含编码在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6或其直系同源物或同系物或片段的核酸序列的第三染色体。在一个实施方式中，第一和第三染色体是相同的。在一个实施方式中，第二和第三染色体是相同的。在一个实施方式中，第一、第二和第三染色体均是不同的。在一个实施方式中，所述编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同系物或功能性片段的核酸序列存在于两个拷贝中。在一个实施方式中，所述细胞是体细胞。在一个特定实施方式中，所述体细胞是B细胞。在一个实施方式中,所述细胞是干细胞。
[0074]在一个方面，提供了一种杂交瘤，其中所述杂交瘤使用如本申请所述的小鼠的B细胞制备。在一个特定实施方式中，所述B细胞来自于经包含所关注表位的抗原免疫的如本申请所述的小鼠，并且所述B细胞表达与所关注的表位结合的结合蛋白，所述结合蛋白具有体细胞突变的人重链可变结构域和小鼠重链恒定区，并且具有衍生自重排的人Vk 1-39JK 5或重排的人V κ 3-20J κ I的人轻链可变结构域和小鼠Q。
[0075]在一个方面，提供了一种细胞，其包含全人重链基因，所述基因包含编码如本申请所述的小鼠第一重链可变结构域的核酸序列，和全人轻链基因，所述全人轻链基因包含编码如申请所述的通用轻链序列的核酸序列。在一个实施方式中，所述细胞进一步包含编码如本申请所述的小鼠第二重链可变结构域的核酸序列，其中所述第一和第二重链可变结构域是不同的。在一个实施方式中，所述细胞选自CH0、C0S、293、HeLa和表达病毒核酸序列的视网膜细胞(例如，PERC.6?细胞)。
[0076]在一个方面，提供了一种小鼠的胚胎，其中所述胚胎包含衍生自如本申请所述的小鼠的供体ES细胞。
[0077]在一个方面，提供了包含如本申请所述的基因修饰的小鼠胚胎的用途，其中所述用途包含制备如 本申请所述的基因修饰小鼠。
[0078]在一个方面，提供了在如本申请所述的小鼠中制备的抗体的人重链可变结构域和人轻链可变结构域的氨基酸序列。
[0079]在一个方面，提供了在如本申请所述的小鼠中制备的抗体的人重链可变结构域和人轻链可变结构域的核苷酸序列。
[0080]在一个方面，提供了在如本申请所述的小鼠中制备的抗体或其抗原结合蛋白或抗原结合片段(例如，Fab、F(ab)2、scFv)。
[0081]在一个方面，提供了使用如本申请所述的目标载体、核苷酸构建体或细胞制备的小鼠。
[0082]在一个方面，提供了如本申请所述的第一小鼠与野生型小鼠或基因修饰的第二小鼠交配得到的后代。
[0083]在一个方面，提供了使用如本申请所述的小鼠制备全人抗体，或包含免疫球蛋白可变结构域或其功能性片段的全人抗体结合蛋白的用途。
[0084]在一个方面，提供了使用如本申请所述的小鼠或组织或细胞制备全人双特异性抗体的用途。[0085]在一个方面，提供了使用如本申请所述的小鼠制备的核酸序列的用途，其中所述用途包含在人用治疗剂的生产中表达所述核酸序列。
[0086]在一个方面，提供了使用如本申请所述的小鼠制备永生化的细胞系的用途。
[0087]在一个方面，提供了使用如本申请所述的小鼠制备杂交瘤或四价体瘤的用途。
[0088]在一个方面，提供了使用如本申请所述的小鼠制备编码免疫球蛋白可变区或其片段的核酸序列的用途。在一个实施方式中，所述核酸序列用于制备人抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，所述小鼠用于制备选自抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、scFv、双-scFV、双体、三体、四体、V-NAR、VHH, VL、F(ab)、F(ab)2、DVD(即，双可变结构域抗原结合蛋白)、SVD(即，单一可变结构域抗原结合蛋白)或双特异性T细胞接合子(BiTE)的抗原结合蛋白。
[0089]在一个方面，提供了为了治疗人类疾病或病变，本申请所述的小鼠用于制备药物(例如，抗原结合蛋白)，或者用于制备编码药物(例如，抗原结合蛋白)的可变序列的序列的用途。
[0090]除非另有说明或者从上下文中显而易见，否则本申请中所述的任意实施方式和方面可以彼此结合使用。通过随后描述的概述，其他实施方式对本领域技术人员而言将是显而易见的。
[0091]附图简述
[0092]图1A显不了约I兆喊基(Mb)的人免疫球蛋白重链可变基因座(空心符号)对约3兆碱基(Mb)的小鼠免疫球蛋白重链可变基因座(实心符号)的直接基因组置换的大致图示，但未按比例绘制。
[0093]图1B显示了约0.5兆碱基(Mb)的人免疫球蛋白κ轻链可变基因座的两个几乎相同的重复单元中的第一个或近端重复单元(空心符号)对约3兆碱基(Mb)的小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因座(实心符号)的直接基因组置换的大致图示，但未按比例绘制。
[0094]图2Α显示了用于对小鼠免疫球蛋白重链可变基因座进行直接基因组置换的三个起始步骤(A-C)的详细图示，但未按比例绘制，所述直接基因组置换使得所有小鼠VH、
Jh基因区段缺失并被三个人Vh、所有人Dh和Jh基因区段置换。示出了用于首次插入人免疫球蛋白重链基因区段的目标载体(3hVHBACvec)，其具有67kb5’小鼠同源臂、选择表达盒(空心矩形)、位点特异性重组位点(空心三角形)、145kb人基因组片段和8kb3’小鼠同源臂。示出了从随后的目标载体插入的人(空心符号)和小鼠(实心符号)免疫球蛋白基因区段、额外的选择表达盒(空心矩形)和位点特异性重组位点(空心三角形)。
[0095]图2B显示了用于对小鼠免疫球蛋白重链可变基因座进行直接基因组置换的六个额外步骤(D-1)的详细图示，但未按比例绘制，所述直接基因组置换插入了 77个额外的人Vh基因区段并去除了最后一个选择表达盒。示出了用于将额外的人Vh基因区段插入到人重链基因区段的初始插入物(3hVH-CRE杂合等位基因)中的目标载体(18hVH BACvec)，其具有20kb5’小鼠同源臂、选择表达盒(空心矩形)、196kb人基因组片段和62kb人同源臂，所述人同源臂与人重链基因区段的初始插入物的5’端部分重叠，所述5’端被显示具有位于人基因区段5’的位点特异性重组位点(空心三角形)。显示了由随后的目标载体插入的人(空心符号)和小鼠(实心符号)免疫球蛋白基因区段和额外的选择表达盒(空心矩形)。
[0096]图2C显示了用于对小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因座进行直接基因组置换的三个初始步骤(A-C)的详细图示，但未按比例绘制，所述直接基因组置换使所有的小鼠Vk和Jk基因区段缺失(Ig κ-CRE杂合等位基因)。显示了从目标载体插入的选择表达盒(空心矩形)和位点特异性重组位点(空心三角形)。
[0097]图2D显示了用于对小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因座进行直接基因组置换的五个额外步骤(D-H)的详细图示，但未按比例绘制，所述直接基因组置换插入了近端重复单元的所有人Vk和Jk基因区段并使最后一个选择表达盒缺失(40hV κ dHyg杂合等位基因)。显示了由随后的目标载体插入的人(空心符号)和小鼠(实心符号)免疫球蛋白基因区段和额外的选择表达盒(空心矩形)。
[0098]图3A显示了定量PCR(qPCR)引物/探针组的定位，以筛选ES细胞来插入人重链基因序列和丧失小鼠重链基因序列的大致图示。显示了在ES细胞和小鼠中筛选第一人重链插入物的策略，qPCR引物/探针针对未经修饰的小鼠染色体(上图)和被正确靶向的染色体(下图)上的缺失的区域(“丧失”探针C和D)、插入的区域(“hlgH”探针G和H)和侧接区域(“保留”探针A、B、E和F)。
[0099]图3B显示了亲本ES细胞和被修饰ES细胞中人免疫球蛋白重链基因区段的第一插入物的实测探针拷贝数量的代表性计算结果。探针A到F的实测探针拷贝数量被计算为2/2 Δ Δ Ct。Δ Δ Ct被计算为ave [ Δ Ct (样品)-med Δ Ct (对照)],其中Δ Ct是测试探针与参考探针(参考探针在4个与6个之间，这取决于分析)之间的Ct差值。术语med ACt (对照)是来自亲本ES细胞的多个(>60个)非靶向DNA样品的中值ACt。每个被修饰的ES细胞克隆被重复分析六次。为了计算亲本ES细胞中的IgH探针G和H的拷贝数，假定这些探针在被修饰ES细胞中的拷贝数为1，并且使用的最大Ct为35，即使没有观察到扩增。
[0100]图3C显示了仅使用探针D和H，以相似的方法计算得到的每种基因型的四只小鼠的拷贝数的代表性计算结果。野生型小鼠=WIVjn^ ;就人免疫球蛋白基因区段的第一插入物来说为杂合型的小鼠=HEIVjn^ ;就人免疫球蛋白基因区段的第一插入物来说为纯合型的小鼠:Homo小鼠。
[0101]图4A显示了用于通过细菌同源重组(BHR)构建3hVH BACvec的三个步骤的详细图示。显示了从目标载体插入的人(空心符号)和小鼠(实心符号)免疫球蛋白基因区段、选择表达盒(空心矩形)和位点特异性重组位点(空心三角形)。
[0102]图4B显示了在NotI消化之后的三个BAC克隆(B1、B2和B3)的脉冲场凝胶电泳(PFGE)。标记物M1、M2和M3分别是低范围、中间范围和λ梯度PFG标记物(New EnglandBioLabs, Ipswich, MA)。
[0103]图5A显示了增加量的人免疫球蛋白重链基因区段对小鼠免疫球蛋白重链基因座的连续修饰的示意图，但未按比例绘制。从重链人源化的三个不同阶段中的每一个阶段产生了纯合小鼠。空心符号表示人序列，实心符号表示小鼠序列。
[0104]图5B显示了增加量的人免疫球蛋白κ轻链基因区段对小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座的连续修饰的示意图，但未按比例绘制。从κ轻链人源化的三个不同阶段中的每一个阶段产生了纯合小鼠。空心符号表示人序列，实心符号表示小鼠序列。
[0105]图6显示了在野生型和VEL0C1MMUNE;?人源化小鼠中的B细胞群体的FACS点阵图。对来自于野生型(wt)或 VELOCIMMUNE? I (Vl)、VELOCIMMUNE? 2 (V2)或VELOCIMMUNE? 3 (V3)小鼠的脾(第I行、正数第3行、和最后I行)或腹股沟淋巴结(正数第2行)的细胞染色，用于检测表面IgM表达性B细胞(第I行和正数第2行)、含有κ或λ轻链的表面免疫球蛋白(正数第3行)或特异性单倍型的表面IgM(最后I行)，并且通过FACS分离群体。
[0106]图7A显示了随机选择的VELOCIMMUNE?抗体Vh-Dh-Jh(CDR3)接头周围的代表性重链CDR3序列，从而证明了接合多样性和核苷酸添加。根据Dh基因区段的使用对重链⑶R3序列进行分组，其种系以粗体在每组上方提供。每个重链⑶R3序列的Vh基因区段被记录在每个序列的5’端的括号内(例如3-72是人Vh3-72)。每个重链⑶R3的Jh基因区段被记录在每个序列的3’端的括号内(例如3是人Jh3)。显示的每个序列的SEQ ID NO从上到下如下所示:SEQ ID NO:21 ；SEQ ID NO:22 ；SEQ ID NO:23 ；SEQ ID NO:24 ；SEQ IDNO:25 ；SEQ ID NO:26 ；SEQ ID NO:27 ；SEQ ID NO:28 ；SEQ ID NO:29 ；SEQ ID NO:30 ；SEQID NO:31 ；SEQ ID NO:32 ；SEQ ID NO:33 ；SEQ ID NO:34 ；SEQ ID NO:35 ；SEQ ID NO:36 ；SEQ ID NO:37 ；SEQ ID NO:38 ；SEQ ID NO:39。
[0107]图7B显示了随机选择的VELOCIMMUNE?抗体Vk-Jk (CDR3)接头周围的代表性轻链CDR3序列，从而证明了接合多样性和核苷酸添加。每个轻链CDR3序列的Vk基因区段被记录在每个序列的5’端的括号内(例如1-6是人V κ 1-6)。每个轻链⑶R3的Jk基因区段被记录在每个序列的3’端的括号内(例如I是人Jk I)。显示的每个序列的SEQID NO 从上到下如下所示:SEQ ID NO:40 ；SEQ ID NO:41 ；SEQ ID NO:42 ；SEQ ID NO:43 ；SEQ ID NO:44 ；SEQ ID NO:45 ；SEQ ID NO:46 ；SEQ ID NO:47 ；SEQ ID NO:48 ；SEQ ID NO:49 ；SEQ ID NO:50 ；SEQ ID NO:51 ；SEQ ID NO:52 ；SEQ ID NO:53 ；SEQ ID NO:54 ；SEQ IDNO:55 ；SEQ ID NO:56 ；SEQ ID NO:57 ；SEQ ID NO:58。
[0108] 图8显示了 VELOCIMMUNE?抗体的重链和轻链的体细胞超突变频率，其被计分(与匹配种系序列比对之后)为在各组38个(非经免疫的IgM)、28个(非经免疫的IgG)、32个(来自IgG的非经免疫的Ig O、36个(经免疫的IgG)或36个(来自IgG的经免疫的IgO序列中的每个核苷酸(NT ;左列)或氨基酸(AA ;右列)位置处发生变化的序列的百分比。阴影条形图指示⑶R的位置。[0109]图9A显示了野生型(空心条形图)或VELOCIMMU^r小鼠(实心条形图)中的IgM和IgG同种型的血清免疫球蛋白含量。
[0110]图9B显示了野生型(空心条形图)或VELOCIMMUNE?'小鼠(实心条形图)中的IgA同种型的血清免疫球蛋白含量。
[0111]图9C显示了野生型(空心条形图)或VELOCIMMUNE?小鼠(实心条形图)中的IgE同种型的血清免疫球蛋白含量。
[0112]图1OA显示了在用白细胞介素-6受体的胞外域进行两(采血I)或三(采血2)轮免疫之后，针对来自7只VELOCIMMUNE? (VI)小鼠和5只野生型(WT)小鼠的血清白细胞介素-6受体(IL-6R)的抗原特异性IgG滴度。
[0113]图1OB显示了来自7只VELOCIMMUNE? (VI)小鼠和5只野生型(WT)小鼠的抗白细胞介素-6受体-特异性IgG同种型-特异性滴度。
[0114]图1lA显示了在VEL.0CIMMUNE?小鼠中产生的抗白细胞介素_6受体单克隆抗体的亲和力分布。
[0115]图1lB显示了在VELOCIMMUNE:? (VI)和野生型(WT)小鼠中产生的抗白细胞介素-6受体单克隆抗体的抗原特异性封闭。
[0116]图12显示了小鼠免疫球蛋白重链基因座中的小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的示意图，但未按比例绘制。示出了用于将小鼠ADAM6a和ADAM6b插入人源化内源重链基因座中的目标载体(mADAM6目标载体)，其具有在位点特异性重组位点(Frt)侧翼的选择表达盒(HYG:潮霉素)，并包含在5’和3’端上的工程修饰的限制位点。
[0117]图13显示了位于人重链可变基因区段1-2(Vh1-2)与6_1 (VH6_1)之间的人ADAM6假基因(hADAM6V)的示意图，但未按比例绘制。示出了用于进行细菌同源重组以使人ADAM6假基因缺失并将独特的限制位点插入人重链基因座中的目标载体(hADAM6ur目标载体)，其具有被位点特异性重组位点(1xP)侧接的选择表达盒(ΝΕ0:新霉素)，并包含在5’和3’端上的工程修饰的限制位点。显示了得到的被靶向的人源化重链基因座的图示，但未按比例绘制，所述被靶向的人源化重链基因座含有编码小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的基因组片段，并包含被位点特异性重组位点侧接的选择表达盒。
[0118]图14A显示了就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(Η/κ)和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有包括小鼠ADAM6基因的插入的小鼠基因组片段的小鼠(Η/κ-Α6)的骨髓中，在单线上门控的淋巴细胞中的IgM和B220表面表达的FACS等高线图。在每个等高线图中记录了不成熟(B220intIgM+)和成熟(B220highIgM+)B细胞的百分比。
[0119]图14B显示了骨髓中的不成熟(B220intIgM+)和成熟(B220highIgM+)B细胞的总数，所述骨髓分离自就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(Η/κ)和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H/k -A6)的股骨。
[0120]图15Α显示了就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(Η/κ)和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(Η/κ-Α6)的骨髓中，⑶19+门控B细胞中的c-kit和⑶43表面表达的FACS等高线图。在每个等高线图的右上象限和左下象限中分别记录了原B(pix)-B)(CD19+CD43+ckit+)细胞和(pre-Β)前 B(CD19+CD43-ckiO 细胞的百分比。
[0121]图15B显示了骨髓中的原B细胞(⑶19+⑶43+ckit+)和前B细胞(⑶19+⑶43Υ1?Ο的总数，所述骨髓分离自就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(ADAM6-/-)和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有包括小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(Η/Κ-Α6)的股骨。
[0122]图16Α显示了就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(Η/ κ )和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的的小鼠(Η/κ-Α6)的骨髓中，在单线上门控的淋巴细胞中的CD19和CD43表面表达的FACS等高线图。在每个等高线图中记录了不成熟B(⑶19+CD43_)、前B(⑶19+CD43int)和原B(CD19+CD43+)细胞的百分比。
[0123]图16B显示了就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(Η/ κ )和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(Η/κ -Α6)的骨髓中，不成熟B(CD19+CD43_)和前B (CD19+CD43int)细胞的直方图。
[0124]图17A显示了就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(Η/ κ )和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(Η/κ-Α6)的脾细胞中，在单线上门控的淋巴细胞中的⑶19和⑶3表面表达的FACS等高线图。在每个等高线图中记录了 B(CD19+CD3_)和T (CD19XD3+)细胞的百分比。
[0125]图17B显示了就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(Η/ κ )和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有包含小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(Η/κ-Α6)的脾中，⑶19+门控B细胞中的IgX和IgK轻链表面表达的FACS等高线图。在每个等高线图中记录了 IgX+(左上象限)和IgK (右下象限)B细胞的百分比。
[0126]图17C显示了就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(Η/ κ )和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有包含小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(Η/κ-Α6)的脾中的⑶19+Β细胞总数。
[0127]图18Α显示了就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(Η/ κ )和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(Η/κ-Α6)的脾中，⑶19+门控B细胞中的IgD和IgM表面表达的FACS等高线图。每个等高线图中记录了成熟B细胞(CD19+IgDhishIgMint)的百分比。右侧等高线图上的箭头说明了与IgM和IgD表面表达有关的B细胞成熟过程。
[0128]图18B显示了就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型的小鼠(Η/ κ )和就人重链和人κ轻链可变基因座来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(Η/ κ -Α6)的脾中的B细胞在从CD19+IgMhighIgDint到CD19+IgMintigDhigh的成熟期间的总数。
[0129]图19显示了使用人V κ 1-39J κ 5基因区取代内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因片段的靶向策略。 [0130]图20显示了使用人Vk3-20Jk I基因区取代内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因片段的靶向策略。
[0131]图21显示了使用人VpreB/J λ 5基因区取代内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因片段的靶向策略。
[0132]图22显示了野生型小鼠(WT)、具有工程化的人重排的V κ 1-39J κ 5轻链区(V κ 1-39J κ 5Η0)的小鼠纯合子和具有工程化的人重排的V κ 3-20J κ I轻链区(V κ 3-20J κ 1Η0)的小鼠纯合子外周血⑶19+Β细胞(y-轴)的百分率。
[0133]图23A显示了定量PCR检测的V κ 1_39衍生的轻链的相对mRNA表达情况(y_轴)，其中所述定量PCR检测是在使用对使用人V κ和】!^基因片段取代内源性Vk和】!^基因片段的小鼠纯合子(Ηκ)、野生型小鼠(WT)和具有工程化的人重排的Vk 1-39JK5轻链区的小鼠杂合子(Vk 1-39J κ 5HET)中的工程化的人重排的Vk 1_39Jk5轻链区接头(V κ 1-39J κ 5接头探针)和人V κ 1-39基因片段(V κ 1-39探针)具有特异性的探针的情况下进行的。使用小鼠Ck的表达情况对信号进行归一化。N.D.:未检测。
[0134]图23Β显示了定量PCR检测的Vk 1_39衍生的轻链的相对mRNA表达情况(y_轴)，其中所述定量PCR检测是在使用对使用人V κ和】!^基因片段取代内源性Vk和】!^基因片段的小鼠纯合子(Ηκ)、野生型小鼠(WT)和具有工程化的人重排的Vk 1-39JK5轻链区的小鼠纯合子(V κ 1-39J κ 5H0)中的工程化的人重排的Vk 1-39JK 5轻链区接头(V κ 1-39J κ 5接头探针)和人V κ 1-39基因片段(V κ 1-39探针)具有特异性的探针的情况下进行的。使用小鼠Ck的表达情况对信号进行归一化。
[0135]图23C显示了定量PCR检测的Vk 3-20衍生的轻链的相对mRNA表达情况(y_轴)，其中所述定量PCR检测是在使用对使用人V κ和】!^基因片段取代内源性Vk和】!^基因片段的小鼠纯合子(Hk)、野生型小鼠(WT)和具有工程化的人重排的Vk3-20Jk1轻链区的小鼠杂合子(HET)和纯合子(HO)中的工程化的人重排的Vk 3-20J κ I轻链区接头(V κ 3-20J κ I接头探针)和人V κ 3-20基因片段(V κ 3-20探针)具有特异性的探针的情况下进行的。使用小鼠Ck的表达情况对信号进行归一化。
[0136]图24Α显示了在使用β -半乳糖苷酶免疫的野生型(WT ；Ν=2)和具有工程化的人重排的V κ 1-39JK 5轻链区的小鼠纯合子(Vk 1-39J κ 5Η0 ；Ν=2)的IgM(左图)和IgG(右图)的滴度。
[0137]图24B显示了在使用β -半乳糖苷酶免疫的野生型(WT ；Ν=5)和具有工程化的人重排的Vk 3-20JK I轻链区的小鼠纯合子(V κ 3-20J κ IHO ；Ν=5)的总免疫球蛋白(IgM,IgG, IgA)的滴度。
[0138]发明详述
[0139]如本申请所使用的，术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子包含四条多肽链，中间通过二硫键连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链均包含重链可变(Vh)区和重链恒定区(Ch)。重链恒定区包含三个结构域CH1、(^和^^。每条轻链包含轻链可变区和轻链恒定区(CJ。可以再进一步将V1^P'区分为高变区，称为互补性决定区(CDR)，其散布的更加保守的称为框架区(FR)的区域。各V1^P'均包含三个CDR和四个FR，其按照下述顺序分布在氨基端至羧基端:FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4 (可以将重链CDR简称为HCDRl、HCDR2和HCDR3 ;可以将轻链CDR简称为LCDRl、LCDR2和LCDR3)。术语“高亲和性”抗体指针对其靶表位的Kd为约10_9M或更低(例如，约ΙχΚ^Μ'ΙχΙΟ,Μ、1χ10_ηΜ或约Ixl(T12M)的抗体。在一个实施方式中，Kd通过表面等离子体共振检测，例如BIACORE? ;在另一个实施方式中，Kd通过ELISA检测。
[0140]术语“双特异性抗体”包括能够选择性与两个或多个表位结合的抗体。双特异性抗体通常包含两个不同的重链，每条重链特异性与不同的表位结合一所述表位在两个不同的分子上(例如，在两个不同免疫原上的不同表位)或在同一个分子上(例如，在相同免疫原上的不同表位)。如果双特异性抗体能够选择性与两个不同表位(第一表位和第二表位)结合，则第一重链针对第一表位的亲和性将通常比第一重链针对第二抗原的亲和性低至少I或2或3或4或更多个数量级，反之亦然。与双特异性抗体特异性结合的表位可以在相同或不同的靶点(例如，在相同或不同的蛋白上)。可以通过例如将识别相同免疫原的不同表位的重链组合制备双特异性抗体。例如，编码识别相同免疫原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可以与编码相同或不同重链恒定区的核酸序列融合，并且可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达这种序列。典型的双特异性抗体具有两条重链，每条均具有三个重链⑶R，随后(N-末端至C-末端)为ChI结构域，铰链，Ch2结构域和Ch3结构域，以及免疫球蛋白轻链，其既不具有表位结合特异性又不能与各重链结合，或者其能够与各条重链结合并且能够与一个或多个重链表位结合区域结合表位结合，或者能够结合各条重链并且能够使一条或两条重链与一个或多个表位结合。[0141]术语“细胞”包括适于表达重组核酸序列的任意细胞。细胞包括那些原核细胞和真核细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母、栗酒酵母、毕赤酵母、P.methanolica等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾等)、非人动物细胞、人细胞或细胞融合例如杂交瘤或四价体瘤。在一些实施方式中，所述细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方式中，所述细胞是真核细胞并且选自下述细胞:CHO (例如 CHO K1、DXB-11CH0、Veggie-CHO)、COS (例如 C0S-7)、视网膜细胞、Vero, CVl、肾细胞(例如 HEK293、293EBNA、MSR293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、!fepG2、WI38、MRC5、Colo205、HB8065、HL-60 (例如 BHK21)、Jurkat、Daud1、A431 (表皮)、CV-U U937、3T3、L 细胞、C127细胞、SP2/0、NS-O, MMT060562、Sertoli细胞、BRL3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和衍生自上述细胞的细胞系。在一些实施方式中，所述细胞包含一个或多个病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6?细胞)。
[0142]术语“互补性决定区”或术语“⑶R’包括由通常(即，在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如，抗体或T细胞受体)的轻链或重链可变区的两个框架区之间的生物体免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列。CDR可以由例如天然或成熟B细胞或T细胞的例如种系序列或重排的或未经重排的序列编码。CDR可以是体细胞突变的(例如，与在动物种系中的编码序列不同)、人源化的和/或通过氨基酸取代、添加或缺失修饰的。在一些情况下(例如，针对CDR3)，CDR可以由两个或多个序列(例如种系序列)编码，其是不连续(例如在未经重排的核酸序列中)的，但在B细胞核酸序列中是连续的，例如是序列剪接或连接的结果(例如，V-D-J重组以形成重链⑶R3)。
[0143]当用于描述保守的氨基酸取代时，术语“保守的”包括氨基酸残基被另一个具有带有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链R基的氨基酸残基取代。在通常情况下，保守的氨基酸取代将基本上不会改变所关注蛋白的功能性性质，例如可变区以所需的亲和性与靶表位特异性结合的能力。具有带有相似化学性质的侧链的氨基酸基团的例子包括脂肪族侧链如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂肪族-羟基侧链如丝氨酸和苏氨酸；含有酰胺的侧链如天冬酰胺和谷胺酰胺；芳香侧链如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链如天冬氨酸和谷氨酸；和含硫侧链如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守的氨基酸取代基团包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施方式中，保守的氨基酸取代可以是蛋白中的任意天然残基被丙氨酸取代，例如在丙氨酸扫描诱变中所使用的。在一些实施方式中，制备在PAM2501og-似然性矩阵中具有正值的保守取代，如 Gonnet 等，(1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein SequenceDatabase, Science256:1443-45所公开的,其通过引用并入本申请。在一些实施方式中，所述取代是适度的保守取代，其中所述取代在PAM2501og-似然性矩阵中具有非负值。
[0144]在一些实施方式中，在免疫球蛋白轻链或重链中的残基存在一个或多个保守的氨基酸取代的差异。在一些实施方式中，在免疫球蛋白轻链或其功能性片段(例如可以在例如B细胞中表达和分泌的片段)中的残基位置不等同于本申请列出氨基酸序列的轻链，其差异为存在一个或多个保守的氨基酸取代。
[0145]术语“表位结合蛋白”包括具有至少一个⑶R并且能够选择性识别表位例如能够以约 I 微摩或更低的 Kd (例如 Kd 为约 IxlO-6M, IxlO-7M, IxlO-9M, IxlO-9M, IxlO-10M, IxKT11M 或约Ixl(T12M)与表位结合的蛋白。治疗性表位结合蛋白(例如治疗性抗体)通常要求Kd在纳摩或皮摩范围。
[0146]术语“功能性片段”包括能够表达、分泌并且以在微摩、纳摩或皮摩范围内的Kd与表位特异性结合的表位结合蛋白的片段。特异性识别包括Kd至少在微摩范围、纳摩范围或皮摩范围。
[0147]术语“种系”指在非体细胞突变细胞例如非体细胞突变的B细胞或前-B细胞或造血细胞中的免疫球蛋白核酸序列。
[0148]术语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括源自任意生物体的免疫球蛋白重链恒定区。除非另有明示，否则重链可变结构域包括三个重链CDR和四个FR区。重链的片段包括CDR、⑶R和FRs及其组合。典型的重链具有下述可变结构域(从N端到C端)ChI结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域。重链的功能性片段包括能够特异性识别表位(例如以微摩、纳摩或皮摩范围的Kd识别表位)的片段，所述片段能够由细胞表达和分泌并且包含至少一个CDR。
[0149] 术语“同一性”当与序列一起使用时包括由本领域公知的能够用于测定核苷酸和/或氨基酸序列同一性的多种不同算法确定的同一性。在本申请所述的一些实施方式中，使用空隙开口罚分(open gap penalty)为10.0和空隙扩展罚分(extend gap penalty)为 0.1 的 Clustalff v.1.83 (slow)算法和使用 Gonnet 相似性矩阵(MacVector?10.0.2，MacVector Inc., 2008)确定同一'丨生。用于序列同一'I"生比较的序列的长度取决于特定的序列，但是在轻链恒定结构域的情况下，所述长度应含有足够长的序列以折叠成轻链恒定结构域，其能够自身结合以形成标准的轻链恒定结构域，例如能够形成包含β链的两个β片层并且能够与至少一个人或小鼠的ChI结构域相互作用。在ChI结构域的情况下，所述序列的长度应含有足够长的序列以折叠成ChI结构域，其能够形成包含β链的两个β片层并且能够与至少一个人或小鼠的轻链恒定结构域相互作用。
[0150]短语“免疫球蛋白分子”包括两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链。所述重链可以是相同的或不同的，并且所述轻链可以是相同的或不同的。
[0151]短语“轻链”包括源自任意生物体的免疫球蛋白轻链序列，除非另有明示，否则包括人κ和λ轻链和VpreB以及替代轻链。除非另有明示，否则轻链可变结构域通常包括三个轻链⑶R和四个框架(FR)区。通常地，全长轻链包括由氨基酸端至羧基酸'结构域，其包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，和轻链恒定结构域。轻链包括例如不与第一或第二表位选择性地结合的那些，所述表位由它们的表位结合蛋白选择性结合。轻链还包括结合和识别或者辅助重链的结合和识别的那些，其由它们的表位结合蛋白选择性结合一个或多个表位。
[0152]通用轻链或共同轻链指在如本申请所述小鼠中制备的轻链，其中所述小鼠对用于制备轻链可变结构域的基因片段的选择受到严格限制。作为结果，这种小鼠制备的轻链衍生自，在一个实施方式中，不超过一个或两个未经重排的轻链V片段和不超过一个或两个未经重排的轻链J片段(例如,一个V和一个J、两个V和一个J、一个V和两个J、两个V和两个J)。在一个实施方式中，不超过一个或两个重排的轻链V/J序列，例如重排的人Vk 1-39JK 5序列或重排的人Vk 3-20JK I序列。在不同实施方式中，通用轻链包括体细胞突变(例如，亲和成熟)的版本。
[0153]短语“体细胞突变的”指来自类别转换的B细胞的核酸序列，其中在类别转换B细胞中的免疫球蛋白可变区(例如重链可变结构域或包括重链CDR或FR序列)的核酸序列不同于在类别转换前的B细胞中的核酸序列，例如未经过类别转换的B细胞和经过类别转换的B细胞的CDR或框架核酸序列存在差异。“体细胞突变的”指亲和性成熟的B细胞的核酸序列，其不同于未经过亲和性成熟的B细胞中相应的免疫球蛋白可变区序列(即，种系基因组中的序列)。短语“体细胞突变的”还指在将B细胞与所关注的抗原接触后B细胞的免疫球蛋白可变区核酸序列，其中所述核酸序列不同于将B细胞与所关注的抗原接触前的相应核酸序列。短语“体细胞突变的”指源自已在动物中产生的抗体的序列，例如具有人免疫球蛋白可变区核酸序列的小鼠，其是对免疫挑战的响应，并且是在这种动物中固有运行的选择过程的结果。
[0154]术语“未经重排的”指核酸序列，包括存在于动物种系中的核酸序列。
[0155]短语“可变结构域”包括免疫球蛋白轻链或重链的氨基酸序列(根据需要进行了修饰)，其从N端到C端(除非另有明示)包括如下氨基酸区域:FR1XDR1、FR2、⑶R2、FR3、CDR3、FR4。
[0156]具有人源化的免疫球蛋白基因座的小鼠
[0157]已经通过基因修饰和敲除技术大大地强化了作为基因模型的小鼠，这些技术已经允许研究具体基因的定向过表达或缺失的作用。尽管有许多优点，但所述小鼠仍然存在基因障碍，导致它不能成为人疾病的完美模型，并且不能成为用于测试人治疗剂或制造人治疗剂的完美平台。首先，虽然约99%的人基因具有小鼠同源物(Waterston R.H.etal., (2002), Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome,Nature420:520-562)，但是潜在的治疗剂通常无法与预期人靶标的小鼠直系同源物交叉反应，或交叉反应不充分。为了避免这个问题，可以对选定的靶基因进行“人源化”，也就是说，可以消除小鼠基因并用对应的人直系同源基因序列置换小鼠基因(例如US6，586，251、US6, 596，541和US7, 105，348，其以引用的方式并入本文中)。起初，通过“敲除加基因修饰人源化”策略对小鼠基因进行人源化的工作需要使携带内源基因的缺失(即敲除)的小鼠与携带随机整合的人基因修饰的小鼠进行杂交(参看例如Bril w.S.et al.，(2006)， Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factorVIII cDNA carrying an Arg(593)to Cys substitution，Thromb Haemost95:341-347 ;Homanics G.E.et al.，(2006)，Production and characterization of murine modelsof classic and intermediate maple syrup urine disease， BMC Med Genet7:33 ；Jamsai D.et al.，(2006)，A humanized BAC transgenic/knockout mouse model forHbE/beta-thalassemia，Genomics88 (3):309-15 ;Pan Q.et al.，(2006)，Different rolefor mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor(preTCR)function:human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCRfunction in CD3gamma_and CD3gammadelta—deficient mice， Mol Immunol43:1741-1750)。但这些工作受到尺寸限制的阻碍；常规的敲除技术不足以将大的小鼠基因直接替换为其大的人基因组对应物。因为技术性困难，很少尝试直接同源置换的简单方法，其中在小鼠基因的相同精确基因位置处(即在内源小鼠基因座处)用人对应基因直接置换内源小鼠基因。到目前为止，在直接置换方面的工作涉及精细并且繁琐的操作，因而限制了可处理的基因材料的长度和对基因材料操纵的精确性。 [0158]外源引入的人免疫球蛋白基因修饰在小鼠的前体B细胞中发生重排(AltF.W.，Blackwell T， K， and Yancopoulos G.D.(1985)， Immunoglobulin genes in transgenicmice, Trends Genetl:231-236)。通过使用敲除加基因修饰方法对小鼠进行工程修饰，以表达人抗体而利用了这一发现(Green L.L.et al.，(1994)，Antigen-specifichuman monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy andlight chain YACs, Nat Genet7:13-21 ；Lonberg N.et al.，(2005)，Human antibodyiesfrom transgenic animals.Nat Biotechnol23.1117-1125 ；Lonberg N.et al.，(1994).Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct geneticmodifications，Nature368:856-859 ；Jakobovits A.et al.，(2007)，From XenoMousetechnology to panitumumab， the first fully human antibody product fromtransgenic mice，NatBiotechnol25:1134-1143)。通过使每个内源基因座的较小但关键的部分定向缺失，随后引入人免疫球蛋白基因座位作为随机整合的较大基因修饰(如上所述)或微染色体，使这些内源性小鼠中的小鼠免疫球蛋白重链和κ轻链基因座失活(Tomizuka K.et al.，(2000)，Double trans-chromosomic mice !maintenanceof two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappaloci and expression of fully human antibodies.Proc Natl Acad Sci U SA97:722-727)。所述小鼠代表了基因工程方面的重要进步；从所述小鼠分离的完全人单克隆抗体提供了用于治疗多种人疾病的有希望的治疗潜能(Gibson T.B.et al.，(2006)，Randomized phase III trial results of panitumumab，a fully human ant1-epidermalgrowth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cancer，Clin Colorectal Cancer6:29-31 ； Jakobovitset al., 2007 ；Kim Y.H.et al.，(2007)，Clinical efficacy of zanolimumab(HuMax-CD4):two Phase II studies in refractorycutaneous T-cell lymphoma,Bloodl09(II):4655-62 ;Lonberg，2005 ;Maker A.V.et al.，2005， Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen4blockade and interleukin2:a phase I/II study,AnnSurg 0ncoll2:1005-1016 ；McClung M.R.et al.，(2006)，Denosumab in postmenopausalwomen with low bone mineral density, N Engl J Med354:821-831)。但是，如上文所论述，这些小鼠与野生型小鼠相比展现出受损的B细胞发育，并且有免疫缺乏。这些问题可能会限制小鼠支持有力体液应答的能力，并且因此会限制小鼠产生针对一些抗原的完全人抗体的能力。这些缺陷可归因于:(1)因为随机引入人免疫球蛋白基因修饰而导致的不足功能性，和因为缺少上游和下游控制元件而导致的不正确表达(Gairett F.E.et al.，
(2005)，Chromatinarchitecture near a potential3! end of the IgH locus involvesmodular regulation of histone modifications during B-Cell development andin vivo occupancy at CTCF sites，Mol CellBiol25:1511-1525 ;Manis J.P.et al.，(2003)， Elucidation of a downstream boundary of the3! IgH regulatory region，Mol Immunol39:753-760 ；Pawlitzky 1.et al., (2006), Identification of a candidateregulatory element within the 5! flanking region of the mouse IgH locus definedby pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1， Pax5，and E2A，J Immunol 176:6839-6851) ; (2)人恒定域与小鼠细胞表面上的B细胞受体信号传导复合物的组分之间的低效种间相互作用，其可能损害B细胞的正常成熟、增殖和存活所必需的信号传导过程(Hombach J.et al.，(1990)，Molecular components of theB-cell antigen receptor complex of the IgM class， Nature343:760-762)；和(3)可溶性人免疫球蛋白与小鼠Fe受体之间的低效种间相互作用，其可能会降低亲和力选择(Rao S.P.et al.，(2002)，Differential expression of the inhibitory IgG Fereceptor FcgammaRIIB on germinal center cells -1mplications for selection ofhigh-affinity B cells，JImmunol 169:1859-1868)和免疫球蛋白血清浓度(BrambellF.w.et al.，(1964)，A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism，Nature203:1352-1354 ;Junghans R.P.and Anderson C.L.(1996)，The protection receptor for IgGcatabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transportreceptor, Proc NatlAcadSci USA93:5512-5516 ；Rao et al., 2002 ；Hjelm F.et al.，
(2006)，Antibody-mediated regulation of the immune response， Scand JImmunol64:177-184 ；Nimmerjahn F.and Ravetch J.V.(2007)，Fc-receptors as regulators ofimmunity, Adv Immunol96:179-204)。这些缺陷可以通过仅对小鼠免疫球蛋白基因座的可变区在内源重链和轻链基因座处的天然位置进行原位人源化来校正。这将有效地产生可形成“反转嵌合”(即人V:小鼠C)抗体的小鼠，基于保留的小鼠恒定区，这些抗体将能够与小鼠环境进行正常的相互作用并由其筛选。其它这类反转嵌合抗体可以容易地重新形成用于治疗目的的完全人抗体。
[0159]描述了用人种系免疫球蛋白可变基因对小鼠种系免疫球蛋白可变基因进行大型原位基因置换、同时保留小鼠产生后代的能力的方法。具体来说，描述了 6兆碱基的小鼠重链和κ轻链免疫球蛋白可变 基因座两者被人对应物精确置换，同时仍保持小鼠恒定区完整。因此，已经产生了全体种系免疫球蛋白可变谱系被相应的人种系免疫球蛋白可变序列精确置换、同时保留小鼠恒定区的小鼠。人可变区连接到小鼠恒定区上，形成发生重排并以生理上适当的水平进行表达的嵌合人-小鼠免疫球蛋白基因座。所表达的抗体是“反转嵌合体”，即它们包含人可变区序列和小鼠恒定区序列。具有表达具有人可变区和小鼠恒定区的抗体的人源化免疫球蛋白可变区的这些小鼠被称为VELCOIMMUNE?人源化小鼠。
[0160]VELOCIMMUNE?人源化小鼠展现出具有完全功能的体液免疫系统，其基本上与野生型小鼠的体液免疫系统没有区别。它们在B细胞发育的所有阶段显示正常的细胞群体。它们展现出正常的淋巴样器官形态。VELOC1MMUNE?人源化小鼠的抗体序列展现出正常的可变片段重排和正常的体细胞超突变。这些小鼠中的抗体群体反映了由正常种型转换(例如正常同种型顺式转换)引起的同种型分布。对VELOCIMMUNE?人源化小鼠进行免疫导致了强有力的体液应答，其产生适合用作治疗候选物的具有人免疫球蛋白可变区的庞大且多样性的抗体。这个平台提供了适合于形成药学上可接受的抗体和其它抗原结合蛋白的亲和成熟的人免疫球蛋白可变区序列的丰富来源。[0161]用人免疫球蛋白可变序列对小鼠免疫球蛋白可变序列进行精确置换，使得可以形成VEi (X IMMUNE?人源化小鼠。然而，因为在小鼠与人之间的免疫球蛋白基因座的趋异进化，即便通过对非常大的人免疫球蛋白序列链段进行连续重组工程从而用相应的人免疫球蛋白序列精确置换重链和轻链基因座处的内源小鼠免疫球蛋白序列，也可能出现某些问题。举例来说，散布在免疫球蛋白基因座内的基因间序列在小鼠与人之间不一致，并且在一些情况下可能在功能上不等效。小鼠与人在其免疫球蛋白基因座上的差别仍然可能导致人源化小鼠的异常，尤其当对内源小鼠免疫球蛋白重链基因座的某些部分进行人源化或操纵时。在小鼠免疫球蛋白重链基因座处的一些修饰是有害的。有害的修饰可以包括例如被修饰小鼠交配和产生后代的能力的丧失。
[0162]用对应的1.4兆碱基人基因组序列对小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因座的6兆碱基可变区(Vh-Dh-Jh和V κ -J κ )进行精确的大规模原位置换，同时保持侧接小鼠序列完整并且在杂合基因座内发挥功能，包括所有的小鼠恒定链基因和基因座转录控制区(图1)。具体来说，使用VELOCiGENEiC堪因工程技术，将13个携带人种系可变基因座重叠片段的嵌合型BAC目标载体逐步插入小鼠ES细胞中，从而引入人VH、Dh, JH, Vk和】!^基因序列(参看例如美国专利号 6, 586, 251 和 Valenzuela D.M.et al.， (2003)，High-throughputengineering of the mouse genome coupled with high-resolution expressionanalysis, Nat Biotechnol 21:652-659)。
[0163]小鼠免疫球蛋白基因的人源化代表了迄今为止对小鼠基因组的最大基因修饰。虽然先前用随机整合的人免疫球蛋白基因修饰所进行的工作已经获得了一些成功(上文论述)，但是用人对应物直接置换小鼠免疫球蛋白基因会显著增加用其在其它方面都正常的小鼠中有效地产生完全人抗体的效率。此外，与携带无效内源基因座和完全人抗体基因修饰的小鼠相比，所述小鼠展现出在用几乎任何抗原进行免疫之后可获得的完全人抗体的显著增加的多样性。与在各个分化阶段均展现出显著减少的B细胞群体的具有随机整合的人基因修饰的小鼠相比，多种型式的被置换的人源化基因座展现出完全正常的成熟和不成熟B细胞水平。虽然增加人基因修饰小鼠中的人基因区段数量的工作减少了所述缺陷，但是与野生型小鼠相比，扩大的免疫球蛋白谱系没有完全校正B细胞群体的减少。[0164]尽 管在具有被置换的免疫球蛋白基因座的小鼠中观察到了接近野生型的体液免疫功能，但是当使用免疫球蛋白的直接置换时会遇到在使用随机整合的基因修饰的一些方法中不会遇到的其他问题。免疫球蛋白基因座的基因组成在小鼠与人之间的差别已经导致对具有被置换的免疫球蛋白基因区段的小鼠的繁殖有利的序列的发现。具体来说，在具有被置换的免疫球蛋白基因座的小鼠中最好存在位于内源免疫球蛋白基因座内的小鼠ADAM基因，因为它们在生育力方面发挥功能。
[0165]小鼠ADAM6的基因位置和功能
[0166]缺少表达任何功能性ADAM6蛋白能力的雄性小鼠展现出严重的小鼠交配和产生后代的能力缺陷。通过用人可变区基因区段置换所有或基本上所有小鼠免疫球蛋白可变区基因区段，使得所述小鼠缺乏表达功能性ADAM6蛋白的能力。ADAM6功能之所以丧失是因为ADAM6基因座位于内源小鼠免疫球蛋白重链可变区基因座位的邻近Vh基因区段基因座3’端的区域中，所述Vh基因区段基因座在Dh基因区段的上游。为了繁殖就人重链可变基因区段对所有或基本上所有内源小鼠重链可变基因区段的置换来说为纯合型的小鼠，建立就所述置换来说各自为纯合型的雄性和雌性小鼠并等待生殖交配通常是一项繁琐的方法。成功幼仔相当少见并且平均产仔的数量很少。相反地，已经使用了就所述置换来说为杂合型的雄性小鼠与就所述置换来说为纯合型的雌性小鼠进行交配，以产生就所述置换来说为杂合型的后代，然后从所述后代繁殖纯合型小鼠。本发明人已经确定了雄性小鼠生育力丧失的可能原因在于纯合型雄性小鼠中不存在功能性ADAM6蛋白。
[0167]ADAM6蛋白是ADAM蛋白家族的一员，其中ADAM是A去整合素和金属蛋白酶(ADisintegrinAnd Metalloprotease)的首字母缩写。ADAM蛋白家族是庞大并且多样性的，并具有多种功能。ADAM家族的一些成员参与到精子产生和受精中。举例来说，ADAM2编码参与到精子-卵子相互作用中的蛋白受精素(fertilin)的亚单元。ADAM3或cyritestin似乎是精子与透明带的结合所必需的。ADAM2或ADAM3的缺失都会导致不育。已经假设ADAM2、ADAM3和ADAM6在小鼠精细胞表面上形成复合物。
[0168]通常在Avh基因区与νΗ6-1之间存在的人ADAM6基因似乎是假基因(图12)。在小鼠中，有存在于小鼠￥11与011基因区段之间的基因间区域中的两种ADAM6基因——ADAM6a和ADAM6b，并且在小鼠中，a和b基因的转录方向与周围的免疫球蛋白基因区段的转录方向相反(图11)。在小鼠中，功能性ADAM6基因座显然是正常受精所必需的。那么，功能性ADAM6基因座或序列是指能够补偿或挽救在缺少功能性内源ADAM6基因座或具有受损的内源ADAM6基因座的雄性小鼠中所表现的显著降低的受精作用。
[0169]小鼠中编码ADAM6a和ADAM6b的基因间序列的位置使得所述基因间序列在修饰内源小鼠重链时容易被修饰。当Vh基因区段缺失或被置换时，或者当DH基因区段缺失或被置换时，获得的小鼠有很高的概率会表现出严重的生育力缺陷。为了补偿这种缺陷，对小鼠进行修饰以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码补偿因内源小鼠ADAM6基因座修饰所致的ADAM6活性丧失的蛋白质。在各实施方案中，所述补偿性核苷酸序列是编码挽救生育力缺陷的小鼠ADAM6a、小鼠ADAM6b或其同系物或直系同源物或功能片段的核苷酸序列。
[0170]所述挽救生育力的核苷酸序列可以被放置在任何合适位置。其可以被放置在所述基因间区域中，或放置在基因组中的任何合适位置(即异位地)。在一个实施方案中，所述核苷酸序列可以被引入随机整合入小鼠基因组的基因修饰中。在一个实施方案中，所述序列可以被维持在附加体上，也就是说维持在另外的核酸上而不是小鼠染色体上。合适位置包括转录上允许或有活性的位置，例如R0SA26基因座。
[0171]术语“异位”旨在包括移位，或在自然界中通常不会遇到的位置处的放置(例如，核酸序列的放置位置在与野生型小鼠中发现的所述核酸序列的位置不同)。在各实施方案
中，所述术语在其对象脱离正常或正确位置的意义上使用。举例来说，短语“编码......的
异位核苷酸序列”是指在小鼠中通常不会遇到的位置处出现的核苷酸序列。举例来说，在编码小鼠ADAM6蛋白(或其对雄性小鼠提供相同或类似生育益处的直系同源物或同系物或片段)的异位核苷酸序列的情况下，所述序列可以被放置在小鼠基因组中与野生型小鼠中通常发现的位置不同的位置处。小鼠ADAM6的功能性同系物或直系同源物是对ADAM6+小鼠中观察到的生育力丧失(例如雄性小鼠通过交配产生后代的能力的丧失)进行挽救的序列。功能性同系物或直系同源物包括下述的蛋白质:其与ADAM6a的氨基酸序列和/或ADAM6b的氨基酸序列具有至少约89%或更高同一性，例如具有最高达的99%同一性，并且能够补偿或挽救基因型包含ADAM6a和/或ADAM6b缺失或敲除的小鼠成功交配的能力。
[0172]异位位置可以是任何地方(例如，与含有小鼠ADAM6序列的基因修饰的随机插入一样)，或者可以位于例如接近(但不正好是)其在野生型小鼠中的位置的位置(例如在被修饰的内源小鼠免疫球蛋白基因座中，但在其天然位置的上游或下游，例如在被修饰的免疫球蛋白基因座中，但介于不同基因区段之间，或在小鼠V-D基因间序列中的不同位置处)。异位放置的一个实例是放置在人源化免疫球蛋白重链基因座内。举例来说，可以对包含人Vh基因区段对一个或多个内源Vh基因区段的置换的小鼠(其中所述置换去除了内源ADAM6序列)进行工程修饰，以具有位于含有人Vh基因区段的序列内的小鼠ADAM6序列。得到的修饰将在人基因序列内产生(异位)小鼠ADAM6序列，并且所述小鼠ADAM6序列在人基因序列内的(异位)放置可以接近于人ADAM6假基因的位置(即在两个V区段之间)或可以接近于小鼠ADAM6序列的位置(即在V-D基因间区域内)。
[0173]在各个方面，可以产生包含内源重链可变区基因座或其部分的缺失或置换的小鼠，其含有编码赋予与小鼠ADAM6类似的生育力好处的蛋白质(例如在雄性小鼠中发挥功能的其直系同源物或同系物或片段)。异位核苷酸序列可以包括以下核苷酸序列，其编码作为不同小鼠品系或不同种(例如不同啮齿动物种)的ADAM6同系物或直系同源物(或其片段)的蛋白质，并赋予生育力好处，例如在规定时期内的窝数的增加，和/或每窝幼崽数的增加，和/或雄性小鼠的精细胞通过小鼠输卵管使小鼠卵子受精的能力。
[0174]在一个实施方案中，所述ADAM6是与小鼠ADAM6蛋白有至少89%到99%同一性(例如与小鼠ADAM6a或小鼠ADAM6b有至少89%到99%同一性)的同系物或直系同源物。在一个实施方案中，所述异位核苷酸序列编码一种或一种以下蛋白质，所述蛋白质独立选自与小鼠ADAM6a有至少89 %同一性的蛋白质、与小鼠ADAM6b有至少89 %同一性的蛋白质和其组合。在一个实施方案中，所述同系物或直系同源物是与小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b有约89%或以上同一性或者被修饰成与小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b有约89%或以上同一性的大鼠、仓鼠、小鼠或豚鼠蛋白质。在一个实施方案中，所述同系物或直系同源物与小鼠 ADAM6a 和 / 或小鼠 ADAM6b 有 90 %、91 %、92 %、93 %、94%、95 %、96 %、97 %、98%或99%同一性。
[0175] 在人源化的重链小鼠中的异位ADAM6[0176]形成人抗体的小鼠已经获得了一段时间。虽然这些小鼠代表了人治疗抗体开发上的重要进步，但是这些小鼠显示了限制其实用性的许多显著异常。举例来说，其显示受损的B细胞发育。该受损的发育可能是因为基因修饰小鼠与野生型小鼠之间的多种差异。
[0177]人抗体可能不会与小鼠细胞表面上的小鼠前B细胞或B细胞受体进行最佳的相互作用，所述受体在克隆选择期间为成熟、增殖或存活提供信号。完全人抗体可能不会与小鼠Fe受体系统进行最佳的相互作用；小鼠表达的Fe受体不显示与人Fe受体的一一对应关系。最后，形成完全人抗体的各种小鼠不包含可能是野生型B细胞发育所必需的所有真小鼠序列，例如下游增强子元件和其它基因座控制元件。
[0178]形成完全人抗体的小鼠一般包含以某种方式失能内源免疫球蛋白基因座，并且包含可变和恒定免疫球蛋白基因区段的人基因修饰被引入小鼠基因组的随机位置中。只要内源基因座经过充分失能从而无法重排基因区段以形成功能性免疫球蛋白基因，那么就可以实现在这类小鼠中形成完全人抗体的目标，虽然B细胞发育受损。
[0179]虽然不得不从人基因修饰座位形成完全人抗体，但是在小鼠中产生人抗体显然是一种不利的方法。在一些小鼠中，这种方法是如此地不利，以至于会通过反式转换(trans-switching)机制形成嵌合型人可变/小鼠恒定重链(而不是轻链)。通过这种机制，编码完全人抗体的转录物会经历同种型反式转换，从人同种型转换为小鼠同种型。这个过程是反式的，因为完全人基因修饰的位置远离保留小鼠重链恒定区基因的未被破坏拷贝的内源基因座。虽然在所述小鼠中反式转换容易是显而易见的，但是这个现象仍然不足以挽救B细胞发育，B细胞发育仍然是明显受损的。在任何情况下，在所述小鼠中形成的反式转换抗体都保留完全人轻链，因为轻链显然不会发生反式转换现象；据推测，反式转换依赖于正常同种型顺式转换中使用的内源基因座(虽然不同)中的转换序列。因此，即使当经过工程修饰以形成完全人抗体的小鼠选择反式转换机制形成具有小鼠恒定区的抗体时，这种策略仍然不足以挽救正常B细胞发育。
[0180]形成基于抗体的人治疗剂中的主要问题在于形成足够大多样化的人免疫球蛋白可变区序列以鉴别可用的可变域，这些可变域特异性地识别特定表位并以期望亲和力(通常以高亲和力，但不总是)与其结合。在开发出VELOCIMMUNE?人源化小鼠之前，并没有人指出，表达人可变区和小鼠恒定区的小鼠与从基因修饰形成人抗体的小鼠有任何显著的差别。然而，这个推测是不正确的。
[0181]在内源小鼠基因座处含有人免疫球蛋白可变区对小鼠免疫球蛋白可变区的精确置换的VELOCIMMUNE?人源化小鼠就B细胞发育来说显示与野生型小鼠令人意外并且显著的相似性。在一项令人意外并且令人震惊的研究中，VELOCIMMUNE?人源化小鼠对于免疫作用显示了基本正常的野生型反应，其与野生型小鼠仅有一个显著不同，即响应于免疫作用而产生的可变区是完全人可变区。
[0182]VELOCIMMUNEOi人源化小鼠在内源基因座处含有对应人免疫球蛋白可变区对小鼠免疫球蛋白重链(IgH)和免疫球蛋白轻链(例如κ轻链、IgK)的种系可变区的精确大规模置换。总体上，约6兆碱基的小鼠基因座被约1.4兆碱基的人基因组序列置换。这种精确置换产生了具有杂合免疫球蛋白基因座的小鼠，所述杂合免疫球蛋白基因座形成具有人可变区和小鼠恒定区的重链和轻链。小鼠Vh-Dh-Ji^P Vk-Jk区段的精确置换使杂合免疫球蛋白基因座处的侧接小鼠序列保持完整并发挥功能。小鼠的体液免疫系统像野生型小鼠一样发挥功能。B细胞发育没有在任何重大方面受到阻碍，并且在抗原攻击后在小鼠中产生多种多样的人可变区。
[0183]VELOCIMMUNE?人源化小鼠是可行的，因为重链和κ轻链的免疫球蛋白基因区段在人和小鼠中类似地重排，这并不是说它们的基因座相同甚或几乎相同一显然它们不相同。然而，这些基因座足够类似，导致重链可变基因座的人源化可以通过用约I百万碱基的连续人基因组序列置换约3百万碱基对的连续小鼠序列来实现，所述连续小鼠序列含有所有的VH、D1^P Jh基因区段，所述连续人基因组序列基本覆盖来自于人免疫球蛋白基因座的同等序列。
[0184]在一些实施方案中，用人基因序列进一步置换某些小鼠恒定区基因序列(例如用人ChI序列置换小鼠ChI序列，和用人Q序列置换小鼠Q序列)产生了具有杂合免疫球蛋白基因座的小鼠，所述小鼠产生具有人可变区和部分人恒定区的抗体，所述人可变区和部分人恒定区适合于(例如)产生完全人抗体片段，例如完全人Fab。具有杂合免疫球蛋白基因座的小鼠展现出正常的可变基因区段重排、正常的体细胞超突变和正常的种型转换。这些小鼠展现出与野生型小鼠无法区别的体液免疫系统，并显示在B细胞发育所有阶段的正常细胞群体和正常淋巴样器官结构一甚至在所述小鼠缺少人可变区基因区段的完全谱系的情况下。对这些小鼠进行免疫导致了稳固的体液应答，其显示多种多样的可变基因区段使用。
[0185]对小鼠种系可变区基因区段的精确置换允许形成具有部分人免疫球蛋白基因座的小鼠。因为所述部分人免疫球蛋白基因座正常地发生重排、超突变和种型转换，所以所述部分人免疫球蛋白基因座在小鼠中产生包含人可变区的抗体。可以鉴别和克隆编码可变区的核苷酸序列，然后使其与任何所选序列(例如适合于特定用途的任何免疫球蛋白同种型)融合(例如在体外系统中)，从而产生完全来源于人序列的抗体或抗原结合蛋白。
[0186]使用通过重组工程方法进行的大规模人源化来修饰小鼠胚胎干(ES)细胞，以用具有最闻达I兆喊基的人基因组序列的相应人基因区段精确置换最闻达3兆喊基的小鼠重链免疫球蛋白基因座，所述小鼠重链免疫球蛋白基因座包含基本上所有的小鼠VH、Dh和Jh基因区段，所述人基因组序列含有一些或基本上所有的人VH、D1^P Jh基因区段。使用最高达0.5兆碱基的人基因组区段置换3兆碱基的包含基本上所有小鼠V κ和】!^基因区段的小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座区段，所述人基因组区段包含编码基本上所有人V K和了!^基因区段的两个重复单元中的一个重复单元。
[0187]具有所述被置换的免疫球蛋白基因座的小鼠可以包含内源小鼠ADAM6基因座的破坏或缺失，所述破坏或缺失通常存在于小鼠免疫球蛋白重链基因座处的3’端Vh基因区段与5’端Dh基因区段之间。这个区域中的破坏可以降低或消除内源小鼠ADAM6基因座的功能性。如果在置换中使用人重链谱系的3’端￥11基因区段，那么在这些Vh基因区段之间(即在人￥111-2与￥111-6之间)存在的基因间区域含有似乎是人ADAM6假基因的假基因。然而，包含这个人基因间序列的雄性小鼠展现出很少或没有生育力。
[0188]描述的小鼠包含如上所 述被置换的基因座，而且还包含编码小鼠ADAM6的异位核酸序列，其中所述小鼠展现出基本上正常的生育力。在一个实施方案中，所述异位核酸序列是SEQ ID NO:3，其被放置在被修饰的内源小鼠重链基因座处的人之间。SEQID NO:3的ADAM6基因的转录方向与周围人Vh基因区段的转录方向是相反的。虽然本文中的实例给出通过在指定人Vh基因区段之间放置异位序列来挽救生育力，但是技术人员将认识到，异位序列在小鼠基因组中的任何合适的转录允许基因座处(甚或染色体外)的放置将被预期会以相似的方式挽救雄性小鼠的生育力。
[0189]用包含小鼠ADAM6基因或其直系同源物或同系物或功能片段的异位序列对缺少功能性ADAM6基因座的小鼠进行补偿的现象是可应用来挽救具有非功能性或最小功能性的内源ADAM6基因座的任何小鼠的一种通用方法。因此，可以用本发明的组合物和方法挽救包含免疫球蛋白重链基因座的ADAM6破坏性修饰的很多种小鼠。因此，本发明包括具有多种免疫球蛋白重链基因座修饰的小鼠，这些修饰损害了内源ADAM6功能。本说明书中提供了一些(非限制性)实例。除了描述的VELOCIMMUNE?人源化小鼠以外，与ADAM6相关的组合物和方法也可以用在很多应用中，例如在以多种方式修饰重链基因座时。
[0190]在一个方面，提供了下述的一种小鼠，其包含编码功能性ADAM6蛋白(或其直系同源物或同系物或功能片段)的异位ADAM6序列、一个或多个人Vh基因区段对所有或基本上所有小鼠％基因区段的置换、人Dh和人Jh基因区段对所有或基本上所有小鼠Dh基因区段和Jh基因区段的置换；其中所述小鼠缺少ChI和/或铰链区。在一个实施方案中，所述小鼠产生单可变区结合蛋白，其是免疫球蛋白链的二聚体，选自:(a) AVh-小鼠Ch1-小鼠CH2-小鼠Ch3 ； (b)人Vh-小鼠铰链-小鼠Ch2-小鼠Ch3 ;和(c)人Vh-小鼠CH2-小鼠CH3。 [0191 ] 在一个方面，所述挽救生育力的核苷酸序列被放置在小鼠中的人免疫球蛋白重链可变区序列内(例如在人Vh1-2与Vh1-6基因区段之间)，其中所述小鼠的全部或几乎全部小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段(mVH的、mDH的和mJH的)被一个或多个人免疫球蛋白重链可变基因区段(hVH的、hDH的和hJH的)置换，并且所述小鼠进一步包含一个或多个人免疫球蛋白κ轻链可变基因区段QiVk的和hjK的)对全部或几乎全部小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段(mVK的和mJK的)的置换。在一个实施方案中，所述核苷酸序列被放置在VELOCiMMlJNE?人源化小鼠的人VH1_2基因区段与人VH1_6基因区段之间(US6, 596，541和US7，105, 348，其以引用的方式并入本文)。在一个实施方案中，如此修饰的VELOCIMMUNE?人源化小鼠包含全部或几乎全部的人免疫球蛋白重链可变基因片段(全部hVH的、hDH的和/或hJH的)和全部或几乎全部的人免疫球蛋白κ轻链可变基因区段OiVk的和hjK的)的取代。
[0192]在一个方面，功能性小鼠ADAM6基因座(或其直系同源物或同系物或功能片段)可以位于取代内源小鼠Vh基因区段的人Vh基因片段的中间。在一个实施方案中，去除全部或几乎全部的小鼠Vh基因区段并用一个或多个人Vh基因区段置换，并且所述小鼠ADAM6基因座紧邻人Vh基因区段的3’端，或存在于两个人Vh基因区段之间。在一个特定实施方式中，小鼠的ADAM6基因座位于插入的人Vh基因片段3’端附近的两个Vh基因片段之间。在一个特定实施方式中，取代包括人Vh基因片段Vh1-2和VH6-1，并且小鼠ADAM6基因座位于VH1_2基因片段的下游和VH6-1基因片段的上游。在一个特定实施方式中，然后AVh基因片段的排布如下(相对于人Vh基因片段的转录方向由上游至下游)iVHl-2-小鼠ADAM6基因座-人Vh6-1。在一个特定实施方式中，在人Vh1-2和人Vh6-1之间的ADAM6假基因被小鼠ADAM6基因座取代。在一个实施方式中，一个或多个小鼠ADAM6基因座的小鼠ADAM6a和小鼠ADAM6b转录的方向与人Vh基因片段的方向相反。或者，小鼠ADAM6基因座可以位于3’ -端人Vh基因片段和5’ -端Dh基因片段之间的基因间区域。无论5’ -端Dh基因片段是小鼠的还是人的均可以是这样的情况。
[0193]类似地，可以对被置换所有或基本上所有内源小鼠Vh基因区段的一个或多个人'基因区段(例如Vk或VA区段)修饰的小鼠进行修饰，目的是维持内源小鼠ADAM6基因座(如上所述)，例如通过使用具有包含小鼠ADAM6基因座或其功能片段的下游同源臂的目标载体；或者目的是用被放置在两个人\基因区段之间或者所述人\基因区段与Dh基因区段(无论人还是小鼠，例如VX+m/hDH)或J基因区段(无论人还是小鼠，例如V κ+Jh)之间的异位序列置换受损的小鼠ADAM6基因座。在一个实施方案中，所述置换包括两个或两个以上人\基因区段，并且所述小鼠ADAM6基因座或其功能片段位于所述两个3’端八基因区段之间。在一个具体实施方案中，然后发生人'基因区段的重排(就人基因区段的转录方向来说从上游到下游):人'3’-1-小鼠ADAM6基因座-人'3’。在一个实施方案中，就转录方向来说，所述小鼠ADAM6基因座的一个或多个小鼠ADAM6a和小鼠ADAM6b的方向与人\基因区段的方向相反。或者，所述小鼠ADAM6基因座位于3’端人\基因区段与5’端Dh基因区段之间的基因间区域中。无论5’端Dh区段是小鼠的还是人的，情况都是如此。[0194]在一个方面，提供了一种具有一个或多个内源小鼠Vh基因区段的置换并包含至少一个内源小鼠Dh基因区段的小鼠。在这类小鼠中，所述内源小鼠乂11基因区段的修饰可以包含对一个或多个3’端Vh基因区段但不是5’端Dh基因区段的修饰，其中应当小心以使得所述一个或多个3 ’端Vh基因区段的修饰不会破坏内源小鼠ADAM6基因座或使内源小鼠ADAM6基因座不具有功能。举例来说，在一个实施方案中，所述小鼠包含一个或多个人Vh基因区段对所有或基本上所有内源小鼠％基因区段的置换，并且所述小鼠包含一个或多个内源Dh基因区段和功能性内源小鼠ADAM6基因座。
[0195]在另一个实施方案中，所述小鼠包含内源小鼠3’端Vh基因区段的修饰和一个或多个内源小鼠011基因区段的修饰，并且进行所述修饰以将所述内源小鼠ADAM6基因座的完整性维持到所述内源ADAM6基因座保持功能的程度。在一个实施例中，以两个步骤进行这种修饰:(1)利用具有上游同源臂和下游同源臂的目标载体，用一个或多个人％基因区段置换3’端内源小鼠Vh基因区段，其中所述下游同源臂包含功能性小鼠ADAM6基因座的全部或一部分；(2)然后用具有包含小鼠ADAM6基因座的全部或功能部分的上游同源臂的目标载体置换内源小鼠Dh基因区段。
[0196]在各个方面，在修饰会破坏内源小鼠ADAM6的功能时，利用含有对小鼠ADAM6蛋白或其直系同源物或同系物或功能性片段进行编码的异位序列的小鼠是有用的。当对小鼠免疫球蛋白基因座进行修饰时，尤其当修饰小鼠免疫球蛋白重链可变区和周围序列时，破坏内源小鼠ADAM6功能的概率很高。因此，当产生免疫球蛋白重链基因座完全或部分缺失、被完全或部分人源化或被完全或部分置换(例如用Vk或νλ序列置换)的小鼠时，所述小鼠提供了特别的益处。针对以下描述的小鼠所描述的进行基因修饰的方法对于所属领域技术人员是已知的。
[0197]含有下述的异位序列的小鼠在与对小鼠免疫球蛋白重链可变区基因座位所作的破坏内源小鼠ADAM6序列或使之缺失的修饰结合时特别有用，所述异位序列编码小鼠ADAM6蛋白或赋予小鼠ADAM6蛋白的生育力益处的基本相同或类似的蛋白质。虽然主要结合表达具有人可变区和小鼠恒定区的抗体的小鼠进行了描述，但是所述小鼠也可与破坏内源小鼠ADAM6基因的任何基因修饰结合使用。技术人员将认识到这涵盖含有小鼠免疫球蛋白重链可变区基因座位的修饰的多种基因修饰小鼠。例如，这些小鼠包括全部或一部分小鼠免疫球蛋白重链基因区段缺失或被置换的小鼠，而不管其它修饰如何。以下描述非限制性实例。
[0198]在一些方面，提供了下述的基因修饰小鼠，其包含在小鼠中发挥功能的异位小鼠、啮齿动物或其它ADAM6基因(或直系同源物或同系物或片段)，和一个或多个人免疫球蛋白可变区和/或恒定区基因区段。
[0199]在一个方面,提供了一种下述的小鼠,其包含编码功能性ADAM6蛋白的异位ADAM6序列、一个或多个人Vh基因区段对所有或基本上所有小鼠Vh基因区段的置换、一个或多个人Dh基因区段对所有或基本上所有小鼠Dh基因区段的置换、和一个或多个人Jh基因区段对所有或基本上所有小鼠Jh基因区段的置换。
[0200]在一个实施方案中,所述小鼠进一步包含人ChI核苷酸序列对小鼠ChI核苷酸序列的置换。在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含人铰链核苷酸序列对小鼠铰链核苷酸序列的置换。在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含人免疫球蛋白轻链可变基因座对免疫球蛋白轻链可变基因座(\和1)的置换。在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含人免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列对小鼠免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列的置换。在一个具体实施方案中，所述'、I和Q是免疫球蛋白κ轻链序列。在一个具体实施方案中，所述小鼠包含与人铰链和人ChI序列融合的小鼠Ch2和小鼠Ch3免疫球蛋白恒定区序列，使得所述小鼠免疫球蛋白基因座重排形成编码结合蛋白的基因，所述结合蛋白包含(a)具有人可变区、人C0I区、人铰链区以及小鼠Ch2和小鼠Ch3区的重链，和(b)编码包含人可变域和人恒定区的免疫球蛋白轻链的基因。
[0201]在一个方面,提供了下述的一种小鼠,其包含编码功能性ADAM6蛋白的异位ADAM6序列、一个或多个人'基因区段对所有或基本上所有小鼠Vh基因区段的置换，和任选的一个或多个人Dh基因区段和/或人Jh基因区段对所有或基本上所有Dh基因区段和/或Jh基因区段的置换，或任选的一个或多个人I基因区段对所有或基本上所有Dh基因区段和/或Jh基因区段的置换。
[0202]在一个实施方案中，所述小鼠包含一个或多个\、一个或多个Dh和一个或多个J基因区段(例如Jk或JX)对所有或基本上所有小鼠Vh、Dj^P上基因区段的置换，其中所述基因区段可操作地连接到内源小鼠铰链区上，其中所述小鼠形成重排的免疫球蛋白链基因，其在转录方向上从5 ’到3 ’含有人人或小鼠Dh-人或小鼠J-小鼠铰链-小鼠Ch2_小鼠(^3。在一个实施方案中，所述J区是人J κ区。在一个实施方案中，所述J区是人Jh区。在一个实施方案中，所述J区是人JX区。在一个实施方案中，所述人'区选自人νλ区和人V κ区。
[0203]在具体实施方案中，所述小鼠表达具有小鼠或人恒定区和来源于以下的可变区的单可变域抗体:人Vk、人Dh和人Jk JVk ^Dh和人Jh;人V λ ^Dh和人J λ ?’人V λ、ADh和人Jh ;人Vk、人Dh和人J λ Ανλ、ADH和人Jk。在具体实施方案中，对重组识别序列进行修饰以允许在所叙述的V、D和J基因区段之间或在所叙述的V和J基因区段之间发生大量重排。
[0204] 在一个方面，提供了下述的一种小鼠，其包含编码功能性ADAM6蛋白(或其直系同源物或同系物或功能片段)的异位ADAM6序列、一个或多个人\基因区段对所有或基本上所有小鼠Vh基因区段的置换、人叉基因区段对所有或基本上所有小鼠Dh基因区段和Jh基因区段的置换；其中所述小鼠缺少ChI和/或铰链区。
[0205]在一个实施方案中，所述小鼠缺少编码ChI结构域的序列。在一个实施方案中，所述小鼠缺少编码铰链区的序列。在一个实施方案中，所述小鼠缺少编码ChI结构域和铰链区的序列。
[0206]在一个具体实施方案中，所述小鼠表达的结合蛋白包含融合到小鼠Ch2结构域上的人免疫球蛋白轻链可变域(λ或κ)，所述小鼠(^2结构域连接到小鼠CH3结构域上。
[0207]在一个方面，提供了下述的一种小鼠，其包含编码功能性ADAM6蛋白(或其直系同源物或同系物或功能片段)的异位ADAM6序列、一个或多个人\基因区段对所有或基本上所有小鼠Vh基因区段的置换、人叉基因区段对所有或基本上所有小鼠Dh和Jh基因区段的置换。
[0208]在一个实施方案中，所述小鼠包含编码ChI区、铰链区、ChI和铰链区、或者ChI区和铰链区和Ch2区的免疫球蛋白重链恒定区基因序列的缺失。
[0209]在一个实施方案中，所述小鼠产生单可变域结合蛋白，其包含选自以下的同型二聚体:(a)人小鼠Ch1-小鼠Ch2-小鼠Ch3 ； (b)人小鼠铰链-小鼠CH2_小鼠CH3 ； (c)人Vf小鼠Ch2-小鼠Ch3。
[0210]在一个方面，提供了一种具有失能内源重链免疫球蛋白基因座的小鼠，所述失能内源重链免疫球蛋白基因座包括失能或缺失的内源小鼠ADAM6基因座，其中所述小鼠包含表达人或小鼠或人/小鼠或其它嵌合抗体的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸序列存在于随机整合入小鼠基因组中的整合基因修饰。在一个实施方案中，所述核酸序列位于不存在于野生型小鼠中的附加体(例如染色体)上。
[0211]共同的或通用的轻链
[0212]此前制备有用的多特异性表位结合蛋白例如双特异性抗体的努力，受到了各种各样问题的阻碍，这些问题通常具有一个共同的模式:对序列进行体外选择或操作以合理设计或通过试错法设计用于配对异二聚体双特异性人免疫球蛋白的适宜形式。不幸的是，如果不是全部的话，大部分提供的体外设计方法在很大程度上仅是临时性的，如果有的话，也仅针对个别分子。另一方面，尚未实现引入复杂的生物体选择能够用于人类治疗的适宜配对的体内方法。
[0213]在通常情况下，天然的小鼠序列通常不是人治疗序列的好来源。至少是因为这个原因，产生与共同人轻链配对的小鼠重链免疫球蛋白可变区的实用价值有限。更多的体外工程的努力均花费在通过试错法尝试将小鼠重链可变序列人源化上，同时希望保持表位特异性和亲和性并保持与共同人轻链偶联的能力，但其结果还是个未知数。在这样一个过程结束时，最终产品可能维持一些特异性和亲和性，并且与共同轻链结合，但是其最终在人体内的免疫原性可能仍具有较高的风险。
[0214]因此，用于制备人用治疗剂的适宜小鼠将包括适宜的使用人重链可变区基因片段的较大库取代内源性小鼠重链可变区基因片段 。所述人重链可变区基因片段应能够重排并与内源性小鼠重链恒定结构域再结合以形成反向嵌合重链(即包含人可变结构域和小鼠恒定区的重链)。所述重链应能够类别转换和体细胞超突变以产生适宜的重链可变结构域的较大库以供小鼠选择一个能够与人轻链可变区的有限库结合的部分。[0215]具有针对多个重链的共同轻链的小鼠具有实用价值。在不同实施方式中，在仅能表达共同轻链的小鼠中表达的抗体将具有能够与相同或基本相同的轻链结合并表达的重链。这在制备双特异性抗体中特别有用。例如，可以使用第一免疫原对这种小鼠进行免疫以产生表达特异性与第一表位结合的抗体的B细胞。可以使用第二免疫原对所述小鼠(或基因相同的小鼠)进行免疫以产生表达特异性与第二表位结合的抗体的B细胞。可以从B细胞中克隆可变重链区并与相同的重链恒定区和相同的轻链一同表达，并且在细胞中表达以制备双特异性抗体，其中通过结合并表达轻链组分的小鼠选择双特异性抗体的轻链组分。
[0216]发明人已经设计了用于制备免疫球蛋白轻链的小鼠，所述轻链适宜地与非常多样化的重链家族配对，包括可变区脱离种系序列的重链，例如亲和性成熟或体细胞突变的可变区。在不同实施方式中，将所述小鼠设计成将人轻链可变结构域与包含体细胞突变的人重链可变结构域配对，这样能够找到一种制备适用于人类治疗的高亲和性结合蛋白的方法。
[0217]基因工程小鼠通过生物体内漫长而复杂的抗体选择过程将人重链可变结构域的多种选择与数量有限的人轻链选择配对以获得生物学上适宜的选择。为了达到这个目的，将所述小鼠工程化修饰以使数量有限的人轻链可变结构域的选择与广泛多样的人重链可变结构域的选择相结合。在使用抗原攻击后，小鼠将其库中解决方式的数量最大化以产生针对抗原的抗体，主要或单独地限制其库中轻链选择的数量。在不同实施方式中，这包括允许小鼠的轻链可变结构域进行适宜的和相容的体细胞突变，这将不仅仅是与相对多种多样的人重链可变结构域具有相容性，还特别地包括体细胞突变的人重链可变结构域。
[0218]为获得有限的轻链选择的库，对小鼠进行工程化修饰以使其不能或基本上不能制备或重排天然的小鼠轻链可变结构域。这可以通过例如将小鼠的轻链可变区基因片段缺失实现。然后以使得所述外源性人可变区基因片段能够与所述内源性小鼠轻链恒定区基因组合并且形成重排的反向嵌合轻链基因(人可变区，小鼠恒定区)的方式，通过选择外源性适宜的人轻链可变区基因片段对内源性小鼠基因座进行修饰，外源性人可变区基因片段可操作地与内源性小鼠轻链恒定结构域连接。在不同实施方式中，所述轻链可变区是能够被体细胞突变的。在不同实施方式中，为了使轻链可变区获得体细胞突变的能力达到最大，在小鼠中保留适宜的增强子。例如，在经修饰的小鼠κ轻链基因座中使用人κ轻链基因片段取代内源性小鼠K轻链基因片段，使小鼠K内含子增强子和小鼠K 3’增强子的功能保留或未被破坏。
[0219]提供了一种基因工程小鼠，所述小鼠表达有限的与多种反向嵌合(人可变区，小鼠恒定区)重链结合的反向嵌合(人可变区，小鼠恒定区)轻链库。在不同实施方式中，内源性小鼠κ轻链基因片段缺失并被与内源性小鼠Cκ基因可操作地连接的单一(或两个)重排的人轻链区取代。在重排的人轻链区体细胞超突变最大化的实施方式中，保留了小鼠κ内含子增强子和小鼠κ 3’增强子。在不同实施方式中，所述小鼠还包含无功能的λ轻链基因座或该基因座的缺失，或者使得所述基因座无法产生λ轻链的缺失。
[0220]提供了一种基因工程小鼠，在不同实施方式中，所述小鼠包含缺乏内源性小鼠轻链'和I基因片段并且包含重排的人轻链可变区的轻链可变区基因座，在一个实施方式中重排的人'/I序 列可操作地与小鼠恒定区连接，其中所述基因座能够经历体细胞超突变，并且其中所述基因座表达包含与小鼠恒定区连接的人'/叉序列的轻链。因此，在不同实施方式中，所述基因座包含小鼠K 3’增强子，其与正常或野生水平的体细胞超突变相关。
[0221]在不同实施方式中，当使用所关注的抗原免疫时，基因工程小鼠产生显示出多种人免疫球蛋白重链可变区重排的B细胞，所述人免疫球蛋白重链可变区与一个或两个重排的轻链一同表达并发挥功能，包括其中一个或两个轻链包含人轻链可变区的实施方式，其中所述轻链可变区包括例如I至5个体细胞突变。在不同实施方式中，这样表达的人轻链能够与在小鼠中表达的任意人免疫球蛋白重链可变区结合并一同表达。
[0222]与一个以上表位结合的表位结合蛋白
[0223]本申请所述的组合物和方法能够用于制备以高亲和性结合一个以上表位的结合蛋白，例如双特异性抗体。本发明的益处包括能够选择适宜的高结合性(例如，亲和成熟的)重链免疫球蛋白链，其均与单一轻链结合。[0224]双特异性结合蛋白的合成和表达仍存在问题，一部分是与鉴定能够与两条不同的重链结合并表达的适宜轻链相关的问题，一部分是分离问题。本申请所述的方法和组合物可以使基因修饰小鼠通过自然过程以外的方法选择能够与一个以上重链结合并表达的适宜轻链，所述重链包括体细胞突变的重链(例如亲和成熟)。来自本申请所述人源化小鼠适宜B细胞的人\和Vh序列能够在具有适宜人恒定区基因序列(例如人IgGl)的表达载体的框架中鉴定和克隆，其中所述小鼠表达具有反向嵌合重链(即人可变区和小鼠恒定区)的亲和成熟的抗体。可以制备两种这种构建体，其中各构建体均编码与不同表位结合的人重链可变结构域。在种系序列中或来自序列已经体细胞突变的B细胞的一种人VLS(例如人Vk 1-39JK5或人Vk3-20Jk I)可以与适宜人恒定区基因(例如人κ恒定基因)在框架内融合。可以将这三种全人重链和轻链构建体置于适宜细胞中表达。所述细胞将表达两大类:具有相同轻链的同源二聚体重链和具有相同轻链的异源二聚体重链。为了便于将这些大类分离，对一条重链进行修饰以使其省去蛋白A结合决定簇，这使得同源二聚体结合蛋白与异源二聚体结合蛋白的亲和性出现差异。解决这一问题的组合物和方法参见 USSN12/832，838，2010年 6 月 25 日提交，名称为 “Readily Isolated BispecificAntibodies with Native ImmunoglobulinFormat”,公开为 US2010/0331527A1,其通过引用并入本申请。
[0225]在一个方面，提供了本申请所述的表位结合蛋白，其中人VL和VH序列衍生自本申请所述的小鼠，所述小鼠已被包含所关注表位的抗原免疫。
[0226]在一个实施方式中，提供了表位结合蛋白，所述蛋白包含第一和第二多肽，所述第一多肽由N端至C端包含选择性与第一表位结合的第一表位结合区，后接包含选自IgGl、IgG2、IgG4及其组合的人IgG的第一 G3区的恒定区；和第二多肽，所述第二多肽由N端至C端包含选择性与第二表位结合的第二表位结合区，后接包含选自IgGl、IgG2、IgG4及其组合的人IgG的第二 Ch3区的恒定区，其中所述第二 Ch3区包含降低或消除第二 Ch3结构域与蛋白A结合的修饰。
[0227]在一个实施方式中，所述第二 CH3区包含H95R修饰(外显子编号为MGT ;EU编号为H435R)。在另一个实施方式中，所述第二 CH3区进一步包含Y96F修饰(MGT ;EU为Y436F)。
[0228]在一个实施方式中，所述第二 CH3区来自经修饰的人IgGl，并且进一步包括选自由 D16E、L18M、N44S、K52N、V57M 和 V82I(IMGT ；EU 为 D356E、L358M、N384S、K392N、V397M 和V422I)组成的组的修饰。
[0229]在一个实施 方式中，所述第二 CH3区来自经修饰的人IgG2，并且进一步包括选自由N44S、K52N 和 V82I (IMGT ；EU 为 N384S、K392N 和 V422I)组成的组的修饰。
[0230]在一个实施方式中，所述Ch3区来自经修饰的人IgG4，并且进一步包括选自由Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q 和 V82I(IMGT ；EU 为 Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)组成的组的修饰。
[0231]一种制备与一种以上表位结合的表位结合蛋白的方法是使用包含所关注的第一表位的抗原免疫根据本发明的第一小鼠，其中所述小鼠包含内源性免疫球蛋白轻链可变区基因座，所述轻链可变区基因座不含能够重排并形成轻链的内源性小鼠其中在内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因座的是可操作地与小鼠内源性轻链恒定区基因连接的单一重排的人\区，并且所述重排的人\区选自人V κ 1-39J κ 5和V κ 3-20J κ 1，并且所述内源性小鼠Vh基因片段已全部或部分被人Vh基因片段取代，以使得由小鼠制备的免疫球蛋白重链完全或基本上是仅包含人可变结构域和小鼠恒定结构域的重链。当免疫后，这种小鼠将制备反向嵌合抗体，所述抗体仅包含两种人轻链可变结构域中的一种(例如人Vk 1-39JK 5或人Vk 3-20JK I中的一种)。一旦编码与所关注表位结合的Vh(并且，可选择的')的B细胞被鉴定，则可以将Vh的核苷酸序列提取(例如通过PRC)并克隆至框架中具有适宜人免疫球蛋白恒定结构域的表达构建体。可以重复这一过程以鉴定与第二表位结合的第二 Vh结构域，并且可以提取第二 Vh基因序列并将其克隆至框架中具有第二适宜免疫球蛋白恒定结构域的表达载体。所述第一和第二免疫球蛋白恒定结构域可以是相同或不同的同种型，可以如本申请或US2010/0331527A1所述对免疫球蛋白恒定结构域之一(但不是其他的)进行修饰，并且可以在适宜的细胞中表达表位结合蛋白并基于与同源二聚体表位结合蛋白相比其对蛋白A具有不同的亲和性而进行分离，例如如US2010/0331527A1所述。
[0232]在一个实施方式中，提供了一种制备双特异性表位结合蛋白的方法，所述方法包括从本申请所述的小鼠中鉴定第一亲和成熟的(例如包含一个或多个体细胞超突变)Avh核苷酸序列(νΗι)，从本申请所述的小鼠中鉴定第二亲和成熟的(例如包含一个或多个体细胞超突变)人Vh核苷酸序列(Vh2)，如US2010/0331527A1所述，将VhI和缺乏蛋白A决定簇修饰的人重链在框架中克隆以形成重链I (HCl)，如US2010/0331527A1所述，将VH2与含有蛋白A决定簇的人重链在框架中克隆以形成重链2 (HC2)，将含有HCl的表达载体和含有HC2的相同或不同的表达载体引入细胞，其中所述细胞还表达包含与人轻链恒定结构域融合的人V κ 1-39/人Jk 5或人Vk 3-20/人Jk I的人免疫球蛋白轻链，以使得细胞表达包含由VhI编码的Vh结构域和由Vh2编码的Vh结构域的双特异性表位结合蛋白，并且基于与单特异性同源二聚体表位结合蛋白相比其对蛋白A的亲和性不同而分离双特异性表位结合蛋白。在一个特定实施方式中，HCl是IgGlJP HC2是包含经修饰的H95R(MGT ；EU为H435R)并且进一步包含经修饰的Y96F(MGT ;EU为Y436F)的IgGl。在一个实施方式中，由VhI编码的所述VH结构域、由Vh2编码的Vh结构域或者这两者为体细胞突变的。
[0233]与共同人'一起表达的Avh基因
[0234]将由四种不同抗原激发的亲和性成熟的抗体的多种人可变区与其同源轻链或者至少一个选自人Vk 1-39JK 5、人Vk 3-20JK I或人VpreBJ λ 5的人轻链一起表达(参见实施例10)。对于针对各抗原的抗体而言，来自不同基因家族的体细胞突变的高亲和重链成功与重排的人种系Vk 1-39JK 5和Vk 3-20JK I区配对并且由表达重链和轻链的细胞分泌。对于V κ 1-39JK 5和Vk 3-20JK I而言，衍生自下述人Vh基因家族的Vh结构域优先表达:1-2、1-8、1-24、2-5、3-7、3-9、3-11、3-13、3-15、3-20、3-23、3-30、3-33、3-48、4-31、
4-39、4-59、5-51和6-1。因此，被工程化修饰以表达来自Vk 1-39Jk 5和V κ 3-20J κ I之一或二者的有限人\结构域库的小鼠将产生来自被修饰以使用人Vh基因片段取代小鼠Vh基因片段的Vh基因座的多样性体细胞突变的人Vh结构域群。
[0235]基因工程化修饰小鼠以表达与单一重排轻链(例如Vk 1-39/J或V κ 3-20/J)结合的反向嵌合(人可变区，小鼠恒定区)免疫球蛋白重链，当使用所关注的抗原免疫时，所述小鼠产生的B细胞包含多样性的人Vh重排并且表达具有多样性的高亲和抗原特异性抗体，所述抗体具有多种与阻断抗原与其配体结合的能力和能够与抗体的变体结合的能力相关的性质(参见实施例14至15)。
[0236]因此，本申请中描述的小鼠和方法对制备和选择包括体细胞突变的人重链可变结构域的人免疫球蛋白重链可变结构域是有用的，该结果是由多样性重排产生的，其显示出多种多样的亲和性(包括显示出约为纳摩或以下的KD)，多种多样的特异性(包括与相同抗原的不同表位结合)，并且其与相同或基本相同的人免疫球蛋白轻链可变区结合并表达。 [0237]在一个方面，将包含人源化的重链可变区基因座的第一小鼠与包含编码如本申请所述的共同或通用轻链基因座的核酸序列的第二小鼠交配。在一个实施方式中，所述第一或第二小鼠包含编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同系物或功能性片段的异位核酸序列。繁殖后代以获得对人源化的重链基因座纯合并对通用轻链基因座纯合的小鼠。在一个实施方式中，所述第一或第二小鼠包含对内源性小鼠轻链基因座的修饰以使得内源性小鼠轻链不具有功能(例如缺失或敲除例如λ和/或K内源性基因座)。在一个实施方式中，所述第一小鼠包含全部或基本上全部功能性内源性小鼠V、D和J基因片段被一个或多个未经重排的人V、D和J基因片段(例如全部或基本上全部功能性人V、D和J基因片段)取代；并且所述小鼠包含全部或基本上全部功能性轻链V和J基因片段被不超过一个或不超过两个重排的轻链V/J序列取代。在一个实施方式中，所述第一小鼠进一步包含编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同系物或功能性片段的异位核酸序列。在一个实施方式中，所述异位核酸序列在人源化的免疫球蛋白重链基因座。
[0238]在一个实施方式中，使用所关注的抗原对包含异位序列并且针对通用轻链基因座和人源化的重链基因座纯合的小鼠进行免疫以产生包含多种体细胞突变的人可变结构域的抗体，所述人可变结构域与通用轻链结合并表达。在一个实施方式中，将在小鼠中鉴定得到的人重链可变结构域核酸序列引入表达系统以制备包含人重链可变结构域和含有小鼠通用轻链序列的轻链的全人抗体。
[0239]提供下述实施例以便向本领域普通技术人员描述如何制备和使用本发明的方法和组合物，而并非旨在限制发明人所认为的其发明的范围。已尽力确保所使用的数字(例如量，温度等)的准确性，但是应对一些实验误差和偏差予以考虑。除非另有明示，否则份数是重量份数，分子量是平均分子量，温度以摄氏度表示和压力处于或接近大气压。
实施例
[0240]实施例1[0241 ] 小鼠免疫球蛋白基因的人源化
[0242]使用人和小鼠细菌人工染色体(BAC)对13种不同的BAC目标载体(BACvec)进行工程改造，以对小鼠免疫球蛋白重链和κ轻链基因座进行人源化。表1和表2分别给出了构建用于小鼠免疫球蛋白重链和κ轻链基因座的人源化的所有BACvec所执行的步骤的详细描述。
[0243]人和小鼠BAC的鉴别
[0244]通过具有BAC文库的滤器的杂交或通过PCR筛选小鼠BAC文库DNA池，鉴别了跨越免疫球蛋白重链和κ轻链基因座的5’和3’端的小鼠BAC。使用与目的区域相对应的探针，在标准条件下杂交滤器。通过PCR并使用侧接被靶向的目的区域的独特引物对筛选文库池。使用相同引物执行另外的PCR以对给定孔进行去卷积(deconvolute)，并分离对应的目的BAC。BAC滤器和文库池两者都是从129SvJ小鼠ES细胞(Incyte Genomics/Invitrogen)产生的。通过具有BAC文库(Caltech B、C或D文库和RPC1-11文库,Research Genetics/Invitrogen)的滤器的杂交,通过采用基于PCR的方法筛选人BAC文库池(Caltech文库，Invitrogen),或通过使用BAC末端序列数据库(Caltech D文库,TIGR),鉴别了覆盖全部免疫球蛋白重链和κ轻链基因座的人BAC。
[0245]通过细菌同源重组和连接来构建BACvec
[0246]如所描述(Valenzuelaetal., 2003 ；Zhang Y.et al., (1998), A new logic forDNA engineering using recombination in Escherichia coli, Nat Genet20: 123-128)的那样进行细菌同源重组(BHR)。在大多数情况下，通过将衍生自PCR的同源盒与被克隆的表达盒连接，随后对连接产物进行凝胶分离并将其电穿孔入携带目标BAC的BHR感受态细菌中，从而产生线性片段。在适当的抗生素皮氏培养皿上进行选择之后，通过跨越两个新接合点之间的PCR,随后在脉冲场凝胶上进行限制酶分析(Schwartz D.C.和Cantor C.R.,(1984), Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gelelectrophoresis, Cell37:67-75),并通过使用分布在人序列之间的引物的PCR抽查,从而鉴别正确重组的BAC。
[0247]使用3个连续BHR步骤构建了 3hVH BACvec，用于免疫球蛋白重链基因座的人源化的初始步骤(图4A和表1)。在第一步(步骤I)中，将一个表达盒引入人亲本BAC中的人VH1_3基因区段上游，所述表达盒含有小鼠免疫球蛋白重链基因座的同源区域(HBl)、在细菌中赋予卡那霉素抗性并且在动物细胞中赋予G418抗性的基因(kanR)以及位点特异性重组位点(例如ΙοχΡ)。在第二步(步骤2)中，将第二个表达盒引入到紧邻最后一个Jh区段的下游，所述第二个表达盒含有小鼠免疫球蛋白重链基因座的第二同源区域(HB2)和在细菌中赋予大观霉素抗性的基因(specR)。所述第二步包括使JH6下游的人免疫球蛋白重链基因座序列和BAC载体氯霉素抗性基因(cmR)缺失。在第三步(步骤3)中，被双重修饰的人BAC(Bl)然后使用已经在前两个步骤中添加的1-CeuI位点进行线性化，并且通过经由所述两个同源区域(HBl和HB2)的BHR整合入小鼠BAC(B2)中。第一(cm/kan)、第二(spec/kan)和第三(cm/kan)步中的药物选择被设计成对期望产物具有特异性。在用限制酶消化之后，通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析被修饰的BAC克隆，以确定适当构建(图4B)。
[0248] 以类似方式，对12种另外的BACvec进行工程改造，用于重链和κ轻链基因座的人源化。在一些情况下，通过BHR以及对选择性标记物的仔细放置，将稀有的限制位点引入两个亲本BACvec中，藉此进行BAC连接以代替BHR，从而联合两个较大的BAC。这允许期望连接产物在用特异性药物标记物组合进行选择时可以存活。在用稀有限制酶消化之后通过连接所获得的重组BAC以 与通过BHR所获得的方式(如上所述)类似的方式进行鉴别和筛选。
[0249]表1
[0250]
【权利要求】
1.一种小鼠，在其种系中包括: (a)人源化的免疫球蛋白重链可变基因座，包括至少一个未重排的人V、至少一个未重排的人D和至少一个未重排的人J片段，所述重链可变基因座可操作地与重链恒定区基因连接； (b)人源化的免疫球蛋白轻链可变基因座，包括不超过一个，或不超过两个重排的人轻链V/J序列，所述轻链可变基因座可操作地与轻链恒定区基因连接；和 (c)编码小鼠ADAM6蛋白或其直系同源物或同系物或功能性片段的异位核酸序列。
2.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述编码小鼠ADAM6蛋白或其直系同源物或同系物或功能性片段的核酸序列位于免疫球蛋白重链可变基因座以外的基因座。
3.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述重链恒定区基因是小鼠基因。
4.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述轻链恒定区基因是小鼠基因。
5.一种小鼠，所述小鼠包括人源化的重链免疫球蛋白可变基因座和人源化的轻链免疫球蛋白可变基因座，其中所述小鼠表达单一轻链，并且其中所述小鼠包含编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6基因的异位核酸序列。
6.根据权利要求5所述的小鼠，其中所述人源化的重链免疫球蛋白基因座可操作地与内源性的小鼠重链恒定 区基因连接。
7.根据权利要求5所述的小鼠，其中所述单一轻链由免疫球蛋白轻链可变基因的基因座编码，所述基因座编码不超过一个轻链V基因片段和轻链J基因片段，其可操作地与轻链恒定基因连接。
8.根据权利要求5所述的小鼠，其中所述单一轻链衍生自小鼠种系中的免疫球蛋白轻链可变基因的基因座，所述基因座编码种系中的不超过一个重排的轻链V/J基因片段，其可操作地与轻链恒定基因连接。
9.根据权利要求5所述的小鼠，其中所述异位核酸序列编码在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6蛋白或其片段。
10.根据权利要求5所述的小鼠，其中所述异位核酸序列的位置不在内源性免疫球蛋白重链基因座内。
11.一种遗传修饰的小鼠，所述小鼠表达多个不同的IgG重链，所述IgG重链均包含人可变结构域，其中所述多个不同的IgG重链均与衍生自单一人免疫球蛋白V基因片段的编码人免疫球蛋白轻链可变结构域的轻链序列结合，其中所述小鼠包含编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白的异位核酸序列。
12.根据权利要求11所述的小鼠，其中所述小鼠表达在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或其片段，并且其中所述ADAM6蛋白或其片段表达自异位核酸序列。
13.一种小鼠细胞，包括: 人源性化的重链免疫球蛋白可变基因的基因座，所述重链免疫球蛋白可变基因的基因座可操作地与重链恒定基因连接； 人源化的轻链免疫球蛋白基因座，包括不超过一个，或不超过两个轻链V基因片段，所述轻链免疫球蛋白基因座可操作地与轻链恒定基因连接；和， 编码ADAM6蛋白或其片段的异位核酸序列，其中所述ADAM6蛋白或其片段在雄性小鼠中具有功能。
14.根据权利要求13所述的小鼠细胞，其中所述异位核酸序列编码小鼠的ADAM6蛋白。
15.根据权利要求13所述的小鼠，其中所述重链恒定基因是非人重链恒定基因。
16.根据权利要求13所述的小鼠，其中所述轻链恒定基因是非人轻链恒定基因。
17.根据权利要求13所述的小鼠，其中在重排的V/J基因片段中存在不超过一个，或者不超过两个轻链V基因片段。
18.一种小鼠B细胞，所述细胞表达嵌合的免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链包含衍生自人重链V基因片段的免疫球蛋白重链可变结构域；以及轻链，所述轻链衍生自 (a)重排的人VK 1-39/J序列， (b)重排的人VK 3-20/J序列，或 (c)其组合； 其中所述重链可变结构域与恒定区融合，并且所述轻链可变结构域与恒定区融合，并且其中所述B细胞包含异位ADAM6核酸序列。
19.根据权利要求18所述的小鼠B细胞，其中所述与重链可变结构域融合的恒定结构域包含小鼠恒定区。
20.根据权利要求18所述的小鼠B细胞，其中所述与轻链可变结构域融合的恒定区选自小鼠恒定区和人恒定区的。
【文档编号】C12N15/85GK103917650SQ201280049374
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年8月3日 优先权日:2011年8月5日
【发明者】J·麦克沃克, L·麦克唐纳德, S·史蒂文斯, S·戴维斯, D·R·巴克勒, K·A·霍西阿瓦, A·J·莫菲 申请人:瑞泽恩制药公司