利用人源化的小鼠来确定毒性的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种确定药剂是否会在人类中引起免疫毒性的方法。该方法包括向已被移植人造血干细胞(HSC)和施用一种或多种人细胞因子的非人类哺乳动物施用该药剂；以及确定药剂是否在非人类哺乳动物中引起免疫毒性，其中如果所述药剂在非人类哺乳动物中引起免疫毒性，则所述药剂在人类中引起毒性。在另一个方面，本发明涉及一种确定药剂施用是否在需要的个体中引起细胞因子释放综合征的方法。该方法包括向已移植HSC和施用一种或多种人细胞因子的非人类哺乳动物施用该药剂；和确定所述药剂是否在非人类哺乳动物中引起细胞因子释放综合征，其中如果所述药剂在非人类哺乳动物中引起细胞因子释放综合征，则该药剂在人类中引起细胞因子释放综合征。
【专利说明】利用人源化的小鼠来确定毒性
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2011年12月6日提交的61/567, 466号美国临时申请的优先权。
[0003] 上述申请的全文通过引用在此引入。
[0004] 发明背景
[0005] 由于接近于人体的模型往往无法准确地预测许多不利的影响，临床前和临床试验 之间存在明显的差距。在I期临床试验中，施用TGN1412(开发用于治疗自身免疫性疾病的 人源化超激动（superagonistic)CD28单克隆抗体（IgG4))导致了与"细胞因子风暴"症状 相关的灾难性事件。急需建立一个可以准确地预测这种不利影响的模型。具有增强的人免 疫细胞移植特性的免疫缺陷NOD-scid IL2rY null小鼠给出了一种有吸引力的模型。然而， 由于在当前的模型中观察到弱的人类免疫反应，它们的广泛使用受到限制。
[0006] 因此，需要可以准确地预测药剂（例如，治疗剂）对人体免疫系统的不利影响的改 进的模型。
[0007] 发明概沭
[0008] 通过向小鼠注射人造血干细胞和人细胞因子（例如，人IL-I5和Flt-3L细胞因 子）改进人源化小鼠模型的免疫反应。本发明证明，细胞因子处理的人源化（CTH)小鼠模型 得以以高保真度预测了在临床中或临床前试验中使用的四种不同单克隆抗体的不利影响。
[0009] 因此，在一个方面中，本发明涉及一种确定（一种或多种）药剂是否会在人类中引 起免疫毒性的方法。该方法包括向已移植人造血干细胞（HSC)和施用一种或多种人类细 胞因子的非人类哺乳动物施用该药剂；以及确定药剂是否会在非人类哺乳动物中引起免疫 毒性，其中，如果所述药剂在非人类哺乳动物中引起免疫毒性，则所述药剂在人类中引起毒 性。
[0010] 在另一个方面，本发明涉及一种确定施用（一种或多种）药剂是否会在需要的个 体（例如，人）中引起细胞因子释放综合征的方法。该方法包括向已移植人造血干细胞 (HSC)和施用一种或多种人类细胞因子的非人类哺乳动物施用该药剂；以及确定所述药剂 是否会在该非人类哺乳动物中引起细胞因子释放综合征，其中，如果所述药剂在该非人类 哺乳动物中引起细胞因子释放综合征，则该药剂在人类中引起细胞因子释放综合征。
[0011] 附图简要说明
[0012] 本专利或申请文件包含至少一张以彩色绘制的附图。带有彩色附图的本专利或专 利申请的副本将经请求和支付必要费用后由专利局提供。
[0013] 图1 :注射TGN 1412引起一大组全身性促炎性细胞因子产生。在TGN 1412-IgG4(小鼠抗-人⑶28抗体5· 11A1的人源化形式（同种型：人IgG4/Kappa)，在本文 也被称为TGN1412)和TGN1412-AA (小鼠抗-人⑶28抗体5. 11A1的人源化FcR-非结合形 式（同种型：人IgG4/Kappa))处理组的血清中在处理前48小时、注射后2小时和24小时 测量细胞因子产生。也将值与盐水注射的对照组进行了比较。通过BD FACSArray分析来 测定人白介素-2〇111^-2)、1111^-6、1111^-8、1111^-10、1111^-4、11正^￥和於呖-〇的量。各个 符号代表一只小鼠。相同的符号表不在不同时间点的相同的小鼠。η值表不在每一组中使 用的小鼠的数目，来自两个独立的实验。
[0014] 图2A-2B :在TGN1412处理后注意到T细胞和NK细胞百分比和绝对数的变化。在指 示时间点对小鼠采血和分析PBMC的人CD45 (hCD45)。（2A)显示了按照流式细胞分析，门控 于人⑶45细胞上的⑶3+、⑶14+、⑶19+、⑶56+的百分比和门控于来自小鼠 PBMC的⑶45+⑶3+ 细胞上的CD4+和CD8+的百分比的比较。（2B)根据使用血细胞计数仪计算的活细胞数和从 流式细胞分析获得的相应细胞群的百分比之间的相关性计算不同细胞谱系的绝对数。
[0015] 图3 :向没有用IL-15和FLT3L细胞因子处理的人源化小鼠注射TGN1412-lgG4未 伴随细胞因子产生的增加。在处理前48小时、注射后2和24小时测量TGN1412-IgG4处理 组的血清中的细胞因子产生。也将值与盐水注射的对照组进行比较。通过BD FACSArray 分析测定 1111^-2、1111^-6、1111^-8、1111^-113、11几 -4、11正^￥和1^呖-〇的量。各个符号代表一 只小鼠。相同的符号表示在不同时间点的相同的小鼠。η值表示在每组中使用的小鼠的数 目，来自单一的实验。
[0016] 图4Α-4Β :在未用IL-15和FLT3L细胞因子处理的人源化小鼠的TGN1412处理后 注意到Τ、Β和ΝΚ细胞百分比和绝对数的变化。在指示时间点对小鼠采血和分析PBMC的人 ⑶45(h⑶45)。（4Α)显示了按照流式细胞分析，门控于人⑶45细胞上的⑶3+、⑶14+、⑶19+、 ⑶56+的百分比和门控于来自小鼠的PBMC的⑶45+⑶3+细胞上的⑶4+和⑶8+的百分比的比 较。（4B)根据使用血细胞计数仪计算的活细胞数和从流式细胞分析获得的相应细胞群的百 分比之间的相关性计算不同细胞谱系的绝对数。
[0017] 图5 :注射0KT3引起一大组全身的促炎性细胞因子产生。在处理前48小时、注射 后2小时和24小时，在0KT3治疗组的血清中测量细胞因子的产生。也将值与盐水注射的 对照组进行比较。通过 BDFACSArray 测定 hIL-2、hIL-6、hIL-8、hIL-Ι β、hIL-4、hlFN- γ 和hTNF-α的量。各个符号代表一只小鼠。相同的符号表不在不同时间点的相同的小鼠。 η值表示在每一组中使用的小鼠的数目，来自三个独立的实验。
[0018] 图6Α-6Β :在0ΚΤ3处理后注意到几个细胞百分比和绝对数的变化。在指示时间点 对小鼠采血和按在图1中提到的分析PBMC的人CD45(hCD45)。（6Α)显示了按照流式细胞 仪分析，门控于来自小鼠 PBMC的人⑶45细胞上的⑶3+、⑶14+、⑶19+、⑶56+的百分数的比 较。（6B)示出不同细胞谱系的绝对数。
[0019] 图7 :阿仑单抗注射表现出促炎性细胞因子的略微增加。在在处理前48小时、注 射后2小时和24小时测量阿仑单抗治疗组的血清中的细胞因子的产生。也将值与盐水注 射的对照组进行比较。η值表示在每一组中使用的小鼠的数目，来自两个独立的实验。
[0020] 图8Α-8Β :阿仑单抗的注射与淋巴细胞、ΝΚ细胞和单核细胞的急剧减少相关联。在 指示时间点对小鼠采血和按在图1中提到的分析PBMC的人CD45(hCD45)。（8Α)显示了按 照流式细胞分析，门控于来自小鼠 PBMC的人⑶45+细胞上的⑶3+、⑶14+、⑶19+和⑶56+的 百分数的比较。（8B)示出不同细胞谱系的绝对数。
[0021] 图9 :注射利妥昔单抗对全身性促炎性细胞因子产生没有显示出任何明显的影 响。在处理前48小时、注射后2小时和24小时，测量利妥昔单抗处理组的血清中的细胞因 子产生。也将值与盐水注射的对照组进行比较。测量的不同细胞因子的量保持不变。η值 表示在每组中使用的小鼠的数目，来自两个独立的实验。
[0022] 图10Α-10Β :在所有所分析的不同细胞谱系中，只有Β细胞表现出百分比和总数的 变化。在指示时间点对小鼠采血和按在图1中提到的分析PBMC的人CD45(hCD45)。（10A) 显示了按照流式细胞分析，门控于来自小鼠 PBMC的人⑶45+细胞上的⑶3+、⑶14+、⑶19+和 CD56+的百分数的比较。（10B)示出不同细胞谱系的绝对数。
[0023] 图11A-11D :在细胞因子处理的小鼠（11A、11B)和未处理的小鼠（图11C、11D)中 施用TGN1412-IgG4、TGN1412-AA、0KT3、阿仑单抗和利妥昔单抗后肝酶的检测。（11A，11B) TGN1412-IgG4的施用与处理后24小时天冬氨酸和丙氨酸氨基转移酶（AST和ALT)水平的 升高相关。TGN1412-AA注射只与ALT的升高有关。施用0KT3、阿仑单抗和利妥昔单抗没有 引起任何测试的肝酶的显著增加。（11C，11D)施用TGN1412-IgG4没有引起任何被测试的肝 酶的增强。
[0024] 图12A-12B :将从2个对照人源化小鼠的脾脏中分离的细胞用人抗体染色并用流 式细胞术分析。示意图显示在（12A)⑶45+CD3+⑶4+和⑶45+⑶3+⑶4+人细胞上和（12B)天然 的、效应和记忆⑶4+细胞上的⑶28的表达。
[0025] 图13 :将从对照、TGN1214-IgG4和TGN1214-AA的脾脏中分离的总细胞计数和用不 同的人抗体染色。
[0026] 图14 :对从对照、TGN1214_IgG4的脾脏中分离的总细胞计数和用不同的人抗体染 色。
[0027] 图15 :向用人IL-15和FLT3L人细胞因子质粒处理的小鼠施用TGN1412和0KT3弓| 起一大组全身性促炎性细胞因子的产生，虽然阿仑单抗注射表现出hIL-6和hIL-8细胞因 子的略微增加。利妥昔单抗注射对促炎性细胞因子的产生没有显示出任何明显的影响。在 处理前48小时、注射后2小时和24小时，测量16附412-1 864、16附412-44、0〇3、阿仑单抗 和利妥昔单抗处理组的血清中的细胞因子产生。也将值与盐水注射的对照组进行了比较。 通过 BDFACSArray 分析来测定 hIL-2、hIFN- γ、hIL-6、hIL-8、hTNF- a、hIL-l β 和 hIL-4 的 量。每个符号代表一只小鼠。η值表示在每组中使用的小鼠的数目，来自至少三个独立的实 验。通过Kruskal-Wallis检验（非参数AN0VA)进行统计分析：*Ρ < 0. 05 ;**Ρ < 0. 005 ; 彡 0. 0001。
[0028] 图16Α-16Η:在注射了 IL-15和FLT3L人类细胞因子质粒的小鼠进行TGN1412、 0KT3、阿仑单抗和利妥昔单抗处理后注意到T、NK和B细胞的细胞百分比和绝对数的变化。 在指示时间点对小鼠采血和分析PBMC的人⑶45 (h⑶45)和小鼠⑶45 (mCD45)。（16A，16B 和16C)根据使用血细胞计数仪计算的活细胞数和从流式细胞分析获得的相应细胞群的百 分比之间的相关性计算不同细胞谱系的绝对数。（16D)显示了按照流式细胞分析，门控于人 ⑶45上的⑶3+、⑶14+、⑶19+、⑶56+的百分比的比较，（16E和16F)门控于活细胞上的h⑶45 和mCD45的百分比的比较和（16G)门控于来自小鼠 PBMC的⑶45+⑶3+细胞上的⑶4+和 ⑶8+的百分比的比较。（16H)人⑶45+细胞重构的水平的比较。通过Kruskal-Wallis检 验（非参数AN0VA)进行统计分析：*P彡0· 05 ;#P彡0· 005 彡0· 0001。
[0029] 图17:向未用IL-15和FLT3L人类细胞因子质粒处理的人源化小鼠注射 TGN1412-IgG4未伴随全身性细胞因子释放。在处理前48小时、注射后2和24小时，在 TGN1412-IgG4处理组的血清中测量细胞因子的产生。也将值与盐水注射的对照组进行比 较。通过8〇?4〇541*四7分析测定1111^-2、11正^^、11比-6、11比-8、1^呖-〇、}1比-10和1111^-4 的量。每个符号代表一只小鼠。相同的符号表不在不同时间点的相同的小鼠。η值表不在 每一组中使用的小鼠的数目，来自单一的实验。
[0030] 图18A-18H :在未用IL-15和FLT3L细胞因子处理的人源化小鼠的TGN1412处理 后注意到T、B和NK细胞的百分比和绝对数的变化。在指示时间点对小鼠采血和分析PBMC 的人CD45(hCD45)。（18A，18B和18C)如前所述计算不同细胞谱系的绝对数。（18D)显示了 按照流式细胞分析，门控于人⑶45上的⑶3+、⑶14+、⑶19+、⑶56+的百分比的比较，（18E和 18F)门控于活细胞上的hCD45和mCD45的百分比的比较和（18G)门控于来自小鼠 PBMC的 ⑶45+⑶3+细胞上的⑶4+和⑶8+的百分比的比较。（18H)人⑶45+细胞重构的水平的比 较。通过Kruskal-Wallis检验（非参数AN0VA)进行统计分析：*P彡0. 05 ;**P彡0. 005。
[0031] 图19 :向用M-CSF细胞因子处理的小鼠注射TGN1412和0KT3增加了全身性IL-6 和IL-8的产生。在处理前48小时、注射后2和24小时，在TGN1412-IgG4和0ΚΤ 3处理组 的血清中测量细胞因子的产生。也将值与盐水注射的对照组进行比较。如前面所述地测定 人细胞因子的量。每个符号代表一只小鼠。η值表示在每一组中使用的小鼠的数目，来自至 少三个独立的实验。通过Kruskal-Wallis检验（非参数AN0VA)和配对t检验进行统计分 析：*P < 0· 05 ;**P < 0· 005 ;***P < 0· 0001。
[0032] 图20A-20H :注射了 M-CSF人细胞因子质粒的小鼠用TGN1412-IgG和0KT3T处理 后注意到T、NK和B细胞的细胞百分比和绝对数的变化。在指示时间点对小鼠采血和分析 PBMC的人⑶45 (h⑶45)和小鼠⑶45 (mCD45)。（20A，20B和20C)按前面所述计算不同细胞 谱系的绝对数。（20D)显示了按照流式细胞仪分析，门控于人⑶45上的⑶3+、⑶14+、⑶19+、 ⑶56+的百分比的比较，（20E和20F)门控于活细胞上的h⑶45和mCD45的百分比的比较和 (20G)门控于来自小鼠 PBMC上的⑶45+⑶3+的⑶4+和⑶8+细胞的百分比的比较。（20H) 人⑶45+细胞重构的水平的比较。通过Kruskal-Wallis检验（非参数AN0VA)进行统计分 析：*P < 0· 05 ;**P < 0· 005。
[0033] 图21 :向用IL-15和FLT3L或M-CSF人细胞因子质粒处理的小鼠注射TGN1412和 0KT3引起小鼠 mIL-6而非mIL-2或mIFN-γ的轻微增加。在用于人细胞因子的同一时间 点测量血清中的细胞因子产生。通过BD FACSArray分析测定mIL-2、mIFN-Y和mIL-6的 量。每个符号代表一只小鼠。η值表示在每一组中使用的小鼠的数目，来自至少两个独立的 实验。通过Kruskal-Wallis检验（非参数AN0VA)进行统计分析：*Ρ彡0. 05。
[0034] 图22A-22D :向用细胞因子处理的小鼠（22Α，22Β)和未处理的小鼠（22C，22D) 施用TGN1412-IgG4、TGN1412-AA、0KT3、阿仑单抗和利妥昔单抗后检测肝酶。（22A，22B) TGN1412-IgG4的施用与处理后24小时天门冬氨酸和丙氨酸氨基转移酶（AST和ALT)水平 的升高相关。注射TGN1412-AA只与ALT的升高有关。施用0KT3、阿仑单抗和利妥昔单抗 没有引起任何被测试的肝酶的显著增加。（22C，22D)施用TGN1412-IgG4没有引起任何测 试的肝酶的增强。通过Kruskal-Wallis检验（非参数AN0VA)进行统计分析：*P < 0. 05 ; **P < 0. 005。
[0035] 图23A-23B :从2个对照的人源化小鼠的脾脏中分离的细用人抗体染色，并用流式 细胞术分析。示意图显示在（23A)⑶45+⑶3+⑶8+和⑶45+⑶3+⑶4+人类细胞和（23B)天 然的、效应和记忆⑶4+细胞上的⑶28的表达。
[0036] 图24 :对从对照、TGN1214-IgG4和TGN1214-AA的脾脏中分离的总细胞计数和用不 同人抗体染色。
[0037] 图25 :对从对照、TGN1214_IgG4的脾脏中分离的总细胞计数和用不同人抗体染 色。
[0038] 发明详沭
[0039] 如本文所述，产生经细胞因子处理的人源化（CTH)小鼠并评价其预测药剂（例如， 治疗剂）在例如临床中观察的免疫毒性的能力。经细胞因子处理的人源化小鼠注射不同 的治疗性抗体，TGN1412(抗-⑶28)、0KT3(抗-⑶3)、阿仑单抗（抗⑶S2)和利妥昔单抗 (抗-CD20)，和通过细胞免疫表型分型、细胞因子和肝酶测量分析副作用。四种抗体在人源 化小鼠中的治疗效果和副作用可与临床观察相比。TGN1412和0ΚΤ3处理的小鼠都表现出主 要炎性细胞因子的显著增加，伴随Τ细胞的耗尽、ΝΚ细胞计数的降低和肝酶增加。阿仑单 抗处理的小鼠表现出淋巴细胞、自然杀伤细胞和单核细胞的急剧耗尽，但细胞因子水平仅 略微提高（对IL-8显著）。这些反应在利妥昔单抗处理的小鼠中不存在，其中注意到Β细 胞的耗尽。非细胞因子处理的小鼠的施用没有引起细胞因子反应。这些结果表明，CTH小 鼠可以以高的保真度和精确性预测药剂如治疗剂的免疫毒性。
[0040] 因此，在一个方面中，本发明涉及一种确定（一种或多种）药剂是否会在人类中引 起毒性的方法。该方法包括向已移植人造血干细胞（HSC)和施用一种或多种人细胞因子的 非人类哺乳动物施用该药剂；以及确定药剂是否在非人类哺乳动物中引起毒性，其中，如果 所述药剂在非人类哺乳动物中引起毒性，则所述药剂在人类中引起毒性。
[0041] 在另一个方面，本发明涉及一种确定（一种或多种）药剂是否会在人类中引起免 疫毒性的方法。该方法包括向已移植人造血干细胞（HSC)和施用一种或多种人细胞因子的 非人类哺乳动物施用该药剂；以及确定所述药剂是否在非人类哺乳动物中引起免疫毒性， 其中，如果所述药剂在非人类哺乳动物中引起免疫毒性，则该药剂在人类中引起毒性。
[0042] 如本文所用，如果药剂对个体（例如，人）引起损伤或损害，则药剂是毒性的或引 起毒性的。毒性可以是，例如，急性的或慢性的。在具体的方面，本发明涉及确定由在人源 化的非人类哺乳动物如人源化的小鼠（例如，细胞因子处理的人源化小鼠）中重构的人免 疫细胞引起的毒性的方法。使用如本文所述的人源化小鼠的优点在于，它允许探究或确定 由人免疫系统（于非人类哺乳动物如小鼠中重构的）对药剂如治疗剂的反应引起的体内毒 性。
[0043] 免疫毒性指的是药剂对个体免疫系统功能作用的不良的/非有意的效果。参见， 例如，Weir, A, Journal of Immunotoxicology, 5:3-10(2008) ;Gribble，EJ.等，Expert Opinion Drug Metab Toxicol,3 (2) (2007)。
[0044] 在某些情况下，免疫毒性可以在个体中产生细胞因子风暴。细胞因子风暴、细 胞因子释放综合征或输液反应是通常在第一次接触药剂（例如，治疗性mAb)时看到的 不良事件。它特征在于几种炎性细胞因子的全身性释放。症状的范围从轻微到严重，包 括疲劳、头痛、荨麻疹、瘙痒、支气管痉挛、呼吸困难、舌或咽喉肿痛感、鼻炎、恶心、呕吐、 面色潮红、发热、寒战、低血压、心动过速和虚弱。参见，例如，Wing, M.等，Journal of Immunotoxicology, 5:11-15 (2008)和 Wang, Η·等，American Journal of Emergency Medicine, 26:711-715(2008)。
[0045] 因此，在又另一个方面，本发明涉及一种确定施用（一种或多种）药剂是否会在需 要的个体（例如，人类）中引起细胞因子释放综合征的方法。该方法包括向已移植人造血 干细胞（HSC)和施用一种或多种人细胞因子的非人类哺乳动物施用该药剂；以及确定所述 药剂是否在非人类哺乳动物中引起细胞因子释放综合征，其中，如果所述药剂在非人类哺 乳动物中引起细胞因子释放综合征，则该药剂在人类中引起细胞因子释放综合征。
[0046] 如本文所用，HSC(例如，人HSC)是自我更新的干细胞，其在被移植到受体中时， "重新定殖"或"重构"移植受体（例如，非人类哺乳动物；免疫缺陷的非人类哺乳动物）的 造血系统，和维持（例如，长期）受体中的造血作用。因此，当人HSC移植到非人类哺乳动 物中时，人HSC以人HSC重新定殖非人类哺乳动物的造血系统。
[0047] 造血干细胞是产生（分化成）包括骨髓（例如，单核细胞和巨噬细胞、中性粒细 胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞）和淋巴谱系（例 如，T细胞、B-细胞、NK-细胞）的血细胞类型的多能干细胞。重构的人造血干细胞可以在 非人类哺乳动物中分化成人NK细胞、人单核细胞、人巨噬细胞、人树突细胞、人红细胞、人B 细胞、人T细胞或它们的组合。
[0048] 造血干细胞表达细胞标志物⑶34并通常被称为"⑶34+"。如本领域技术人员 所理解的，造血干细胞也可以表达其他细胞标志物，如⑶133和/或⑶90 ( "⑶133+"， "⑶90+"）。在一些情况下，造血干细胞的特征在于不表达的标志物，例如，⑶38。因此， 在本发明的一个实施方式中，在本文所述的方法中使用的人造血干细胞是CD34+、CD90+、 CD133+、CD34+CD38-、CD34+CD90+、CD34+CD133+CD38-、CD133+CD38-、CD133+CD90+CD38-、 ⑶34+⑶133+⑶90+⑶38-或它们的任意组合。在特定的实施方式中，造血干细胞为 CD34( "CD34+"）和CD133+( "CD133+"），在此也称为"双阳性"或"DP"细胞或者"DPC"。在 另一个实施方式中，造血干细胞是⑶34+⑶133+，并且可以进一步包含⑶38-和/或⑶90+。
[0049] 造血干细胞存在于骨髓中，如在供体（例如，脊椎动物如哺乳动物，包括人类、灵 长类动物、猪、小鼠等）的股骨、髋骨、肋骨、胸骨和其他骨骼中。用于临床和科研用途的造 血干细胞的其他来源包括脐带血、胎盘、胎肝、动员的外周血、非动员（或未动员的）外周 血、胎儿肝、胎脾、胚胎干细胞和主动脉-性腺-中肾（AGM)或它们的组合。
[0050] 如本领域的技术人员可以理解的，动员的外周血指的是富集造血干细胞（例如， CD34+细胞）的外周血。施用如化学治疗剂和/或G-CSF的药剂从骨髓动员干细胞到外周 循环中。例如，施用粒细胞集落刺激因子（G-CSF)至少或约5天动员CD34+细胞到外周血。 在开始施用G-CSF后第5日观察到发生30倍富集的循环⑶34+细胞的峰值。未经外周血 的动员，循环⑶34+细胞的数量非常低，估计在总单核血细胞的0. 01至0. 05%之间。
[0051] 在该方法中使用的人造血干细胞可以从单一供体或多个供体获得。另外，在本文 描述的方法中使用的造血干细胞可以是新分离的造血干细胞、冻存的造血干细胞或它们的 组合。
[0052] 如本领域已知的，可以使用多种本领域已知的方法从这些来源获得造血干细胞。 例如，可以使用针和注射器，通过从骨髓（例如髋骨、股骨中等）移取直接获得造血干细胞， 或用诱导细胞从骨髓腔中释放的细胞因子如粒细胞集落刺激因子（G-CSF)预处理供体后 从血液获得造血干细胞。
[0053] 在本发明的方法中使用的造血干细胞可以如获得的（例如，未扩增的）直接 引入到非人类哺乳动物中，或者在将造血干细胞引入到非人类哺乳动物中之前被操纵 (例如，扩增）。在一个实施方式中，在将造血干细胞引入到非人类哺乳动物中之前扩 增造血干细胞。如本领域技术人员理解的，有多种方法可以用来扩增造血干细胞（参 见，例如，Zhang, Y·，等人，Tissue Engineering, 12(8) :2161-2170(2006) ;Zhang CC， 等，Blood, 111 (7) :3415-3423(2008))。在特定的实施方式中，通过在生长因子（例如， 血管生成素样5(Angplt5)生长因子、IGF结合蛋白2(IGFBP2)、干细胞因子（SCF)、成 纤维细胞生长因子（FGF)、血小板生成素（TP0)或它们的组合）存在下，将造血干细胞 与间充质干细胞（MSC)共培养以产生细胞培养物而扩增造血干细胞群体。细胞培养 物被保持在其中产生扩增的造血干细胞群体的条件下（例如，见Khoury，M, Stem Cell Dev. ,2(8):1371-1381 (2011)和TO 2010/138873号国际申请，其在此引入作为参考）。
[0054] 在本文所述的方法中，药剂被施用于已移植人造血干细胞及施用一种或多种人细 胞因子的非人类哺乳动物。被施用于非人类哺乳动物的一种或多种人细胞因子可以是（一 种或多种）细胞因子蛋白和/或（一种或多种）编码一种或多种人细胞因子的核酸（例如， DNA，RNA)。该人细胞因子被施用于或引入到非人类哺乳动物中以诱导人造血干细胞分化为 功能性人细胞（例如，功能性人血细胞谱系）。如本领域中已知的，细胞因子是刺激或抑制 免疫细胞的分化、增殖或功能的蛋白质。许多人细胞因子蛋白和编码人细胞因子的核酸序 列也是本领域中已知的和可获得的（见，例如，WWW. ncbi. nlm. nih. gov)。用来获得人细胞 因子蛋白和/或编码一种或多种人细胞因子的核酸的方法是本领域中常规的且包括从各 种来源（例如血清）中分离蛋白质或核酸（例如，克隆）、重组地产生蛋白质或核酸或从商 业来源获得蛋白质或核酸。
[0055] 有各种各样的人细胞因子可以在本发明的方法中使用。这样的人细胞因子的实 例包括白介素-12(IL-12)、白介素15(IL-15)、Fms相关的酪氨酸激酶3配体（Flt3L)、 Flt3L/Flk2配体（FL)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)、白介素-4(IL-4)、白介 素-3 (IL-3)、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)、促红细胞生成素（ΕΡ0)、白介素23 (IL-23)、 白介素-3 (IL-3)、白介素9 (IL-9)、干细胞因子、白介素-7 (IL-7)、白17 (IL-17)和它们的组 合。被引入到非人类哺乳动物中的细胞因子的类型和细胞因子的数量将取决于，当在非人 类哺乳动物中发生人造血干细胞的分化时，那些人血细胞谱系被重构。
[0056] 在一些方面，至少（包括）一种细胞因子、至少2种细胞因子、至少3种细胞因子、 至少4种细胞因子、至少5种细胞因子、至少6种细胞因子、至少7种细胞因子、至少8种细 胞因子、至少9种细胞因子、至少10种细胞因子、至少11种细胞因子、至少12种细胞因子、 至少13种细胞因子、至少14种细胞因子、至少15种细胞因子、至少16种细胞因子、至少17 种细胞因子、至少18种细胞因子、至少19种细胞因子或至少20种细胞因子被引入到非人 类哺乳动物中。在其它方面中，仅（由其组成，基本上由其组成）一种细胞因子、2种细胞因 子、3种细胞因子、4种细胞因子、5种细胞因子、6种细胞因子、7种细胞因子、8种细胞因子、 9种细胞因子、10种细胞因子、11种细胞因子、12种细胞因子、13种细胞因子、14种细胞因 子、15种细胞因子、16种细胞因子、17种细胞因子、18种细胞因子、19种细胞因子或20种细 胞因子被引入到非人类哺乳动物中。每种细胞因子蛋白质和/或编码各种人细胞因子的核 酸可以同时或相继被引入（例如，在其中在非人类哺乳动物中将表达超过一种细胞因子的 情况下，编码各种细胞因子的各种核酸可以在其自己的单一质粒或载体中被引入，或者可 以在多个质粒或载体中被引入；或者，将被引入的所有编码细胞因子的核酸可以在单一质 粒或载体中被引入）。
[0057] 在本发明的方法中，人造血干细胞和人细胞因子蛋白和/或编码一种或多种人细 胞因子的核酸被引入到非人类哺乳动物中。如本文所用，术语"哺乳动物"和"哺乳动物的" 是指是指哺乳其幼崽并且生育活的幼体（真兽亚纲（eutharian)或胎盘哺乳动物）或产卵 (后兽亚纲（metatharian)或非胎盘哺乳动物）的任何脊椎动物，其中包括单孔类动物、有 袋类动物和有胎盘哺乳动物。可以在本文描述的方法中使用的哺乳动物物种的实例包括非 人类灵长类动物（例如，猴和黑猩猩）、啮齿动物（例如，大鼠、小鼠、豚鼠）、犬科动物、猫科 动物和反刍动物（如牛，猪，马）。在一个实施方式中，非人类哺乳动物是小鼠。在本文所述 方法中使用的非人类哺乳动物可以是成年的、新生的（例如，〈48小时龄；幼仔）或子宫内 的。
[0058] 在具体的实施方式中，非人类哺乳动物是免疫缺陷的非人类哺乳动物，也就是说， 在其免疫系统中具有一种或多种缺陷的非人类哺乳动物（例如，NSG或NOD scidY (N0D. Cg-Prkdcscid I12rgtmlWjl/SzJ)小鼠），并且其结果，允许在人造血干细胞引入时人血 细胞谱系的重构。例如，非人类哺乳动物缺乏其自身T细胞、B细胞、NK细胞或它们的组 合。在具体的实施方式中，非人类哺乳动物是免疫缺陷小鼠；如携带重症联合免疫缺陷突 变的非肥胖型糖尿病小鼠（NOD/scid小鼠）、携带重症联合免疫缺陷突变并缺乏细胞因 子受体Y链的基因的非肥胖型糖尿病小鼠（NOD/scid IL2RY-/-小鼠）和Balb/c小鼠 rag_/_ γ c_/_ 小鼠。
[0059] 免疫缺陷小鼠的其它具体实例包括，但不限于，重症联合免疫缺陷（scid)小鼠、 非肥胖型糖尿病（NOD)-scid小鼠、IL2rg+小鼠（例如，NOD/LySz-scid IL2rg+小鼠、N0D/ 511；[-8(^(111^2找/小鼠（腸6小鼠）、1^1^/(3-1^8/11^2找 /小鼠、!12<1-1^8/11^2找/小鼠）、 N0D/Rag+IL2rg+ 小鼠。
[0060] 在一些实施方式中，在引入人造血干细胞和人细胞因子（例如，蛋白质和/或编码 一种或多种人细胞因子的核酸，以进一步提高人造血干细胞的重构）之前处理或操作非人 类哺乳动物。例如，非人类哺乳动物可以被操作以进一步增强人造血干细胞的移植和/或 重构。在一个实施方式中，在引入造血干细胞和人细胞因子之前照射非人类哺乳动物。在 另一个实施方式中，在引入造血干细胞和人细胞因子之前向非人类哺乳动物施用一种或多 种化学治疗剂。
[0061] 如本领域技术人员理解的，有多种方式将造血干细胞、人细胞因子蛋白和编码细 胞因子的核酸引入非人类哺乳动物中。这种方法的例子包括，但不限于，皮内、肌内、腹膜 内、眼内、股骨内、心室内、颅内、鞘内、静脉内、心内、肝内、骨髓内、皮下、局部、口服和鼻内 施用途径。其他合适的引入方法还可以包括，子宫内注射、流体动力学基因递送、基因治疗、 可再装填或可生物降解的装置、粒子加速装置（"基因枪"）和缓释的聚合物装置。
[0062] 可以使用任何这样的施用路径等将造血干细胞引入到非人类中。在特定的实施方 式中，将造血干细胞心内注射到非人类哺乳动物中。
[0063] 也可以使用任何这样的施用路径引入一种或多种人细胞因子蛋白和/或编码一 种或多种人细胞因子的核酸。在其中引入核酸的实施方式中，只要核酸在非人类哺乳动物 中表达，可使用任何施用途径。例如，编码一种或多种细胞因子的核酸可以作为裸核酸（裸 DNA)、在质粒（如，pcDNA3. 1(+))中或在病毒载体（例如，腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆 转录病毒等）中被引入。在特定实施方式中，使用高压注射（hydrodynamic injection) (例如，注射至非人类哺乳动物的尾静脉中）将质粒中的编码一种或多种细胞因子的核酸 引入。
[0064] 如本领域的技术人员所理解的，可以使用替代的方法将一种或多种人细胞因子 引入非人类哺乳动物中。例如，可以使用敲入方法。在分子克隆和生物学中，敲入（或 基因嵌入）指的是包括将蛋白质编码cDNA序列插入到生物体染色体的特定基因座的 基因工程方法。通常，这被用在小鼠中，因为用于该过程的技术更精细，而且因为小鼠胚 胎干细胞很容易被操作。人细胞因子敲入小鼠是在其中特定的小鼠细胞因子基因座被 人细胞因子替换的小鼠，这使得该小鼠产生这些特定的人细胞因子而不是小鼠细胞因 子。见。例如，Willinger，T.等，PNAS, 108(6) :2390-2395(2011)和 Rongvaux，A.等， PNAS，108(6) :2378-2383(2011)。
[0065] 此外，可以使用转基因技术将一种或多种人细胞因子引入到非人类哺乳动物中。 转基因小鼠已插入源自人类或其他物种的DNA。敲入技术和转基因技术的区别在于敲入 涉及将基因插入到特定的基因座，因而是"靶向的"插入。见，例如，Billerb eck，E.等， Blood, 117(11) (2011)。
[0066] 造血干细胞、人细胞因子蛋白和/或编码一种或多种人细胞因子的核酸同时或相 继引入。在特定的方面，人造血干细胞被引入到非人类哺乳动物中和该非人类哺乳动物被 保持在其中人造血干细胞被重新定殖非人类哺乳动物的造血系统的条件下。在用人造血干 细胞重构非人类哺乳动物的造血系统后，随后将人细胞因子引入到非人类哺乳动物中。在 特定的实施方式中，人造血干细胞被引入新生幼仔（例如，约48小时龄）中且在约1个月、 约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10 个月、约11个月、约12个月后引入人细胞因子蛋白和/或编码一种或多种人细胞因子的核 酸。
[0067] 一旦引入造血干细胞和一种或多种人细胞因子，将非人类哺乳动物保持在其中非 人类哺乳动物用人造血干细胞重构和细胞因子在非人类哺乳动物中刺激人免疫细胞的分 化、增殖和/或功能的条件下。本发明的非人类动物被保持在其中的这样的条件包括符合 如本领域技术人员已知的哺乳动物的基本需求（例如，食物，水，光）。
[0068] 本文描述的方法可以进一步包括确定所述编码一种或多种人细胞因子的核酸是 否被表达，人类造血干细胞是否存在和/或人造血干细胞是否分化为一种或多种人血液谱 系细胞。本文提供了用于确定核酸是否表达和/或非人类哺乳动物是否被造血干细胞重构 的方法，且这些方法是本领域的技术人员公知的。例如，使用对于人造血干细胞的细胞表面 标志物特异性的抗体的流式细胞分析可用于检测非人类哺乳动物中人造血干细胞的存在。 此外，可从非人类哺乳动物中收集血清并分析人细胞因子的存在。也可以使用用来评估分 化的造血干细胞（例如，NK细胞、树突细胞、T细胞、B细胞、单核细胞/巨噬细胞、红细胞） 的功能的测定法。见，例如，W0 2011/002727号公开的国际申请，本文通过引用引入其整体。 [0069] 如本领域技术人员理解的，除了细胞因子，可以在该方法中使用其它的蛋白质和/ 或编码其它蛋白质（例如，人蛋白质、人分泌蛋白）如生长因子的核酸、类固醇和/或小分 子，来提高血液谱系细胞之外的人细胞的重构和/或功能。例如，可以将一种或多种人细胞 因子的激动剂引入到非人类哺乳动物中以增强造血干细胞的重构。
[0070] 本文所描述的方法可被用于评估多种药剂在人类中的毒性。例如，药剂可以是小 分子量的有机或无机分子、治疗剂、诊断剂、美容剂和/或食品添加剂。药剂的具体实例包 括抗体（例如，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体等）、蛋白质、核酸、多糖、月旨 多糖、脂蛋白、脂质、疫苗接种剂（例如，微生物抗原）、纳米颗粒等。
[0071] 可以使用多种施用途径中的任一种将药剂施用于非人类哺乳动物。施用途径的 例子包括皮内、肌内、腹膜内、眼内、股骨内、心室内、颉内、鞘内、静脉内、心脏内、肝内、骨髓 内、皮下、局部、口服和鼻内施用途径。其他合适的引入方法还可以包括，流体动力学基因递 送、基因治疗、可再装填或可生物降解的装置、粒子加速装置（"基因枪"）和缓释的聚合物 装直。
[0072] 如本领域的技术人员理解的，有多种方法可以用来确定药剂是否在非人类哺乳动 物中引起毒性、免疫毒性和/或细胞因子风暴。例如，通过在施用药剂后测定出现在非人类 哺乳动物中的细胞表面标志物、免疫细胞表型（例如，作为例如人类中的毒性（免疫毒性） 的指示的免疫细胞表型）、一种或多种肝酶的表达增加、一种或多种促炎性细胞因子的表达 增加或它们的组合来确定该药剂是否在非人类哺乳动物中引起毒性。
[0073] 如本领域的技术人员理解的，可以用各种方式来确定免疫细胞的表型。例如，可以 通过确定在非人类哺乳动物中产生的一种或多种免疫细胞的增殖（提高；降低）和/或活 化（提高；降低）来测定免疫细胞的表型。免疫细胞可以是人免疫细胞、小鼠免疫细胞或它 们的组合。在具体的实施方式中，免疫细胞表型是通过确定在非人类哺乳动物中产生的一 种或多种人免疫细胞的增殖（提高；降低）和/或活化（提高；降低）而测定的。免疫细胞 (人；小鼠）的例子包括淋巴细胞（如Τ细胞、Β细胞）、自然杀伤（ΝΚ)细胞、单核细胞、巨 噬细胞、⑶45. Γ细胞等。
[0074] Τ细胞的增殖可以通过测定表达⑶3+的细胞来确定，Β细胞的增殖可以通过测定 表达⑶19+的细胞来确定，ΝΚ细胞的增殖可以通过测定表达⑶56+的细胞来确定，和单核细 胞/巨噬细胞的增殖可以通过测定表达CD14+的细胞来确定。此外，Τ细胞的增殖可以通 过测定表达⑶45+⑶3+的细胞来确定，Β细胞的增殖可以通过测定表达⑶45+⑶19+的细胞 来确定，ΝΚ细胞的增殖可以通过测定表达CD45+CD56+的细胞来确定，淋巴细胞的增殖可以 通过测定表达⑶45+⑶56+的细胞来确定，和单核细胞/巨噬细胞的增殖可以通过测定表达 ⑶45+⑶14+的细胞来确定。
[0075] 与这些免疫细胞的标志物特异性结合的抗体可被用于检测。此外，或可选地，免疫 组织化学可用于检测表达这些标记的人类细胞对非人类哺乳动物中一种或多种器官的浸 润。免疫细胞的分离也可用于定量不同的免疫细胞类型。
[0076] 如本领域的技术人员理解的，免疫细胞（例如，人或小鼠免疫细胞）的活化也可以 用于确定药剂是否引起毒性。例如，⑶69、⑶25、⑶44的表达增加和⑶62L抗原的表达降低 指示活化的Τ细胞。
[0077] 用来检测或测定一种或多种肝酶（鼠或人）在非人类哺乳动物中的表达增加的方 法也是本领域已知的。例如，已知的方法包括那些检测天冬氨酸氨基转移酶和/或丙氨酸 氨基转移酶的方法。
[0078] 类似地，用于测定一种或多种促炎性细胞因子（人或小鼠）的表达增加的方法也 是本领域技术人员已知的。促炎性人细胞因子包括白介素-2(IL-2)、IL-6、IL-8、IL-1 β、 IL-4、γ干扰素（IFN-γ)、肿瘤坏死因子a (TNF-a)、IL_10或它们的组合。
[0079] 可以如本文所述地使用流式细胞术来确定促炎性细胞因子的表达增加。具体地， 使用BD Cytometric Bead Array(CBA)(BD Biosciences，美国）检测血清中的促炎细胞 因子。本实验是根据制造商的建议进行的，并用FCAP阵列软件（Soft Flow Hungary, BD Biosciences)分析结果。可选地，可以使用基于抗体的方法和/或酶联免疫吸附测定法。
[0080] 测定非人类哺乳动物中的毒性（例如，免疫毒性）的其他方法包括获得体重测量 和/或分析组织切片（肝、肾和肺）、血液参数（肌酐、高灵敏度CRP (CRPHS)、白蛋白和血液 尿素氮（BUN)，测量血小板（减少）以及DD二聚体增加（增加）。
[0081] 可以在向非人类哺乳动物施用药剂后的一个或多个时间点确定该药剂是否在非 人类哺乳动物中引起毒性。例如，可以在施用药剂之后的一小时或多小时（例如，约1小时、 2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13 小时、14小时、15小时、16个小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22个小时、23 小时、24小时），一天或多天（例如，2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、 12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、 25天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、34天、35天、 36天、37天、38天、39天、40天），一周或多周（例如，1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8 周、9周、10周、11周、12周），一个月或多个月（如1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6 个月）或者1年或多年（例如，1年、2年）等确定药剂是否在非人类哺乳动物中引起毒性。 [0082] 本发明的方法可以进一步包括将已施用了该药剂的非人类哺乳动物中的效应与 合适的对照比较。例如，合适的对照是已经移植人造血干细胞并用人细胞因子处理（施用； 引入）但未施用药剂的非人类哺乳动物。
[0083] 到目前为止，存在几种使用来自人的全血或PBMC筛选细胞因子释放综合征的体 外分析方法。单克隆抗体在水溶液中测试，或者通过直接空气干燥或湿法涂布直接地固定 或通过抗Fc捕获间接地固定在塑料板上。在刺激大细胞因子释放的方面，最成功的应用方 法是在板上mAb的空气干燥或向具有内皮细胞单层的培养物加入可溶性mAb。利用人源化 的小鼠更接近地模拟人体环境，从而不仅测定细胞因子的释放，而且测定其他免疫学参数， 如不同亚型的免疫细胞的免疫表型分型、增殖、活化信生物化学参数，并且因此应当提供更 加接近地重组在mAb给予患者时所发生的事情，并因此具有良好的预测价值。
[0084] 目前在志愿者上的新药临床试验导致90%的药物失败。这种失败往往是由于在 临床前研究中未暴露出来的毒性，这主要应归因于现有的动物和灵长类动物模型的不足， 因为在人类和动物/灵长类动物之间免疫系统存在差异。对于投资风险评估，可以准确地 预测这些副作用的动物模型的商业价值是巨大的。此外，已经成功地通过了所有体外和临 床前试验的许多候选药物没有达到临床试验阶段，因为他们无法获得适当的资助。在这 方面，本文所描述的人源化模型可以用作以高准确度确定大量临床相关候选者用于临床 评价的优先级的平台。本文提供了证明细胞因子处理的人源化小鼠呈现了用于药物免疫 毒性测试的强大预测工具的有力证据。基于如在毒性研究中测定的"无可见不良作用水 平"（N0AEL)和"最小预期生物学效应水平"（MABEL)，本文所述的方法有助于首次人体实验 (first-dose-in-man)的评估和建立。另一个应用是鉴定副作用所依据的不同机制和确定用 于人体中的细胞因子释放综合征的最灵敏的和预测性的常见生物标志物。如本文所示，人 源化小鼠不仅能显示特定单克隆抗体的预期的副作用，也证实了其相应的期望的效果（例 如，T细胞或B细胞的耗尽）。这些优势指明了超出药品安全性的应用，而且还指向靶向免 疫系统的分子的标准药物测试。本文提供的模型是临床前和临床试验之间缺少的环节。该 模型整合到药物开发模式中具有促进进入首次人体临床试验和加快新疗法应用于患者的 过程的潜力。
[0085] 虽然已经利用IL-15和Flt-3L处理的人源化小鼠举例证明了本发明用于药物免 疫毒性试验的强大预测工具，本领域技术人员应理解，可以使用其他细胞因子，例如，为了 增强T细胞的反应，可以利用GMCSF和IL-4来处理小鼠，或者为了增加单核细胞的数目，可 以利用MCSF来处理小鼠，因为细胞因子释放综合征的发生也通过对非靶细胞上的Fc受体 的mAb Fc端以引起细胞因子释放，或与Fc受体的结合引起通过靶细胞的聚集和信号传导。
[0086] 示例件说明
[0087] 实施例1
[0088] 方法
[0089] 胎肝⑶34+(HSC)细胞的分离
[0090] 按照研究伦理指南从妊娠15-23周的流产胎儿获得人胎肝。所有的女性都给出 了捐赠胎儿组织用于研究的书面知情同意。在妊娠终止2小时内在无菌条件下收集胎儿。 最初将来自胎儿的肝脏组织切成小块，然后用在37°C下用在DMEM中制备的2mg/ml胶原 酶IV消化15分钟，伴随定期搅拌。然后，通过将消化组织通过100 μ m的细胞过滤器（BD Biosciences)制备单细胞悬浮液。通过用台盼蓝排除死细胞来计数活细胞。利用⑶34阳 性筛选试剂盒（Stem Cell Technologies,Canada)在无菌条件下进行细胞分离程序。通过 流式细胞术测定⑶34+细胞的纯度且纯度评定在80至95%之间。
[0091] 人源化小鼠的构建和流体动力学基因递送
[0092] NSG小鼠购自Jackson实验室并饲养在新加坡南洋理工大学和新加坡国立大学的 动物设施的特定无菌条件下。为了小鼠重构，使用伽玛射线源以l〇〇cGy照射新生幼崽（少 于48小时龄），并用⑶34+⑶133+细胞心内注射（1 X 105个细胞/受体）。如前所述地（Chen Q 等（2009) Proc Natl Acad Sci, USA, 106:21783-21788)单独地将人 IL-15 和人 Fltr-3 配 体克隆到pcDNA3. 1(+)载体（Invitrogen，USA)中。对于流体动力学基因递送，用27号针 头在7秒内将总量为2ml生理盐水中50 μ g的各质粒注射12周龄的人源化小鼠（humice)。 所有用人类样品和小鼠进行的研究遵守伦理指南。
[0093] 人单克隆抗体的注射
[0094] 在细胞因子处理后7天采样的血液被用作用于设定不同细胞因子的产生水平及 人细胞绝对数和百分比的基线的时间点（-48小时）。两天后（0小时），小鼠然后用重悬 浮于200 μ 1的临床级（0. 9% )的氯化钠溶液（Braun)中的相应单克隆抗体（mAb)之一， TGN1412-IgG4(在本文中也称为 TGN1412-AA)(抗-CD28, JN Bioscences LLC，USA 定制生 产）、0KT3 (抗 0)3, Biolegend)、CampathX (阿仑单抗、抗⑶52, Genzyme Corporation, Cambridge, ΜΑ)或Mabthera? (利妥昔单抗、抗⑶20, Hoffmann-La Roche)静脉内注射 (25 μ g/小鼠）。mAb处理后2小时和24小时收集血样，且于24小时对所有注射的动物实 施安乐死。
[0095] 单细胞制备，细胞因子检测，抗体和流式细胞术
[0096] 通过标准方法从脾脏制备单细胞悬浮液。下面的人偶联抗体被用于流式细胞术 染色：CD3、CD4、CD8、CD19、CD28、CD45、CD45R0、CCR7,来自 Biolegend ;CD14 和 CD56,来自 BD Biosciences(BD Biosciences，USA)和小鼠 CD45. 1，来自 eBioscience。在含有 0.2% BSA和0.05 %叠氮化钠的100 μ 1 PBS中在冰上用适当的抗体染色细胞30分钟。使用 FACSDiva软件（BD，Franklin Lakes，NJ)，在LSRII流式细胞仪上执行流式细胞分析，以及 使用Flowjo软件分析样品。对于细胞因子检测，使用BD Cytometric Bead Array(CBA) (BD Biosciences，USA)在血清中测定人 IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-iP、TNF-a 和 IFN-γ 的浓度。本实验是根据制造商的建议进行，且用FCAP阵列软件（Soft Flow Hungary，BD Biosciences)对结果进行分析。
[0097] 统计学
[0098] 使用 GraphPad Prism 5. 0 (Graph-Pad Softwares Inc. , CA，USA)对结果进行分 析。
[0099] 结果
[0100] 如本文所述，对移植人造血干细胞和人细胞因子处理的免疫缺失小鼠（例如，NSG 小鼠）是否增强免疫系统并能作为用于分析和预测在人体中的毒性的准确和可靠的系统 进行了研究。对于⑶28、⑶3、⑶52和⑶20特异性的四种单克隆抗体被用来验证该系统， 因为已知这些抗体在人体中显示出了不同的副作用。主要的副作用是"细胞因子风暴"。测 定了处理的小鼠中的细胞因子释放，并与临床数据的分泌谱相比较。TGN1412注射后，小鼠 显示出人IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-8血清水平的显著增加。这在那些没有用人细胞因 子处理的人源化小鼠中未观察到。细胞因子处理用于获得上述的细胞因子反应。细胞因子 产生的动力学与在临床试验中描绘的表达曲线良好符合，其中所有6个志愿者表现出类似 的趋势。然而，6名征募者中只有2名显示出IL-4水平升高和对于IL-1 β，6名征募者中3 名显示出水平升高。类似地，9只小鼠中只有2只表现出增加的IL-4水平，但在IL-Ιβ水 平中没有变化。除了在细胞因子水平上观察到的相似性外，人类和人源化小鼠两者中Τ细 胞数量显著减少，和CD4+细胞似乎受到更加深刻地影响，大概是因为他们表现出了 CD28的 较高表达。注意到的唯一差异是单核细胞计数只在临床试验中降低；这可能与人源化小鼠 和人类之间单核细胞数的初始差异有关。值得一提的是临床试验前在野生型小鼠的初步研 究中没有检测到任何这些症状。在细胞因子处理的人源化的小鼠中鉴别了 CD4+效应记忆 细胞⑶4+⑶45R0+CCR7⑶28+，并发现其负责在TGN1412刺激后产生促炎性细胞因子。该子 集是人类特有的和不存在于非人类灵长类动物和野生型小鼠中，并能解释在常规模型中检 测不到显著的副作用。
[0101] 类似于用TGNI412获得的结果，在细胞因子处理的人源化小鼠中施用0ΚΤ3导致人 IL-2、IL-6、IL-8和IFN-γ细胞因子升高。这些结果与0ΚΤ3治疗的肾移植患者中报道的 结果相当。注意到的Τ细胞耗竭也与其中在注射后两小时明显淋巴细胞减少和中性粒细胞 减少的患者中的结果一致。
[0102] 还测试了已知在患者中引起较温和的细胞因子风暴的阿仑单抗。对细胞因子处理 的人源化小鼠施用阿仑单抗在2小时时诱导人IL-2、IL-6、IL-8和LL-1 β水平的升高，但 在24小时时恢复到基线水平，除了 IL-1 β。注射后2小时观察到Β和Τ细胞、ΝΚ细胞和单 核细胞的严重减小。所有这些结果与在用阿仑单抗治疗的患者中所观察到的相似。
[0103] 也对利妥昔单抗进行了测试，其为已知在患者中仅具有很少或没有炎性细胞因子 释放的单克隆抗体，这与对于TGN1214和0KT3描述的严重副反应相反。在1项临床研究中， 证明在施用利妥昔单抗之后，一些白血病患者显示轻微的IL-6(约80pg/ml)和TNF-β (约 870pg/ml)水平的上升，而IL-2、IL-4和IFN-γ具有最小变化，与基线水平相比。细胞因 子释放是瞬间的，因为两种细胞因子水平在完成最初的利妥昔单抗输注后回到基线。这种 诱导的表达与具有大量B淋巴细胞的白血病患者相关。在本文所描述的研究中缺乏细胞因 子释放可能与相对于慢性淋巴细胞性白血病患者相比CD20+淋巴细胞数目较低有关。然而， 本文描述的模型更与在类风湿关节炎患者中观察到的结果相当，其中观察到了外周血B细 胞的耗竭。虽然在注射mAb后2小时和24小时观察到T细胞数目的减少，这与描述了利妥 昔单抗输注后外周T细胞计数的短暂下降的临床试验的结果一致。
[0104] 总之，这些结果表明，细胞因子处理的人源化小鼠可预测包括单克隆抗体和其它 蛋白质治疗剂的生物治疗剂的急性免疫毒性。
[0105] 实例例2
[0106] 下面提供的是实施例1中描述的实验的另外的数据和再分析，其中对细胞因子处 理的人源化小鼠是否能够准确预测抗体治疗剂的免疫毒性进行了评价。如实施例1中描述 的，选择在人类中具有不同程度副作用的四种单克隆抗体用于分析。
[0107] 除了 TGN1412, 0KT3(用于抑制肾同种异体移植排斥反应的抗人⑶3的小鼠 mAb) 已知引起严重的不良反应，包括细胞因子释放综合征和急性或严重流感样综合征。阿仑单 抗（一种用于治疗慢性淋巴细胞性白血病和预防移植物抗宿主病的人源化抗CD52抗体） 也已知诱导炎性细胞因子的释放。⑶52是在基本上所有正常和恶性T和B淋巴细胞、大部 分单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞的表面上表达的糖蛋白。在首次剂量的阿仑单抗后 也观察到炎性细胞因子释放。在患有复发性或难治性B细胞慢性淋巴细胞白血病的患者 中，那些有重大淋巴结病的患者更容易发生细胞因子释放综合征。利妥昔单抗是鼠-人嵌 合抗体，其结合主要位于前B和成熟B淋巴细胞上的CD20。利妥昔单抗导致自身免疫性疾 病的有效调控，并且也用于白血病和淋巴瘤的治疗，显示出轻度至没有副作用，主要取决于 肿瘤的性质和重要性。本文中所描述的研究表明，人源化小鼠的结果准确地预测四种抗体 治疗剂在人类中的免疫毒性。
[0108] 材料与方法
[0109] 胎肝⑶34+细胞分离
[0110] 按照研究伦理指南（Polkinhorne)从妊娠15-23周的流产胎儿获得人胎肝。所有 的女性都给出了捐赠胎儿组织用于研究的书面知情同意。在妊娠终止2小时内在无菌条件 下收集胎儿。最初将来自胎儿的肝脏组织切成小块，然后在37°C下用在DMEM中制备的2mg/ ml胶原酶IV消化15分钟，随随定期搅拌。然后，通过将消化的组织通过100 μ m的细胞过 滤器（BD Biosciences)制备单细胞悬浮液。通过用台盼蓝排除死细胞来计数活细胞。利 用⑶34阳性筛选试剂盒（Stem Cell Technologies, Canada)在无菌条件下进行细胞分离 程序。通过流式细胞术测定⑶34+细胞的纯度和纯度评定在90至98%之间。
[0111] 人源化小鼠的构建和流体动力学基因递送
[0112] NSG小鼠购自Jackson实验室并被饲养在新加坡南洋理工大学和新加坡国立大学 的动物设施的特定无菌条件下。为了小鼠重构，使用伽玛射线源以l〇〇cGy照射新生幼崽 (少于48小时龄），并用⑶34+⑶133+细胞心内注射（1 X 105个细胞/受体）。如前所述地 单独地将人IL-15和人Fltr-3配体克隆到pcDNA3. 1(+)载体（Invitrogen，USA)中。对于 流体动力学基因递送，用27号针头在7秒内将总量2ml的盐水中的50 μ g各质粒注射12 周龄的人源化小鼠。所有人类样品和小鼠的研究遵守伦理指南
[0113] 人单克隆抗体的注射
[0114] 在细胞因子处理后7天采样的血液被用作用于设定不同细胞因子的产生水平和 人细胞绝对数和百分比的基线的时间点（-48小时）。两天后（0小时），小鼠然后用悬浮 于200 μ 1的临床级（0. 9 % )氯化钠溶液（Braun)中的相应的单克隆抗体（mAb)之一， TGN1412-IgG4 或 TGN1412-AA (抗-CD28, JN Bioscences LLC，USA 定制生产）、0KT3(抗 CD3, Biolegend)'Campath1*'(阿仑单抗、抗 CD52，Genzyme Corporation，Cambridge，ΜΑ) 或Mabthera4 (利妥昔单抗、抗CD20, Hoffmann-La Roche)静脉内注射（25yg/小鼠）。 mAb处理后2小时和24小时收集血样，且于24小时时对所有注射的动物实施安乐死。
[0115] 单细胞制备，细胞因子检测，抗体和流式细胞术。
[0116] 通过标准方法从脾脏制备单细胞悬浮液。下面的人偶联抗体被用于流式细胞术染 色：CD3、CD4、CD8、CD19、CD28、CD45、CD45R0、CCR7,来自 Biolegend ;CD14 和 CD56,来自 BD Biosciences (BD Biosciences，USA)和小鼠 CD45. 1，来自 eBioscience。在含有0· 2% BSA和 0. 05%叠氮化钠的100 μ 1 PBS中在冰上用适当的抗体染色细胞30分钟。使用FACSDiva软 件（BD，Franklin Lakes，NJ)在LSRII流式细胞仪上执行流式细胞分析，以及使用Flowjo软 件分析样品。对于细胞因子检测，使用BD Cytometric Bead Array(CBA)(BD Biosciences， USA)在血清中测定人 IL-2、IL-6、IL-8、IL-1P、TNF-a 和 IFN-γ 和小鼠 IL-2、IL-6、IL-8 的浓度。本实验是根据制造商的建议进行，且用FCAP阵列软件（Soft Flow Hungary，BD Biosciences)对结果进行分析。
[0117] 统计学
[0118] 使用 GraphPad Prism 5. 0 (Graph-Pad Softwares Inc. , CA，USA)对结果进行分 析。
[0119] 结果
[0120] TGN1412在细胞因子处理的人源化小鼠中诱导与在人类中类似的不良副作用
[0121] 对细胞因子处理的人源化小鼠模型是否可以预测TGN1412抗体的严重副作用进 行了测试。通过用人造血干细胞移植入NSG初生幼仔来构建人源化小鼠。为了增强人免疫 反应，用编码人IL-15和Flt-3L的质粒高压注射重构的小鼠。注射细胞因子质粒后七天， 用lmg/kg的TGN1412-IgG4或FcR-非结合的突变形式（TGN1412-AA)静脉注射产生的细胞 因子处理的人源化小鼠。在注射后2小时，与对照（盐水）组相比，来自两个处理组的小鼠 表现出人IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-8血清水平的显著增加。相比于TGN1412-AA-处理 的小鼠，在TGN1412-IgG4处理的小鼠中IL-2的水平略低。虽然在24小时后IL-2水平返 回到处理前的程度，IL-6、IL-8和IFN-γ的水平保持升高（图15)。具有提高水平的细胞 因子产生的小鼠呈现虚弱的临床症状，伴随着活动力性急剧下降。然而未用编码人IL-15 和Flt-3L的质粒注射的重构小鼠在注射TGN1412-IgG42小时和24小时后没有显示出在 细胞因子血清水平的显著变化（图17)。也在注射人M-CSF质粒以增加人单核细胞和巨噬 细胞数量后进行实验，目的是增加 TGN1412-IgG注射后细胞因子的释放（图19)。尽管在 TGN1412-IgG4和FcR-非结合的突变形式（TGN1412-AA)之间观察到相似的细胞因子释放 量，但体外实验已经证明，炎症细胞因子的产生在TGN1412结合于塑料培养板后增加。分析 了如先前在体外研究中报道的与FcR的结合有助于细胞因子的释放的程度，即使已知IgG4 与Fc受体的结合效率较低。在注射后2小时，用M-CSF质粒处理的小鼠与IL-15和Flt-3L 处理的小鼠比较，显示出人IL-6(36. 8比173. 8pg/ml)和IL-8(131.8比234. Opg/ml)血清 水平的增加（图15和图19)。这些结果证实在细胞因子处理的人源化小鼠模型中人细胞因 子风暴的产生。
[0122] 在细胞因子处理的人源化小鼠中，细胞的定量揭示，T细胞数降低最多，其次是NK 细胞，而B细胞（除M-CSF处理的小鼠）和单核细胞的数量保持不变（图16A和20A)。在 注射细胞因子后2小时，注射了 TGN1412-IgG4的小鼠与TGN1412-AA处理相比，表现出外周 血中更明显的循环T细胞和NK细胞的下降（图16A)。无论细胞因子水平，观察到与未经 细胞因子处理的人源化小鼠相当的结果，尽管注射TGN1412-IgG4后24小时注意到B细胞 绝对数的缩减（图18A，18C)。在注射后24小时，用编码人IL-15和Flt-3L的质粒处理的 或未处理的小鼠的脾中观察到类似的趋势（图24和25)。注意到的T细胞减少与失败的 临床试验中观察到的下降相当。此外，与CD3+CD8+细胞相比，在CD3+CD4+子集中观察到明 显得多的降低。虽然所有的⑶3+细胞表达⑶28,⑶4+细胞上的⑶28平均荧光强度（MFI) 高于CD8+子集上的2倍（图23A-23B)。此外，CD4+群体内CD28的表达在记忆（中央和效 应）T细胞上比天然T细胞高3倍（图23A-23B)。最后，肝毒性生物标志物：天冬氨酸转氨 酶（AST)(图22A，22B)和丙氨酸转氨酶（ALT)的水平仅在处理组（图22C，22D)的血液中 显著升高。
[0123] 0KT3在细胞因子处理的人源化小鼠中与在人类中一样诱导相似的不良副作用
[0124] 在类似用于TGN1412测试的实验方法后，对人源化小鼠的0KT3处理的效果进行了 评估。向细胞因子处理的人源化小鼠注射lmg/kg的0KT3,并在2和24小时取血样。与人 mAb注射之前的基线水平相比，在早至注射后2小时观察到IL-2、IL-6、IL-8和IFN-γ的 循环水平的显著增加（图15)。虽然注射后24小时IL-2的表达减少，注射后24小时其它 细胞因子保持升高。值得注意的是，与TGN1412处理的小鼠相比，0KT3治疗的小鼠中细胞 因子的浓度高3至10倍。在注射后2小时，与用TGN1412观察到的一样，用M-CSF质粒处 理的小鼠与IL-15和Flt-3L处理的小鼠比较表现出增加的人IL-6(131. 8比1512. 8pg/ml) 和IL-8 (266. 5. 8比722. 6pg/ml)血清水平（图15和19)。此外，在注射后2和24小时都 注意到T细胞的完全耗尽（图16A，16D)。与TGN1412处理的小鼠相当，在0KT3处理后观察 到NK细胞的相对数量和绝对数量的瞬时下降（图16A，16D)。与TGN1412处理相反，0KT3 注射在注射后2小时诱导⑶14+细胞的4倍降低（图16A)。
[0125] 阿仑单抗在人源化小鼠中诱导某些人炎性细胞因子，但淋巴细胞、NK细胞和单核 细胞急剧耗尽
[0126] 用lmg/kg的阿仑单抗注射细胞因子处理的人源化小鼠。与基线水平相比，在注射 后2小时检测到IL-2、IL-6、IL-8和IL-1 β血清水平的增加（图15)。然而除IL-1 β夕卜， 大多数细胞因子在注射后24小时已恢复到基线水平。该观察与先前研究的PBMC对在水相 中孵育的阿仑单抗的 IL_2(31. 6 比 14. Opg/ml)、IL-6(19. 2 比 88pg/ml)和 IL-8(224. 1 比 6050pg/ml)反应相当。此外，⑶52注射后观察到淋巴细胞、单核细胞和NK细胞的完全耗尽 (图16A，16B)。对于阿仑单抗和0KT3注射的细胞因子处理人源化小鼠观察到小鼠 IL-6细 胞因子的增加，最可能与小鼠单核细胞和巨噬细胞上的Fc受体的结合有关（图21)。
[0127] 利妥昔单抗不引起任何显著副作用
[0128] 用利妥昔单抗（lmg/kg)静脉内注射细胞因子处理的人源化小鼠，并与盐水注射 的对照组进行比较。在利妥昔单抗处理后测定的细胞因子的表达与用TNG1412和0KT3看到 的反应显著不同，因为没有观察到任何所测量的细胞因子（IL-1 β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、 IFNi、TNF-α )的释放（图15)。此外，注射的小鼠没有表现出任何虚弱或危困的迹象。 正如预期的那样，在不同的细胞谱系间，受影响的细胞类型是B细胞（百分比和总数），因 为大多数细胞在注射2小时后耗尽（图16A，16B)。虽然mAb注射后2和24小时也观察到 T细胞数的减少，这与描述输注利妥昔单抗后外周T细胞计数的短暂下降的临床试验结果 一致（方案号：WA17042)。此外，肝酶水平（AST和ALT)在单克隆抗体处理后保持不变（图 22A-22D)。
[0129] 讨论
[0130] 由于主要副作用导致临床试验中止反映出传统的临床前系统未能准确地预测在 人体中的这种不良反应。如本文中所描述的，研究了移植人造血干细胞和细胞因子处理以 增强免疫系统的NSG小鼠是否能够用作用于分析和预测在人体中的免疫毒性的准确和可 靠的系统。使用对于⑶28、⑶3、⑶52和⑶20特异性的四种单克隆抗体来验证该系统，因为 已知这些抗体在人体中显示出不同的副作用。主要的副作用是"细胞因子风暴";测定了在 处理的小鼠中的细胞因子释放，并将分泌特征与临床数据进行比较。注射TGN1412后，小鼠 显示出人IL-2、IFN-Y、TNF-a和IL-8血清水平的的显著增加。细胞因子产生的动力学与 在临床试验中描绘的表达曲线一致，其中所有6个志愿者表现出类似的趋势。然而，6名征 募者中只有2名显示出升高的IL-4水平和对于IL-1 β，6名征募者中3名显示出升高的水 平。类似地，9只小鼠中只有2只表现出增加的IL-4水平，但IL-1 β水平没有变化。除了在 细胞因子水平上观察到的相似性，Τ细胞淋巴细胞减少在人类和人源化小鼠中都显著降低， 并且CD4+细胞似乎受到更加深刻的影响，大概是因为他们表现出CD28的较高表达。注意到 的唯一差别是单核细胞计数只在临床试验中下降；这可能与小鼠和人类之间的单核细胞数 量的初始差异相关。值得一提的是临床试验前在野生型小鼠的初步研究中没有检测到这些 症状。在细胞因子处理的人源化小鼠中确定了⑶4+效应记忆细胞⑶4+⑶45R0+CCR7-⑶28+ 造成TGN1412刺激后促炎性细胞因子的产生。该子集是人类特有的和不存在于非人类灵长 类动物和野生型小鼠中，并能解释在常规模型中检测不到显著的副作用。总的来说，如果在 药物开发过程中正确的时间执行，本文所描述的模型所取得的结果能够警示在人体试验中 使用这种分子的危害，并因此防止在失败的临床试验中看到的灾难性事件。
[0131] 类似于用TGNI412获得的结果，在细胞因子处理的人源化小鼠中施用0ΚΤ3导致人 IL-2、IL-6、IL-8和IFN-γ细胞因子的升高。这些发现与报道的0ΚΤ3治疗的肾移植患者 的结果一致。
[0132] 注意到的Τ细胞耗竭也与患者中的结果一致，其中在注射后两小时淋巴细胞减少 和中性粒细胞减少明显。还测试了已知在患者中引起细胞因子风暴的阿仑单抗。对细胞因 子处理的人源化小鼠施用阿仑单抗在2小时诱导人IL-2、IL-6、IL-8和LL-1 β水平的升 高，但在24小时时恢复到基线水平，除了 IL-Ιβ。注射后2小时观察到严重的B和T细胞、 ΝΚ细胞和单核细胞的减少，在24小时时只有残留的单核细胞保留。所有这些结果与在用阿 仑单抗治疗的患者中所观察到的相似。
[0133] 也对利妥昔单抗进行了试验，其已知是一种在患者中仅具有很少或没有炎性细胞 因子释放的单克隆抗体，这与对于TGN1214和0ΚΤ3描述的严重不良反应相反。在1项临床 研究中，结果表明施用利妥昔单抗之后，一些白血病患者显示轻微的IL_6(约80pg/ml)和 TNF-β (约870pg/ml)水平的上升，与基线水平相比IL-2、IL-4和IFNi具有很小变化。细 胞因子释放是瞬时的，因为两者细胞因子水平在完成最初的利妥昔单抗输注后回到基线。 该诱导的表达与具有大量B淋巴细胞的白血病患者相关。在本文所描述的研究中缺乏细 胞因子释放可能与相对于慢性淋巴细胞性白血病患者较低的CD20+淋巴细胞数量相关。然 而，本文描述的模型与类风湿关节炎患者中观察到的结果更相当，其中仅观察到了外周血B 细胞的耗竭。可能有利的是在其靶人肿瘤细胞存在下在人源化小鼠中测试利妥昔单抗。已 知T细胞是在注射0KT3和TGN1412后炎性细胞因子的主要产生者，虽然对于不具有内在的 T细胞活化潜力的利妥昔单抗和阿仑单抗，它们可以造成临床相关的细胞因子释放，最可能 是通过其他细胞因子产生者，如单核细胞、巨噬细胞和NK细胞上的Fc受体结合。
[0134] 最后，本文中给出强有力的证据显示细胞因子处理的人源化小鼠提供了用于药物 免疫毒性测试的强有力的预测工具。该系统有助于基于如在毒性研究中确定的"无可见不 良效应水平"（N0AEL)和"最小预期生物学效应水平"（MABEL)评估和建立首次人体实验。 此外，另一种应用是确定副作用所依据的不同机制，并确定用于在人体中的细胞因子释放 综合征的最灵敏的和预测性的常见生物标志物。
[0135] 本文所引用的所有专利、公开的申请和参考文献的教导本文通过引用以其整体并 入。
[0136] 虽然参考其示例性的实施例对本发明进行了具体地表示和描述，但本领域技术人 员能够理解，其中可以在形式和细节上做出各种变化而不背离所附权利要求所涵盖的本发 明的范围和精神。
【权利要求】
1. 一种确定药剂是否在人类中引起免疫毒性的方法，包括： a) 向已移植人造血干细胞（HSC)和施用一种或多种人细胞因子的非人类哺乳动物施 用该药剂；和 b) 确定该药剂是否在该非人类哺乳动物中引起免疫毒性， 其中，如果所述药剂在该非人类哺乳动物中引起免疫毒性，则所述药剂在人类中引起 毒性。
2. 如权利要求1的方法，其中所述非人类哺乳动物是小鼠。
3. 如权利要求2的方法，其中所述小鼠是免疫缺陷小鼠。
4. 如权利要求3的方法，其中所述免疫缺陷的小鼠的免疫系统被人T细胞占据。
5. 如权利要求2、3或4的方法，其中所述免疫缺陷小鼠是NOD. Cg-Prkdcsc;id 112rgtmlWj1/ SzJ(N0D Scidy)小鼠。
6. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种人细胞因子包含白介 素-15 (IL-15)、IL-4、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体（Flt-3L)、粒细胞/巨噬细胞集落刺 激因子（GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子（MCSF)、干细胞生长因子、IL-3或它们的组合。
7. 如前述权利要求中任一项的方法，其中所述非人类哺乳动物用两种细胞因子处理。
8. 如权利要求7的方法，其中所述细胞因子是IL-15和Flt-3L。
9. 如前述权利要求中任一项的方法，其中所述药剂是治疗剂。
10. 如权利要求9的方法，其中所述治疗剂是抗体、蛋白质、核酸、多糖、脂多糖、脂蛋 白、脂质、微生物抗原或纳米颗粒。
11. 如权利要求10的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
12. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药剂是否在所述非人类哺乳动物 中引起免疫毒性通过测定在施用所述药剂后在所述非人类哺乳动物中发生的免疫细胞的 表型、一种或多种肝酶的表达的增加、一种或多种促炎性细胞因子的表达的增加或它们的 组合来确定。
13. 如权利要求12的方法，其中免疫细胞的表型是通过确定一种或多种免疫细胞的细 胞表面标志物、增殖、活化作用或它们的组合而测定的。
14. 如权利要求13的方法，其中所述一种或多种免疫细胞包含T细胞、B细胞、自然杀 伤（NK)细胞、单核细胞/巨噬细胞、CD45. Γ细胞或它们的组合。
15. 如权利要求14的方法，其中T细胞通过测定表达CD3+的细胞确定，B细胞通过测 定表达CD19+的细胞确定，NK细胞是通过测定表达CD56+的细胞确定，和单核细胞/巨噬细 胞通过测定表达⑶14+的细胞确定。
16. 如权利要求12的方法，其中所述一种或多种促炎性人细胞因子包含白介 素-2 (IL-2)、IL-6、IL-8、IL-1 β、IL-4、γ 干扰素（IFN- γ )、肿瘤坏死因子 a (TNF- α )或 它们的组合。
17. 如权利要求16的方法，其中所述一种或多种促炎性细胞因子使用荧光激活细胞分 选法测定。
18. 如权利要求12的方法，其中所述一种或多种肝酶包括天冬氨酸氨基转移酶、丙氨 酸氨基转移酶或它们的组合。
19. 如前述权利要求中任一项的方法，其中该药剂是否在所述非人类哺乳动物中引起 毒性是在施用药剂后的一小时或多小时、数天、数周、数月或数年内确定。
20. 如前述权利要求中任一项的方法，还包括比较所述药剂是否在对照中引起毒性。
21. -种确定对人类施用药剂是否在人类中引起细胞因子释放综合征的方法，包括： a) 向已移植人造血干细胞（HSC)和施用一种或多种人细胞因子的非人类哺乳动物施 用该药剂；和 b) 确定所述药剂是否在所述非人类哺乳动物中引起细胞因子释放综合征， 其中，如果所述药剂在所述非人类哺乳动物中引起细胞因子释放综合征，则该药剂在 人类中引起细胞因子释放综合征。
22. 如权利要求21的方法，其中所述非人类哺乳动物是小鼠。
23. 如权利要求22的方法，其中所述小鼠是免疫缺陷小鼠。
24. 如权利要求23的方法，其中所述免疫缺陷小鼠的免疫系统被人T细胞占据。
25. 如权利要求22、23或24的方法，其中所述免疫缺陷小鼠是NOD. Cg-Prkdcseid 112rgtn'师/SzJ(N0D Scidy)小鼠。
26. 如权利要求21-25中任一项的方法，其中所述一种或多种人细胞因子包括白介 素-15 (IL-15)、IL-4、Fms-相关酪氨酸激酶3配体（Flt-3L)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激 因子（GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子（MCSF)、干细胞生长因子、IL-3或它们的组合。
27. 如权利要求21-26中任一项的方法，其中所述非人类哺乳动物用两种细胞因子处 理。
28. 如权利要求27的方法，其中所述细胞因子是IL-15和Flt-3L。
29. 如权利要求21-28中任一项的方法，其中所述药剂是治疗剂。
30. 如权利要求29的方法，其中所述治疗剂是抗体、蛋白质、核酸、多糖、脂多糖、脂蛋 白、脂质、微生物抗原或纳米颗粒。
31. 如权利要求30的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
32. 如权利要求21-31中任一项的方法，其中所述药剂是否在所述非人类哺乳动物中 引起细胞因子释放综合征通过测定在施用所述药剂后所述非人类哺乳动物中发生的免疫 细胞表型、一种或多种肝酶的表达的增加、一种或多种促炎性细胞因子的表达的增加或它 们的组合来确定。
33. 如权利要求32的方法，其中所述免疫细胞表型通过确定一种或多种免疫细胞的细 胞表面标志物、增殖、活化作用或它们的组合而测定。
34. 如权利要求33的方法，其中所述一种或多种免疫细胞包含T细胞、B细胞、自然杀 伤（NK)细胞、单核细胞/巨噬细胞、CD45. Γ细胞或它们的组合。
35. 如权利要求34的方法，其中T细胞通过测定表达CD3+的细胞确定，B细胞是通过 测定表达CD19+的细胞确定，NK细胞是通过测定表达CD56+的细胞确定，和单核细胞/巨噬 细胞通过测定表达⑶14+的细胞确定。
36. 如权利要求32的方法，其中所述一种或多种促炎性细胞因子包括白介 素-2(IL-2)、IL-6、IL-8、IL-lb、IL-4、γ 干扰素（IFN-γ)、肿瘤坏死因子 α (TNF-α)或 它们的组合。
37. 如权利要求36的方法，其中所述一种或多种促炎性细胞因子使用荧光激活细胞分 选法测定。
38. 如权利要求32的方法，其中所述一种或多种肝酶包括天冬氨酸氨基转移酶、丙氨 酸氨基转移酶或它们的组合。
39. 如权利要求21-38中任一项的方法，其中该药剂是否在所述非人类哺乳动物中引 起毒性在施用药剂后的一小时或多小时、数天、数周、数月或数年内确定。
40. 如权利要求21-39中任一项的方法，还包括比较所述药剂是否在对照中引起毒性。
【文档编号】G01N33/53GK104160272SQ201280068970
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2012年12月5日 优先权日:2011年12月6日
【发明者】S·鲍格尔莫哈, M·库利, 陈清风, 陈建竹 申请人:麻省理工学院