新型肽、含有所述新型肽的组合物及其在用于治疗代谢、心脏和免疫相关疾病的方法中的用途

新型肽、含有所述新型肽的组合物及其在用于治疗代谢、心脏和免疫相关疾病的方法中的用途
【专利摘要】本发明涉及显示代谢调节以及免疫调节性质的多肽、编码所述多肽的核酸、含有所述多肽的组合物以及包含施用所述多肽的治疗代谢紊乱和/或免疫相关疾病的方法；以及所述多肽在制备用于治疗、改善、预防或推迟代谢紊乱和免疫相关疾病中至少一种发作的药物组合物中的用途。
【专利说明】新型肽、含有所述新型肽的组合物及其在用于治疗代谢、心脏和免疫相关疾病的方法中的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及显示代谢调节以及免疫调节性质的新型肽。更具体地，本发明提供新型肽，其能够改善与糖尿病相关的代谢参数及其发病机理、以及其它代谢紊乱如代谢综合征、还有免疫相关疾病和心脏疾病。本发明也针对含有所述肽的组合物、包含其施用的治疗方法及其在制备所述组合物中的用途。
【背景技术】
[0002]在这部分的讨论不限于有资格作为本发明“现有技术”的主题。因此，不承认由于在这种讨论中纳入了特定主题而应该隐含或推断出这样的现有技术状态，也没有声明由于这种纳入应隐含对本发明人的目的的反对。
[0003]在本申请中提到的所有公开通过参考其全部并入本文，包括在其中引用的所有参考。
[0004]碳水化合物代谢紊乱以多种形式存在。最常见的疾病是获得性的。碳水化合物代谢的获得性或继发性紊乱，诸如糖尿病性酮酸中毒、高渗性昏迷和低血糖都影响中枢神经系统。外周神经疾病的许多形式和变种也见于糖尿病。碳水化合物代谢的其余疾病是罕见的先天性代谢缺陷(即遗传缺陷)。
[0005]碳水化合物代谢的获得性疾病在美国和国际上是相当常见的。在酗酒者和使用胰岛素治疗的糖尿病患者中，低血糖是神经疾病，特别是急性精神衰退、失忆、定向障碍、迟钝和昏迷的常见原因。来自其它原因的高胰岛素血症很少，但胰腺肿瘤可以是原因。
[0006]糖尿病(糖尿病)是最常见的内分泌疾病，特征在于葡萄糖代谢异常。异常葡萄糖代谢与导致高血糖症(高的血液葡萄糖水平)的这种疾病相关，并最终导致多器官系统的并发症、包括眼睛、肾脏、神经和血管。持续高血糖的患者或异常葡萄糖耐量的患者通常诊断患有这种疾病，虽然最常见的患者起初存在过度排尿(多尿症)和常因极度口渴(烦渴)而频繁饮水。这种典型的起始症状由高血糖的渗透作用所导致。
[0007]糖尿病的发病机理通常与胰腺机能障碍相关，特别是朗格汉氏胰岛β细胞。这种机能障碍可导致产生胰岛素(一种葡萄糖调节肽激素)的岛β细胞破坏。通常将糖尿病分类为胰岛素依赖型或I型，与之相对的非胰岛素依赖型或II型。
[0008]主要的三种形式或糖尿病是:
[0009]-1型:由身体不能产生胰岛素所导致。治疗通常涉及施用胰岛素。
[0010]-1I型:由身体不能正确使用胰岛素的情况所导致，并伴有相关的胰岛素缺乏。许多人经历多年的糖尿病前期状态，他们注定发展为II型糖尿病，其中当人的血液葡萄糖水平高于正常但并未高至足以诊断为II型糖尿病时发生的情况即糖尿病前期。
[0011]-妊娠糖尿病:之前从未得糖尿病但孕期具有高血糖(葡萄糖)水平的孕妇被认为具有妊娠糖尿病。妊娠糖尿病影响全部孕妇的约4%。其可先于II型(或罕见I型)的发展。
[0012]-许多其它形式的糖尿病从中分开归类。实例包括因胰岛素分泌的遗传缺陷所导致的先天性糖尿病、囊性纤维化相关的糖尿病、由高剂量糖皮质激素诱导的类固醇糖尿病、以及几种形式的单基因糖尿病。
[0013]然而，随着所述疾病已得到更好理解，这种术语已进化。例如，已发现在某些患有非胰岛素依赖型糖尿病的患者中，所述疾病进展为胰岛素依赖型形式，而在其它患者中胰岛素依赖并未发展。
[0014]因此，常依据岛破坏的发病机理的机制将患者分类，I型的指定现在常用于指自身免疫性岛的发病机理，即由岛特异的自身免疫性攻击所导致的糖尿病，并在本文中如此使用。术语胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)指已经进展到这样一种阶段的I型糖尿病，所述阶段中已发生的胰β细胞的自身免疫性破坏足以产生明显症状。术语前IDDM指可通过活检或自身免疫反应分析所检测到的自身免疫情况，其中胰岛β细胞受到特异性自身免疫攻击以至于其中一些细胞可能受到破坏的程度。然而，在前IDDM中所述破坏(如果存在的话)还未进展到足以需要施用胰岛素的程度。因此，在I型糖尿病的早期可以有一个点，其中虽然观察到明显症状但某些岛功能依然保持(已知为“蜜月期”)，所以不是所有I型糖尿病都被分类为IDDM，也不是所有前IDDM都没有明显症状存在。
[0015]由胰岛素不足所导致的异常代谢相关的代谢并发症可影响很多器官系统。最常见的急性代谢并发症是糖尿病酮酸中毒，其特征为严重的高血糖(并产生由渗透性利尿所导致的血容量减少)以及由过度的游离脂肪酸释放和酮体产生所引发的代谢性酸中毒。
[0016]除了酮酸中毒的急性代谢并发症，糖尿病患者易感一系列晚期并发症，其导致相当的发病率和过早死亡率。因为在葡萄糖和脂质代谢两者中的异常，动脉粥样硬化在糖尿病患者中比一般群体中更广泛和更早地发生。这种血管病理可导致，尤其冠状动脉疾病、中风、以及有坏疽的外周血管疾病。视网膜病是另一种糖尿病的血管并发症。糖尿病视网膜病是导致失明的主要原因，通过增加视网膜毛细血管的渗透性而开始，其可进展为闭塞、出血、形成动脉瘤和已知作为增殖·性视网膜病的新血管形成。
[0017]如上述，谨慎控制血液葡萄糖已与改善I型糖尿病晚期并发症相关，其说明保留或恢复β细胞功能可减少或消除所述疾病的大部分病理并发症。
[0018]碳水化合物代谢的遗传疾病很少。已在很少的患者中报告丙酮酸脱氢酶(TOH)复合物的严重缺陷和称为戊糖尿的良性化学异常。
[0019]低血糖、糖尿病性酮酸中毒和高渗性昏迷都可能是致命的，但又是可能治愈的疾病。
[0020]碳水化合物代谢紊乱常与其它代谢紊乱相关，一起形成代谢综合征。代谢综合征是一起发生时增加发展为心血管疾病和糖尿病风险的医学疾病组合。其影响美国五分之一的人，并且流行率随着年龄增加。一些研究显示，据估计在美国流行率达人口的25%。
[0021]在本申请中，发明人提出新型肽，其显示令人惊讶的改善代谢指标的能力，因此改善患有代谢紊乱患者的情况、防止在所述患者中恶化、或推迟发作或为这种疾病提供有效的预防。
[0022]因此，本发明的目的是提供本发明的肽。本发明也提供包含所述肽的组合物、及其在治疗中的用途。
[0023]本发明的这些和其它用途和目的将随着描述进展而变得明显。
【发明内容】

[0024]在第一方面，本发明提供分离的多肽，其包含如SEQ ID N0.USEQ ID N0.5或SEQID N0.9中任一个所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物或类似物。应注意到，所述多肽是类激素蛋白，在本文中也分别被称为APC2、PRT10或UZI#1 ;APC3、PRT9或UZI#2 ;以及APC4、PRTll 或 UZI#3。
[0025]在第二方面，本发明提供包含编码多肽的序列的分离的核酸分子，所述多肽包含如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列、以及任何其片段、衍生物和类似物。应注意，本发明肽片段的非限制性实例也分别如SEQ ID N0.13、14和
15所示。
[0026]本发明进一步提供核酸构建体，其包含如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.6或SEQ IDN0.10中任一个所示的核酸序列、或任何其衍生物、突变体、片段或同系物。所述构建体可选地进一步包含可操作地连接的调控元件。进一步地，本发明提供含有根据本发明的核酸构建体的表达载体、以及使用根据本发明的表达载体所转化或转染的宿主细胞。
[0027]在又一方面，本发明提供组合物，所述组合物含有至少一种分离的多肽、或编码所述分离的多肽的核酸序列，所述分离的多肽包含如SEQ ID N0.K SEQ ID N0.5或SEQ IDN0.9中任一个所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物或类似物。所述组合物可选地进一步包含药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0028]此外，根据某些实施方案，本发明提供用于治疗、改善、预防或推迟代谢紊乱、心脏疾病和免疫相关疾病中至少一种发作的药物组合物。本发明的药物组合物包含至少一种分离的多肽、或编码分离多肽的核酸序列、以及药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述分离的多肽包含如SEQ ID N0.USEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物或类似物。
[0029]在另一方面，本发明提供用于治疗、改善、预防或推迟代谢紊乱、心脏疾病和免疫相关疾病中至少一种发作的方法。所述方法包括如下步骤:向需要其的受试者施用至少一种治疗有效量的分离的多肽、编码分离多肽的核酸序列、任何其组合或混合物或者包含其的任何组合物，所述分离的多肽含有如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
[0030]在又一方面，本发明针对至少一种分离的多肽、或编码分离多肽的核酸序列在制备组合物中的用途，所述分离的多肽含有如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物或类似物。所述组合物适用于治疗、改善、预防或推迟代谢紊乱、心脏疾病和免疫相关疾病中至少一种的发作。
[0031]在又一方面，发明提供分离的多肽，其用于治疗、改善、预防或推迟免疫相关疾病、心脏疾病和代谢紊乱中至少一种的发作。所述多肽包含如SEQ ID N0.K SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物或类似物。
[0032]本发明也提供用于增强葡萄糖代谢、增加葡萄糖耐量、减少血浆胰高血糖素水平、诱导胰岛素受体表达、增加GLUT-4葡萄糖转运蛋白表达、减少TNFa的血清水平以及减少IL-1 β的血清水平的方法，所述方法包括如下步骤:向需要其的受试者施用至少一种治疗有效量的分离的多肽、编码分离多肽的核酸序列、任何其组合或混合物或者包含其的任何组合物，所述分离的多肽含有如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
[0033]本发明的这些和其它方面将借助下列附图变得明显。
【专利附图】

【附图说明】
[0034]图1
[0035]APC-2肽影响葡萄糖耐量
[0036]如所述，在腹膜内施用(2g/Kg体重)葡萄糖注射后，显示用载体(粉色)、0.25mg/Kg(深蓝色线)、1.5mg/Kg(黄色线)、或15mg/Kg(浅蓝色线)的APC-2所处理的小鼠中的小鼠血液葡萄糖水平。
[0037]所有点的SD都低于12%。
[0038]图2
[0039]APC-2妝影响血衆膜闻血糖素水平
[0040]显示如所述使用指定的APC-2剂量所处理的小鼠中的小鼠血液胰高血糖素水平。[0041 ] 所有点的SD都低于12%。
[0042]图3A-3C
[0043]APC-2肽增加在脾细胞中的胰岛素受体和GLUT-4表达
[0044]显示在小鼠中的HPR·T、胰岛素受体和GLUT-4的Northern印迹分析，所述小鼠如所述使用指定的 APC-2 剂量(C[对照];5 [0.25mg/Kg 体重];30 [1.5mg/Kg 体重];300 [15mg/Kg体重])处理。
[0045]图3A:HPRT 的 Northern 印迹分析。
[0046]图3B:胰岛素受体的Northern印迹分析。
[0047]图3C:GLUT_4 的 Northern 印迹分析。
[0048]图4A-4B
[0049]APC-3肽减少TNF α和IL-1 β的水平
[0050]显示在如所述使用指定的APC-3剂量所处理的小鼠中的血清细胞因子水平。
[0051]图4Α:TNFa血清水平分析。
[0052]图4B:IL-1 β血清水平分析。
【具体实施方式】
[0053]本发明此处提供进行代谢和免疫相关参数调节性质的新型肽。因此，在第一方面，本发明提供分离的多肽，其包含如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物或类似物。
[0054]术语“肽”，其也可称为在本文可互换的“蛋白质”或“多肽”，其指氨基酸残基的聚合物以及不限于所述产物的最小长度。因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体等都包括在定义内。定义包括全长蛋白和其片段两者。所述术语也包括多肽的翻译后表达修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等等。此外，出于本发明的目的，“肽”或“蛋白”指包括对天然序列的修饰的肽，例如删除、添加和取代(通常在性质上保守)，所以只要蛋白保留所需活性，即如本说明书中所述的免疫诱导和/或代谢作用，即增加葡萄糖耐量、减少血浆胰高血糖素水平、增加胰岛素受体表达、增加GLUT-4葡萄糖转运蛋白表达和减少TNF a的血清水平以及减少血清IL-Ιβ。这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或者可以是偶然的，例如通过生产所述蛋白的宿主的突变或者由于编码所述蛋白的核酸的PCR扩增错误。
[0055]术语“分离的”或“纯化的”指从其天然环境移出的分子，如氨基酸序列、或肽，分离的或分开的。因此，“分离的肽”是纯化的氨基酸序列。“基本纯化的”分子是至少60%不含，优选至少75%不含，以及更优选地至少90%不含其它天然伴随的成分。如本文所用，术语“纯化的”或“纯化”也指从样本中除去污染物。
[0056]如本文所用的术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸、以及与天然存在的氨基酸以相似的方式行使功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是遗传密码所编码的那些、以及后来得到修饰的那些氨基酸，如羟脯氨酸、Y -羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基或修饰的肽骨架，但仍保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”指这样的化学化合物，其具有的结构与氨基酸的一般化学结构不同，但以天然存在的氨基酸相似的方式行使功能。在本文中氨基酸可通过众所周知的3字母符号指代、或者通过IUPAC-1UB生物化学命名委员会推荐的I字母符号指代。
[0057]“氨基酸序列”或“肽序列”是以肽键连接的氨基酸残基位于肽和蛋白链中的顺序。所述序列通常从含有游离氨基的N末端端向含有游离羧基的C末端端报告。如果氨基酸序列代表蛋白的一级结构，那么氨基酸序列常称为肽、蛋白序列；然而必须分清术语“氨基酸序列”或“肽序列”与“蛋白”之间的差别，因为蛋白定义为折叠成特定三维构型并且通常经过翻译后修饰(如磷酸化、乙酰化、糖基化、二硫键形成、切割等等)的氨基酸序列。
[0058]应当理解，本发明不仅提供具体的肽，而且还包括这些肽的任何功能片段。“片段”组成所述氨基酸的部分或者是特定区的DNA序列。肽序列的片段比特定区短至少一个氨基酸；DNA序列的片段比特定区短至少一对碱基对。所述片段可在C端或N端侧或者两侧被截短。氨基酸片段可包含SEQ ID N0.1的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至 少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少24、至少26、至少27或至少28个氨基酸残基；SEQ ID N0.5的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少24、至少26、至少27或至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33或至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40个氨基酸；以及SEQ ID N0.9的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少
9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少24、至少26、至少27或至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33或至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、或至少46个氨基酸。
[0059]功能片段的非限制性实例可包括SEQ ID N0.13、14和15的肽，其分别为SEQ IDN0.1、5和9的肽的功能片段。更具体地，SEQ ID N0.13的肽是如SEQ ID N0.1所示的APC2肽的功能片段。在另一实施方案中，SEQ ID N0.14的肽是如SEQ ID N0.5所示的APC3肽的功能片段。还有，SEQ ID N0.15的肽是如SEQ ID N0.9所示的APC4肽的功能片段。[0060]分子的“类似物”可以是来自相同物种或来自不同物种的同源分子。类似物或衍生物的氨基酸序列可与原始序列不同，其中将至少一个残基删除、插入或取代。
[0061]更进一步，本发明关注本发明氨基酸序列的衍生物。本发明氨基酸序列的衍生物是，例如其中官能团如氨基、羟基、疏基或羧基分别被衍生，如糖基化、酰基化、酰胺化或酯化。在糖基化的衍生物中，寡糖常连接至天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸和/或赖氨酸。酰化衍生物特别通过天然存在的有机或无机酸如醋酸、磷酸或硫酸而被酰化，其通常发生在N端氨基或羟基，特别分别是酪氨酸或丝氨酸的氨基或羟基。酯类是那些天然存在的醇，如甲醇或乙醇。其它衍生物是盐、尤其是药学可接受的盐，例如金属盐如碱金属和碱土金属盐，如钠、钾、镁、钙或锌盐，或者与氨或合适的有机胺一起形成的铵盐，所述有机胺例如低级烷基胺(alkyamine),如三乙胺、羟基-低级烷基胺(hydroxy-lower alkylamine)如2_轻乙胺等等
[0062]应当理解，通过本文所用的术语“插入”，其意思是对本发明序列的氨基酸残基的任何添加，添加在I至50个之间的氨基酸残基，特别地在20至I个之间的氨基酸残基，以及更特别地在I至10个之间的氨基酸残基。最特别地，1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个氨基酸残基。此外，可使用各种相同或不同的氨基酸残基将本发明的氨基酸序列在其N末端和/或C末端延伸。
[0063]氨基酸“取代”是使用另一个具有相似结构和/或化学性质的氨基酸取代一个氨基酸的结果，即保守的氨基酸取代。基于所涉及的残基在极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性可进行氨基酸取代。例如，非极性(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和 组氨酸；以及带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
[0064]关于氨基酸序列，技术人员将认识到:在编码序列中改变、添加或删除了单个氨基酸或小百分比氨基酸的对氨基酸、核酸、肽、多肽或蛋白序列的个体取代、删除或添加，是“保守修饰的变体”，其中改变导致氨基酸被化学相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域公知的。这种保守修饰的变体除此之外，并不排除本发明的多态性变体、种间同系物以及等位基因。
[0065]例如，可进行取代，其中脂肪族氨基酸(G、A、1、L或V)被组中另一成员所取代；或者诸如一个极性残基被另一个极性残基，如精氨酸被赖氨酸、谷氨酸被天冬氨酸、或者谷氨酰胺被天冬酰胺所取代的取代。下列8组的每个都包含其它示范的氨基酸，其对另一个而言是保守的取代:
[0066]I)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
[0067]2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
[0068]3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
[0069]4)精氨酸(R)、赖氨酸⑷；
[0070]5)异亮氨酸⑴、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
[0071]6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)；
[0072]7)丝氨酸(S)、苏氨酸⑴；以及
[0073]8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。[0074]保守的核酸取代是导致如上定义的保守氨基酸取代的核酸取代。
[0075]本发明的氨基酸序列的变体分别与SEQ ID N0.1、5和9所示肽中的任一个在氨基酸水平上可具有至少80%的序列相似性，常常至少85%的序列相似性，90%的序列相似性，或至少95%、96%、97%、98%或99%的序列相似性。
[0076]应理解，本发明涉及如SEQ ID N0.1、5和9所示的氨基酸序列的任何功能片段、衍生物或类似物。如本文所用，术语“功能片段”、“功能衍生物”或“功能类似物”指具有通过特定的功能分析所鉴定的生物功能或活性的氨基酸序列。更具体地，所述特定的功能分析是对本发明肽所影响的任何参数的分析，即葡萄糖耐量、血浆胰高血糖素水平、胰岛素受体表达、GLUT-4葡萄糖转运蛋白表达以及TNFa和IL-1 β的血清水平。
[0077]根据一个实施方案，本发明分离的多肽包含如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。所述多肽是类激素蛋白，在本文中也称为APC2、PRTlO或UZI#1。
[0078]在某些实施方案中，本发明的肽表达在人类白细胞和心脏中的至少一个。
[0079]“表达”在此解释为将基因转录成mRNA和/或翻译成多肽的过程。更具体地，当指在具体组织(tissue)或多组织(tissues)中肽的表达时,意思是所述转录物和/或肽以具有功能(即诱导相关作用)的显著量进行表达。
[0080]根据其它实施方案，本发明的分离多肽包含SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。所述多肽是类激素蛋白，在本文中也称为APC3、PRT9或UZI#2。
[0081]在某些实施方案中，本发明的肽表达在人类的脾脏、睾丸、小肠、结肠和肾中的至少一个。
·[0082]根据其它实施方案，本发明的分离多肽包含SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。所述多肽是类激素蛋白，在本文中也称为APC4、PRTll或UZI#3。
[0083]在某些实施方案中，本发明的肽表达在人类脾脏、睾丸、结肠、小肠、白细胞、心脏、胎盘、肝脏、肾脏和胰腺中的至少一个。
[0084]在某些实施方案中，本发明的肽可以是类激素分泌肽。
[0085]如下列实施例所示，本发明的肽能够进行下列中的至少一个:增加葡萄糖耐量、减少血浆胰高血糖素水平、增加胰岛素受体表达、增加GLUT-4葡萄糖转运蛋白表达、和减少TNFa的血清水平以及减少血清IL-1 β。
[0086]通常当使用时，术语增加、提高或增大涉及诱导在值、方法、现象或表型(指例如某些化合物的血清水平)上的增加、提高或增大。所述增加、提高或增大也可是至少约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、I1%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、约100%或甚至更多。
[0087]本文所用术语“抑制”意思是限制、阻碍、降低、减小或缩减方法、现象或表型至少约 1%-100%、约 5%-95%、约 10%-90%、约 15%_85%、约 20%_80%、约 25%_75%、约 30%_70%、约35%-65%、约40%-60%或约45%_55%。所述方法、现象或表型的限制、阻碍、降低、减小或缩减也可以是至少约 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或约 100%。
[0088]因此，在某些实施方案中，本发明的肽可有效治疗、改善、预防或推迟免疫相关疾病或代谢紊乱的发作。
[0089]在具体的实施方案中，本发明的肽有效治疗、改善、预防或推迟代谢综合征或者任何包含所述代谢综合征的病况的发作。更具体地，代谢综合征或者任何包含代谢综合征的病况可以是下列中的至少一种:异常脂蛋白血症(高甘油三酸酯血症、高胆固醇血症、低HDL胆固醇)、肥胖、NIDDM (非胰岛素依赖型糖尿病)、IGT (葡萄糖耐量受损)、血液凝固、血纤维蛋白溶解缺陷和高血压。
[0090]在其它实施方案中，本发明的肽能够在需要其的受试者中调节Thl/Th2、Th3细胞平衡。
[0091]在某些实施方案中，本发明的肽是免疫调节的。本文所用的术语“调节”或“调节的”，例如比如调节免疫反应或病况，其包括在某种条件下活性或反应相对于对照或活性或反应的正常或基线水平的增加或减小。其也可包括在通常增加或减小肽活性或反应水平的条件下维持活性或反应的水平。
[0092]在某些具体实施方案中，本发明的肽可调节Thl/Th2、Th3细胞平衡朝向抗炎性的Th2、Thl/Th3反应可特别 适用于具有不希望的非平衡促炎Thl反应的免疫相关疾病。例如，这种免疫相关疾病可以是自身免疫疾病、移植排斥病理和炎症疾病。
[0093]本发明提供具有代谢调节性质的新型肽。因此应当理解，此外本发明也涉及本发明提供的核酸序列、以及编码以上氨基酸序列的那些。
[0094]因此，在第二方面，本发明提供含有编码多肽的序列的分离核酸分子，所述多肽包含如SEQ ID N0.USEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物和类似物。
[0095]如本文所用，术语“核酸”指核苷酸的聚合物，其可以是单链或双链，其是多核苷酸如脱氧核糖核酸(DNA)和在适当情况下的核糖核酸(RNA)。应当理解，所述术语也包括由核苷酸类似物制成的RNA或DNA的等同物、类似物以及适用于所述实施方案的单链(如正义或反义)和双链多核苷酸。本文所用的术语DNA也包括cDNA，即通过反转录操作(RNA依赖的DNA聚合酶)从RNA模板产生的互补或拷贝DNA。
[0096]根据某些实施方案，本发明的分尚核酸分子，其包含如SEQ ID N0.2所不的核酸序列、或任何其衍生物、突变体、片段或同系物，所述分离核酸分子编码含有如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的多肽。所述多肽是类激素蛋白，在本文中也称为APC2、PRT10或UZI#1。
[0097]根据其它实施方案，本发明的分尚核酸分子，其包含如SEQ ID N0.6所不的核酸序列、或任何其衍生物、突变体、片段或同系物，所述分离核酸分子编码含有如SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列的多肽。所述多肽是类激素蛋白，在本文中也称为APC3、PRT9或UZI#2。[0098]根据另外的实施方案，本发明的分离核酸分子，其包含如SEQ ID N0.9所示的核酸序列、或任何其衍生物、突变体、片段或同系物，所述分离核酸分子编码含有如SEQ IDN0.10所示的氨基酸序列的多肽。所述多肽是类激素蛋白，在本文中也称为APC4、PRT11或UZI#3。
[0099]根据本发明的某些实施方案，还提供分离的核酸分子，其仅由于遗传密码的简并性而在密码子序列中区别于SEQ ID N0.2、6和10中任一个所示的核酸分子。
[0100]由于遗传密码的简并性质，很清楚多个不同的核酸序列可用于编码本发明的氨基酸序列。应当理解，可将本发明的核酸序列中包含的密码子优化(密码子优化的)以在任何具体宿主细胞中表达，优选在能够大量表达所需肽的宿主细胞中，以及最优选地以商业量表达所述肽。
[0101]术语“密码子优化的”指用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区，其指在核酸分子的基因或编码区中，密码子的改变反映宿主生物的典型密码子用法而不改变由所述DNA编码的多肽。
[0102]应当理解，本发明进一步包括本发明提供的核酸序列的任何衍生物、突变体、片段或同系物。具体地，可用于本发明方法、组合物和用途的核酸序列的类似物或同系物可包含至少一个突变、点突变、无义突变、错义突变、删除、插入或重排。
[0103]根据本发明的序列的核酸片段可包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少
6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少101、至少102、至少103、至少104或至少121个核酸、或甚至更多。
[0104]在第三方面，本发明提供核酸构建体，其包含如SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.6或SEQID N0.10中任一个所示的核酸序列、或任何其`衍生物、突变体、片段或同系物。所述构建体可选地进一步包含可操作地连接的调控元件。
[0105]如本文所用的“构建体”包括载体(vector)如质粒、病毒、噬菌体、整合DNA片段，以及其它运载体(vehicle)，其能够使DNA片段整合入宿主基因组中。
[0106]此外，本发明也提供包含根据本发明的核酸构建体的表达载体。
[0107]表达载体通常是自我复制的DNA或RNA构建体，其含有所需基因或其片段、以及可操作连接的遗传控制元件，遗传控制元件在合适的宿主细胞中被识别并影响所需基因的表达。这些控制元件能够在合适的宿主中影响表达。一般来说，遗传控制元件可包括原核启动子系统或真核启动子表达控制系统。其通常包括转录启动子、控制转录起始的可选操纵子、提高RNA表达水平的转录增强子、编码合适核糖体结合位点的序列、RNA剪接点、终止转录和翻译的序列等等。表达载体常含有允许载体不依赖宿主细胞进行复制的复制原点。
[0108]载体可额外地包括适当的限制位点、用于筛选含有载体细胞的抗生素抗性或其它标志物。质粒是最常用的载体形式，但是提供等同功能以及是或成为本领域已知的其它形式的载体也适合用于此。参见例如Pouwels等人，Cloning Vectors:a LaboratoryManual (1985 和增补)，Elsevier, N.Y.;和 Rodriquez 等人(编)Vectors: a Survey ofMolecular Cloning Vectors and their Uses, Buttersworth, Boston, Mass (1988),其以参考并入本文。
[0109]在另一方面，本发明针对使用根据本发明的表达载体所转化或转染的宿主细胞。[0110]“细胞”、“宿主细胞”或“重组宿主细胞”是本文可互换使用的术语。应理解，这样的术语不仅指具体的受试细胞，也指这种细胞的后代或可能的后代。由于突变或环境影响，某些修饰可发生在继代中，所以实际上这样的后代也许不与亲代细胞相同，但是这样的后代依然包括在本文所用术语的范围内。
[0111]如本文所用的“宿主细胞”指通过重组DNA技术使用裸DNA或表达载体构建体对其进行重组转化的细胞。抗药性或其它可选择的标志物旨在部分地促进转化体选择。此外，可选择的标志物(如抗药性标志物)的存在可用于阻止污染微生物在培养介质中繁殖。在需要诱导的表型来生存的条件下，通过培养细胞获得这种转化宿主细胞的纯培养物。
[0112]使用本文所述的表达载体转化或转染本发明的宿主细胞以表达本发明的肽。如本文所用的“转化”指这样一种过程，其中由于细胞摄取外源DNA或RNA而改变了细胞基因型，以及例如转化的细胞表达本发明肽的至少一种重组形式。术语“转染”意思是:通过核酸介导的基因转移将核酸如裸DNA或表达载体引入受体细胞。
[0113]在又一方面，本发明提供组合物，其包含至少一种分离的多肽、或编码其的核酸序列，所述分离的多肽包含如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列、以及任何其片段、衍生物或类似物。所述组合物可选地进一步包含药学可接受载体、稀释剂或赋形剂。
[0114]在各种实施方案中，包含在本发明组合物中的多肽包含如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。所述多肽是类激素蛋白，在本文中也称为APC2、PRTlO 或 UZI#1。
[0115]在一些实施方案中，包含在本发明组合物中的多肽包含如SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。所述多肽是类激素蛋白，在本文中也称为APC3、PRT9 或 UZI#2。
·[0116]在其它实施方案中，包含在本发明组合物中的多肽包含如SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。所述多肽是类激素蛋白，在本文中也称为APC4、PRTll 或 UZI#3。
[0117]如实施例所示，本发明的肽以及因此还有包含其的组合物，可导致下列中的至少一种:增强葡萄糖代谢、增加葡萄糖耐量、减少血浆胰高血糖素水平、诱导胰岛素受体表达、增加GLUT-4葡萄糖转运蛋白表达、减少TNFa的血清水平以及减少IL-1 β的血清水平。能够理解，本发明的肽和组合物赋予抗炎和代谢有利的作用。这种作用可特别适于治疗或预防免疫相关代谢疾病，例如糖尿病和与代谢综合征相关的并发症。
[0118]为利用本发明的肽和组合物的有益效果，需要适于施用的组合物。因此，在某些实施方案中，本发明的组合物是用于治疗、改善、预防或推迟代谢紊乱、心脏疾病和免疫相关疾病中至少一种的发作的药物组合物。
[0119]根据某些实施方案，本发明的药物组合物用于治疗、改善、预防或推迟代谢综合征或者任何包含代谢综合征的病况的发作。
[0120]在某些实施方案中，应注意到代谢综合征或者任何包含代谢综合征的病况可包括下列中的至少一种:异常脂蛋白血症(高甘油三酸酯血症、高胆固醇血症、低HDL胆固醇)、肥胖、NIDDM (非胰岛素依赖型糖尿病)、IGT (葡萄糖耐量受损)、血液凝固、血纤维蛋白溶解缺陷和高血压。[0121]更具体地，如本文所指“代谢紊乱”的实例是代谢综合征。所述代谢综合征特征在于在一个人中的一组代谢风险因素，包括:
[0122]腹部肥胖(在腹部和腹部周围过多的脂肪组织)；致动脉粥样硬化的血脂障碍(血脂疾病一高甘油三酸酯、低HDL胆固醇和高LDL胆固醇一其在动脉壁促进斑块积累);升高的血压；胰岛素耐受或葡萄糖耐量不良；血栓前状态(如血液中的高纤维蛋白原或纤维蛋白溶酶原激活抑制剂-1);以及促炎状态(如血液中升高的C反应蛋白)。具有代谢综合征的人处于冠状动脉性心脏疾病和其它与在动脉壁的斑块积累相关的疾病(如中风和外周血管疾病)以及2型糖尿病的增加的风险中。
[0123]如上述，代谢综合征是医学疾病的组合，当所述医学疾病一起发生时增加发展为心血管疾病和糖尿病的风险。一些研究已显示在美国的流行率据估计是人口的25%。如本文前述，对所述综合征有许多不同医学标准，但一般来说其可包括下列异常医学参数中的一种或更多种:增加的中央型肥胖、血脂障碍(例如，如高甘油三酸酯水平和/或低HDL-C水平所示)、高血压、高空腹血浆葡萄糖、微白蛋白尿和高hs-CRP水平。
[0124]还不完全了解代谢综合征的复杂通路的确切机制。病理生理学极其复杂并且仅部分得到阐明。大多数患者年长、肥胖、久坐不动并有一定程度的胰岛素耐受。压力也可以是起作用的因素。最重要的因素是重量、遗传、内分泌疾病如在生育年龄妇女中的多囊卵巢综合征、衰老和久坐不动的生活方式，即身体活动少并且过量的热量摄取。关于是否肥胖或胰岛素耐受是代谢综合征的原因或者其是更加深远的代谢紊乱的后果仍有争议。一些全身炎症的标志物包括C反应蛋白常常增加，如血纤蛋白原、白介素6 (IL - 6)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)及其它。一些已指向各种原因，包括由膳食果糖所导致的尿酸水平增加。通常将发展内脏脂肪，在此之后内脏脂肪的脂细胞(脂肪细胞)增加TNF-a的血浆水平并改变一些其它物质(如脂连素、抵抗素、PA1-1)的水平。已证明TNF-a不仅导致产生炎症细胞因子，而且可能通过与TNF-α受体相互作用触发可导致胰岛素耐受的细胞信号传导。慢性炎症有助于增加高血压、动脉粥样硬化和糖尿病的风险。
[0125]在具体的实施方案中，本发明的药物组合物适用于治疗、改善、预防或推迟II型糖尿病、I型糖尿病或任何糖尿病相`关病况的发作。世界卫生组织识别三种主要形式的糖尿病:1型、2型和妊娠糖尿病(在孕期发生)，其具有不同原因和人口分布。虽然基本上所有形式都是由于胰腺的β细胞不能产生足够的胰岛素以阻止高血糖，但是原因不同。I型糖尿病通常由于胰腺β细胞的自身免疫破坏。2型糖尿病特征在于靶组织中的胰岛素耐受，其导致需要异常高量的胰岛素，并且当β细胞不能满足这种需求时糖尿病发展。妊娠糖尿病与2型糖尿病相似之处在于其涉及胰岛素耐受、妊娠期激素可在遗传上倾向于发展成这种病况的妇女中导致胰岛素耐受。
[0126]如果所述疾病没有得到充分控制，糖尿病的急性并发症(低血糖、酮酸中毒或非酮病的高渗性昏迷)可发生。严重的长期并发症包括心血管疾病(双重风险)、慢性肾衰竭、视网膜损伤(可导致失明)、(几种类型的)神经损伤以及微血管损伤，其可导致性无能和愈合不良。伤口特别是足的愈合不良可导致可能需要截肢的坏疽。
[0127]本发明人清楚与血糖升高相关的风险也关注实施方案，其中本发明的组合物含有至少一种肽、或者编码所述肽的核酸序列、任何所述肽的组合或混合物或任何含有所述肽的组合物，所述肽包含如SEQ ID N0.1和9所示的序列、任何其片段、衍生物或类似物。这种增强葡萄糖代谢并增加葡萄糖耐量的组合物可导致血清葡萄糖水平的降低。
[0128]更具体地，所述组合物可以是用于治疗、改善、预防或推迟心脏疾病发作的药物组合物。心脏疾病是泛称，其可与术语心脏的疾病以及心血管疾病互换使用。心脏疾病指抑制心脏正常功能的任何类型疾病。更具体地，含有心脏疾病的疾病在本文包括，而不限于冠状动脉心脏病、心肌病、心血管疾病、缺血性心脏病、心力衰竭、高血压性心脏病、炎性心脏病和瓣膜性心脏病。
[0129]根据其它实施方案，所述药物组合物在需要其的受试者中调节Thl/Th2、Th3细胞平衡。
[0130]在具体的实施方案中，本发明的药物组合物用于治疗、改善、预防或推迟免疫相关疾病的发作。“免疫相关疾病”是这样一种病况，所述病况通过激活或抑制免疫系统从而与受试者的免疫系统相关，或者所述病况可通过靶向受试者中免疫反应的某种成分得以治疗、阻止或诊断，例如适应性或固有性免疫反应
[0131]免疫相关疾病的实例包括，而非限制于溃疡性结肠炎、克罗恩病、肠易激病(IBD)、斑秃、红斑狼疮、强直性脊柱炎、美尼尔氏病、抗磷脂综合征、混合性结缔组织病、自身免疫性爱迪生氏病、多发性硬化、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力、自身免疫性肝炎、寻常天疱疮、白塞氏病、恶性贫血、大疱性类天疱疮、多发性结节性动脉炎(Polyarthritisnodosa)、心肌病、多软骨炎、口炎性腹泻-皮炎、多腺体综合征、慢性疲劳综合征(CFIDS)、风湿性多肌痛、慢性炎性脱髓鞘性病、多发性肌炎和皮肌炎、慢性炎症性多发性神经病、原发性丙球蛋白血症、变应性肉芽肿综合征、原发性胆汁性肝硬化、瘢痕性类天疱疮、银屑病、CREST综合征、雷诺氏现象、冷凝集素病、瑞特综合征、风湿热、盘状红斑狼疮、类风湿关节炎、原发性混合(Essential Mixed)、冷球蛋白血症结节病、纤维肌痛、硬皮病、格雷夫斯病、干燥综合征、格林巴利综合症、僵人综合征、桥本氏甲状腺炎、高安氏动脉炎、特发性肺纤维化、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、葡萄膜炎、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、血管炎、·扁平苔藓、和白癜风。可将本文所述的组合物和递药系统施用于受试者以治疗或阻止疾病，所述疾病与关联上述疾病的异常或不希望的免疫反应相关。
[0132]应理解，本发明的药物组合物可进一步包括至少一种额外的治疗剂。
[0133]根据某些实施方案，所述治疗剂可以是免疫调节剂或代谢调节剂。更具体地，所述剂可以是抗炎剂、或者抗糖尿病剂。
[0134]术语“代谢调节剂”涉及在代谢过程情况中如糖酵解、葡萄糖异生、脂解、脂生成、氧化磷酸化、能量平衡、代谢信号传导等，在某种情况下活性或反应相对于对照或活性或反应的正常或基线水平的增加或减小。其也可包括通常在增加或减小肽活性或反应水平的情况下维持活性或反应的水平。
[0135]如上述，因为本发明的肽出人意料地显示出代谢和免疫调节作用，所以本发明还提供药物组合物，其包含至少一种分离的多肽、或编码其的核酸序列以及药学可接受载体、稀释剂或赋形剂，所述分离的多肽包含如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物或类似物。
[0136]如本文所用的短语“药物组合物”指制备一种或更多种本文所述的活性成分，以及其它化学组分，如生理上合适的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进将化合物施用于生物。[0137]如本文所用的术语“活性成分”指本发明的负责预期生物学作用的肽。应当理解，可将编码本发明肽的多核苷酸直接施用给受试者(作为药物组合物或药物组合物的部分)，在受试者中多核苷酸在靶细胞中被翻译，即基因疗法。因此，短语“活性成分”也包括这样的多核苷酸。
[0138]如本文所用的“药学可接受载体”包括任何和全部的溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂等等。这种用于药物活性物质的介质和试剂的用途是本领域公知的。除非任何常规的介质或试剂与活性成分不兼容，其在治疗组合物中的用途是预期的。
[0139]在载体与其它成分兼容以及对患者无害的意义上说，载体应是药学上和生理上可接受的。制剂包括那些适合口腔的、直肠的、鼻的、或肠道外的(包括皮下的、肌肉内的、静脉内的和真皮内)施用。所述制剂可常规地存在于单位剂型中，可通过任何药剂领域公知的方法制备。所有这样化合物的性质、可用性和来源以及施用，包括在受试者中产生所需作用所必须的有效量是本领域公知的，不需在本文进一步描述。
[0140]可适用于本发明的口服剂型的赋形剂包括，而非限制于粘合剂、充填剂、崩解剂和润滑剂。适用于药物组合物和剂型的粘合剂包括，而非限制于玉米淀粉、土豆淀粉、或其它淀粉、黄蓍胶或明胶、天然以及合成的树胶如阿拉伯胶、海藻酸钠、海藻酸、其它藻酸盐、黄蓍胶粉、瓜尔胶、纤维素和其衍生物(例如乙基纤维素、醋酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙烯基吡咯烧酮、甲基纤维素、预胶化淀粉(pro-gelatinized starch)、轻丙基甲基纤维素、微晶纤维素、以及其混合物。
[0141]适用于本文公开的药物组合物和剂型的填充剂的实例包括，而非限制于滑石、碳酸钙(例如颗粒或粉末)、微晶纤维素、粉状纤维素、dextratre (无对应中译文)、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨醇 、淀粉、预胶化淀粉、以及其混合物。本发明的药物组合物和剂型中的粘合剂或填充剂通常占所述药物组合物或剂型的约50至约99重量百分比而存在。
[0142]崩解剂可用在本发明的药物组合物以及口腔或粘膜剂型中以提供暴露于水环境时崩解的片剂。含太多崩解剂的片剂可能在储存时崩解，然而含太少的那些可能不以所需的比率或在所需情况时崩解。
[0143]因此，足量崩解剂应当用于形成本文所述的药物组合物和固体口服剂型，所述足量崩解剂是既不太多也不太少以致于不利于改变所述活性成分的释放。所用崩解剂的量基于制剂类型而变，并且其对本领域普通技术人员是容易辨别的。
[0144]可用在本发明的药物组合物以及口腔或粘膜剂型中的崩解剂包括，而非限制于琼月旨、海藻酸、碳酸钙、Primogel、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、波拉克林钾、羧甲淀粉钠、玉米、马铃薯或木薯淀粉、其它淀粉、预胶化淀粉、其它淀粉、粘土、其它藻胶、其它纤维素、树胶、以及其混合物。
[0145]可用在本发明的药物组合物和剂型中的润滑剂包括，而非限制于硬脂酸钙、硬脂酸镁或Sterote (无对应中译文)、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其它二醇、硬脂酸、月桂基硫酸钠、滑石、氢化植物油(例如花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂、及其混合物。附加的润滑剂包括，例如syloid (无对应中译文)硅胶(AER0SIL200，由Baltimore, Md的ff.R.Grace C0.制造)、合成二氧化娃的凝聚型气溶胶(由Plano, Tex的Degussa C0.销售)、CAB-0-SIL03(Boston, Mass的Cabot C0.销售的焦化二氧化硅产品)、以及其混合物。如果使用，通常以润滑剂并入药物组合物或剂型的低于约I重量百分比的量使用润滑剂。也可使用助滑剂如胶态二氧化硅。
[0146]含有本发明肽的药物组合物用于肠胃外施用、以及用于口服和局部应用，所述肠胃外施用即腹膜内(1.P)、皮下(s.c.)、肌内(1.m.)和静脉内(1.v.)施用。用于肠胃外施用的组合物一般包括肽溶液或其溶解在可接受载体，优选水性载体中的混合物。可使用各种水性载体，例如水、缓冲水、0.4%盐水、0.3%甘氨酸等等。这些溶液无菌并提出不含颗粒物质。如近似生理条件所需的，所述组合物可包含药学可接受的辅助物质，例如PH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠。本发明肽在这些制剂中的浓度可广泛地变化，即按重量从少于约0.01%、通常至少约0.1%至多达5%，依照所选施用的具体模式，主要基于流体量和粘性进行选择。
[0147]更具体地，包括本发明肽的可注射组合物可制备在水、盐水、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、柠檬酸盐缓冲盐水等等中，并且可以可选择地与非毒性表面活性剂相混合。在普通的储存和使用条件下，这些制备可含有防腐剂以防止微生物生长。适合注射或输注的药物剂型包括无菌、水溶液或分散剂或含有活性成分的无菌粉末，其粉末适合临时制备无菌可注射或可输注(infusible)溶液或分散剂。优选地，最终剂型是无菌液体且在制造和储存条件下稳定。所述溶液、悬浮液或分散液(dispersion)的液体载体或运载体可以是溶剂或液体分散介质，包括例如水、乙醇、如甘油、丙二醇、或液态聚乙二醇等的多元醇、植物油、无毒甘油酯、以及其适合的混合物。例如，通过形成脂质体、或在分散液的情况下通过保持所需颗粒尺寸、或者通过使用无毒表面活性剂来保持溶液、悬浮液或分散液的适当流动性。通过各种抗菌和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等可以实现预防微生物的作用。可包括等渗剂，如糖、缓冲液、或氯化钠。通过在所述组合物中包括延缓吸收的试剂，如单硬脂酸铝水凝胶和明胶，可以带来可注射组合物的延迟吸收。可加入溶解性增强剂。
[0148]通过将所需量的本发明的肽并入具有如上列举的各种其它成分的适当溶剂中、接着根据需要通过灭菌如过滤灭菌来制备无菌可注射组合物。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法包括真空干燥和冻干技术，其产生活性成分的粉末加上在预先无菌过滤的溶液中存在的任何·附加所需成分。可采用任何合适的灭菌方法，例如过滤灭菌如0.22微米过滤器或纳米过滤，伽马或电子束灭菌。
[0149]在各种实施方案中，将最终溶液调节至具有在约4和约9之间、在约5和约7之间、在约5.5和约6.5之间、或约6的pH。使用药学可接受的酸、碱或缓冲液调节所述组合物的pH。
[0150]更进一步，本发明的组合物可存在于每剂量含有预定量的各种活性成分的单位剂型中。这样的单位可适于提供0.l-100mg/Kg体重的本发明的肽。具体地，或0.1-1Omg/Kg、5_15mg/Kg、10-30mg/Kg、25-50mg/Kg、40-80mg/Kg 或 60-100mg/Kg。更具体地，所述有效剂量是约0.01至约100mg/Kg的肽、约0.1至约90mg/Kg、约0.3至约8mg/Kg、约0.4至约70mg/Kg、约 0.5 至约 60mg/Kg、约 0.7 至约 50mg/Kg、约 0.8 至约 40mg/Kg、约 0.9 至约 30mg/Kg、约I至约20mg/Kg,特别地约I至约10mg/Kg。这样的剂量可以以单一剂量或者作为一些离散的剂量提供。当然，最终剂量将取决于待治疗的疾病、施用途径、以及患者的年龄、体重和情况，最终剂量将由医生决定。[0151]如上述，除肠胃外途径之外，本发明的组合物可适于通过任何其它适当途径施用，例如通过口服(包括口腔或舌下)、直肠、鼻、局部(包括口腔、舌下或经皮)或阴道途径。通过在药剂领域任何已知的方法，例如将所述活性成分与载体或赋形剂联合可制备这样的制剂。
[0152]适合口服施用的药物制剂可作为离散的单元存在，例如作为胶囊或片剂、粉末或颗粒、在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、可食用泡沫或搅拌品(whip )、或水包油液体乳剂、或油包水液体乳剂。
[0153]适合经皮施用的药物制剂可作为离散的贴剂(patch)存在，所述离散贴剂意欲在延长的时间中保持与受试者表皮的紧密接触。
[0154]适合局部施用的药物制剂可配制为软膏、霜剂、悬浮液、洗剂、粉剂、溶液、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。
[0155]为应用至眼睛或其它外部组织如口和皮肤，所述制剂优选作为局部软膏或霜剂应用。当所述活性成分配制在软膏中时，其可与石蜡或与水混溶的软膏基质一起采用。可选择地，所述活性成分可与水包油霜剂基质或油包水基质一起配制在霜剂中。
[0156]适合局部施用至眼睛的药物制剂包括滴眼剂，其中所述活性成分溶解或悬浮在合适的载体、特别是水性溶剂中。
[0157]适合局部施用在口中的药物制剂包括糖锭、锭剂(pastilles)和漱口水。
[0158]适合局部施用至皮肤的药物制剂包括软膏、霜剂、悬浮剂、糊剂、洗剂、粉剂、溶液、油剂、包囊凝胶、含 本发明肽的脂质体、任何含所述肽的纳米粒子、或含所述肽的可喷气雾剂或吸入剂。常规药物载体，水性、粉或油性基质，增稠剂等等可以是必须或根据需要。术语“局部应用”或“局部施用”意为将软膏、霜剂、润肤齐?、香膏、洗齐?、溶液、油膏(salve)、软膏(unguent)、或任何其它药物形式应用到一些或全部的患者皮肤的皮肤部分,所述患者皮肤正在、或曾经被、或显示或曾显示待治疗病况中一种或多种症状的影响，例如糖尿病相关的皮肤损伤。
[0159]在某些实施方案中，用于治疗皮肤疾病、特别是糖尿病相关皮肤溃疡的本发明肽的施用可通过局部敷料进行。术语“敷料”意为伤口或手术位点的覆盖物，通常包括布、织物、合成膜、纱布或等等。通常是含聚合物的基质覆盖一块区域的皮肤。敷料可或不可与皮肤紧密接触。其可以是，例如布或纱布，或者其可以是印或喷涂在皮肤上的聚合物溶液，当溶剂干燥时和/或当聚合物交联时所述聚合物在皮肤上固化。敷料也包括凝胶，通常是交联水凝胶，其主要意欲覆盖和保护伤口、手术位点等等。
[0160]适合直肠施用的药物制剂可作为栓剂或灌肠剂存在。
[0161 ] 适合鼻施用的药物制剂，其中所述载体是包含具有如在20至500微米范围内的颗粒尺寸的粗粉的固体，其以吸鼻烟的方式施用，即从紧挨鼻子的所述粉末容器中通过鼻通道快速吸入。合适的制剂包括水性或油性的所述活性成分的溶液，所述合适的制剂中所述载体是液体，其作为喷鼻剂或滴鼻剂施用。
[0162]适合通过吸入施用的药物制剂包括细粒粉尘或雾，其可通过各种类型的计量剂量的加压气溶胶、喷雾器或吹入器的方法生成。
[0163]适合阴道施用的药物制剂可作为阴道栓剂、棉塞、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷
雾制剂存在。[0164]优选的单位剂量制剂是那些如本文上述的含有活性成分的每日、每两周、每周、每几周或每月剂量或亚剂量、或其适当部分。
[0165]应理解，除以上特别提到的成分，考虑到所讨论的制剂类型，所述制剂还可包含其它本领域常规试剂，例如适合口服施用的那些可包括调味剂。
[0166]在另一个方面，本发明提供用于治疗、改善、预防或推迟代谢紊乱和免疫相关疾病中至少一种的发作的方法。所述方法包括步骤:向需要其的受试者施用治疗有效量的至少一种分离多肽、编码其的核酸序列、任何其组合或混合物、或含有其的任何组合物，所述分离多肽包含如SEQ ID N0.USEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
[0167]如本文和权利要求所用的术语“治疗”和“改善”意思是在患有病理疾病的患者中改善一种或更多种疾病活性的临床指标。“治疗”指治疗性处理。需要治疗的那些是患有代谢或炎症疾病的哺乳动物受试者。“患者”或“有需要的受试者”意为任何哺乳动物，为阻止、克服或减缓这种痛苦(infliction)需要对哺乳动物施用本发明肽或本发明的任何药物组合物。也可施用本发明肽和组合物以延缓疾病的发作，也就是说本发明肽和组合物推迟疾病恶化或者使其进展减缓以使得疾病的临床表征相对于没有治疗出现得更迟。
[0168]以保护的方式来提供“预防处理”或“预防性处理”以抵御或防止某些事，特别是病况或疾病。
[0169]为实现这些治疗目标，必须向患有所述疾病的受试者施用治疗有效量的本发明组合物或肽。术语“有效量”或“足够量”意思是实现所选结果所必须的量。“有效治疗量”取决于疾病的严重性连同预防或治疗目标、施用途径以及患者的一般情况(年龄、性别、体重以及其它主治医生已知的考虑)。
[0170]如本文所用，术语“疾病/紊乱(disorder)”指存在正常功能的干扰的情况。“疾病(disease)”是身体或心灵·的任何异常情况，其导致受影响的人或接触他们的人不适、机能障碍、或悲痛。有时，所述术语广泛使用以包括受伤、残疾、综合征、症状、偏差行为、以及结构和功能的非典型变化，然而在其它背景中这些可被视作可区别开的分类。应注意的是，术语“疾病”、“紊乱”、“病况”和“病”在本文中等同使用。
[0171]本发明涉及治疗需要其的受试者或患者。“患者”或“有需要的受试者”意思是可被上述病况所影响、以及需要本文所述的治疗方法的任何生物，其包括人类、驯养和非驯养的哺乳动物如犬和猫受试者、牛、猴、马和鼠受试者、啮齿动物、家禽、水产养殖、鱼和异国水族鱼。应当理解，治疗的受试者也可以是任何爬行类或动物园动物。更特别地，本发明的方法和组合物旨在哺乳动物。“哺乳动物受试者”意思是需要建议疗法的任何哺乳动物，包括人类、马、犬和猫受试者，最特别地是人。应注意到，具体在非人类受试者的情况下，可使用经注射、饮水、喂饲、喷雾、口腔喂食的施用和直接进入需要其的受试者的消化道来执行本发明的方法。还应注意到，具体在对人类受试的情况下，对患者施用本发明的组合物包括自行施用和经他人施用给患者。
[0172]术语“治疗有效量”意欲指引发组织、系统、动物或人类的生物学或医学反应的药物量或药剂量，其为研究人员、兽医、医师或其它临床医生所寻找。
[0173]根据本发明方法的一个实施方案，所施用的多肽包含如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。[0174]根据本发明方法的另一个实施方案，所施用的多肽包含如SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
[0175]根据本发明方法的又一个实施方案，所施用的多肽包含如SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
[0176]在某些实施方案中，本发明的方法可导致下列中至少一种:增强葡萄糖代谢、增加葡萄糖耐量、减少血浆胰高血糖素水平、诱导胰岛素受体表达、增加GLUT-4葡萄糖转运蛋白表达、减少TNFa的血清水平以及减少IL-1 β的血清水平。
[0177]所施用的肽的净效应是抗炎症和抗糖尿病。
[0178]事实上，本发明方法可特别适合用于治疗、改善、预防或推迟代谢综合征或任何含有代谢综合征的病况的发作。
[0179]在某些实施方案中，应注意到代谢综合征或任何含有代谢综合征的病况可以是下列中的至少一种:异常脂蛋白血症(高甘油三酸酯血症、高胆固醇血症、低HDL胆固醇)、肥胖、NIDDM (非胰岛素依赖型糖尿病)、IGT (葡萄糖耐量受损)、血液凝固、血纤维蛋白溶解缺陷和高血压。
[0180]更具体地，本发明的方法可用于治疗、改善、预防或推迟II型糖尿病、I型糖尿病或任何糖尿病相关病况的发作。
[0181]在一个实施方案中，本发明的方法包括施用治疗有效量的至少一种肽，或编码其的核酸序列、任何其组合或混合物、或含有其的任何组合物，所述肽包含如SEQ ID N0.1和9所示的序列、任何其片段、衍生物或类似物。在增强葡萄糖代谢和提高葡萄糖耐量中有效的这种方法可导致血清葡萄糖水平的降低。
[0182]应注意到，在本文中也称`为APC2和APC4的这些肽在本发明中显示通过心脏组织表达。此外，本发明的肽显示下调葡萄糖水平。因为与心脏发作后不良预后相关的主要风险因子是高葡萄糖水平，使用本发明肽可以使心脏发作后的保护成为可能。因此，在更多具体实施方案中，本发明提供可适用于治疗、改善、预防或推迟心脏疾病、特别是心脏发作的发作的方法。
[0183]在某些实施方案中，所述方法在需要其的受试者中调节Thl/Th2、Th3细胞平衡。
[0184]因此，所述方法可适用于治疗、改善、预防或推迟免疫相关疾病的发作。
[0185]在某些具体实施方案中，本发明的肽可调节Thl/Th2、Th3细胞平衡朝向抗炎性的Th2反应。Thl/Th3反应可特别适用于具有不希望的非平衡促炎Thl反应的免疫相关疾病。例如，这种免疫相关疾病可以是自身免疫疾病、移植排斥病理学和炎症疾病。
[0186]在一个实施方案中，本发明的方法还包括施用至少一种额外治疗剂的步骤。
[0187]额外治疗剂可以是任何抗炎剂，包括NSAID和留体剂、或是任何抗糖尿病剂。
[0188]在另一方面，本发明针对至少一种分离多肽、或编码其的核酸序列在制备组合物中的用途，所述分离多肽含有如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物或类似物。所述组合物适用于治疗、改善、预防或推迟代谢紊乱和免疫相关疾病中至少一种的发作。
[0189]根据各种实施方案，在制备所述组合物中所用的多肽包含如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
[0190]根据一些实施方案，在制备所述组合物中所用的多肽包含如SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
[0191]根据某些实施方案，在制备所述组合物中所用的多肽包含如SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
[0192]如实施例所示，使用本发明的多肽所制备的组合物可导致下列中的至少一种:增强葡萄糖代谢、增加葡萄糖耐量、减少血浆胰高血糖素水平、诱导胰岛素受体表达、增加GLUT-4葡萄糖转运蛋白表达、减少TNFa的血清水平以及减少IL-1 β的血清水平。
[0193]根据具体实施方案，使用本发明的多肽所制备的组合物用于治疗、改善、预防或推迟代谢综合征或者任何包含代谢综合征的病况的发作。
[0194]在某些实施方案中，应注意到代谢综合征或任何含有代谢综合征的病况可以是下列中的至少一种:异常脂蛋白血症(高甘油三酸酯血症、高胆固醇血症、低HDL胆固醇)、肥胖、NIDDM (非胰岛素依赖型糖尿病)、IGT (葡萄糖耐量受损)、血液凝固、血纤维蛋白溶解缺陷和高血压。
[0195]在具体的实施方案中，使用本发明的多肽所制备的组合物用于治疗、改善、预防或推迟II型糖尿病、I型糖尿病或任何糖尿病相关病况的发作。
[0196]因此，在很多实施方案中，本发明的用途在于至少一种本发明所用的肽、或编码所述肽的核酸序列、任何所述肽的组合或混合物、或含有所述肽的任何组合物用于制备组合物，其中所述肽可包含如SEQ ID N0.1和9所示的氨基酸序列(分别对应肽APC2和APC4)、任何其片段、衍生物或类似物。增强葡萄糖代谢和增加葡萄糖耐量的这种组合物可导致血清葡萄糖水平的降低。应注意，本发明还包括本发明任何肽的功能片段的用途。功能片段的非限制性实例可包括SEQ ID N0.13、14和15的肽，其分别是SEQ ID N0.1、5和9的肽的功能片段。
[0197]更具体地，根据某些·实施方案，根据本发明的用途制备的组合物可有效作为药物组合物用于治疗、改善、预防或推迟心脏疾病的发作。
[0198]在其它实施方案中，使用本发明的多肽制备的组合物在需要其的受试者中调节Thl/Th2、Th3细胞平衡。
[0199]根据一个实施方案，使用本发明的多肽制备的组合物用于治疗、改善、预防或推迟免疫相关疾病的发作。
[0200]在某些具体实施方案中，本发明的肽可调节Thl/Th2、Th3细胞平衡朝向抗炎Th2、Thl/Th3反应可特别适用于具有不希望的非平衡促炎Thl反应的免疫相关疾病。例如，这种免疫相关疾病可以是自身免疫疾病、移植排斥病理和炎症疾病。
[0201]根据各种实施方案，使用本发明的多肽制备的组合物可进一步包括至少一种额外治疗剂。
[0202]在还一方面，本发明提供分离的多肽，其用于治疗、改善、预防或推迟免疫相关疾病和代谢紊乱中至少一种的发作。所述多肽包含如SEQ ID N0.K SEQ ID N0.5或SEQ IDN0.9中任一个所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
[0203]本发明也提供方法，所述方法用于增强葡萄糖代谢、增加葡萄糖耐量、减少血浆胰高血糖素水平、诱导胰岛素受体表达、增加GLUT-4葡萄糖转运蛋白表达、减少TNFa的血清水平以及减少IL-1 β的血清水平中的至少一种，所述方法包括如下步骤:向需要其的受试者施用治疗有效量的至少一种分离多肽、编码其的核酸序列、任何其组合或混合物或者包含其的任何组合物，所述分离多肽含有如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
[0204]在具体实施方案中，所述方法用于增强葡萄糖代谢。
[0205]在另一具体实施方案中，所述方法用于增加葡萄糖耐量。
[0206]在又一实施方案中，所述方法用于增加GLUT-4葡萄糖转运蛋白表达。
[0207]在再一实施方案中，所述方法用于减少TNFa的血清水平。
[0208]在还一实施方案中，所述方法用于减少IL-1 β的血清水平。
[0209]如公开和描述的，应理解本发明不限于本文公开的具体实施例、方法步骤和组合物，因为这样的方法步骤和组合物可有些变化。也应理解，因为本发明的范围将只通过随附权利要求和其等同物加以限制，所以本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的而不意图限制。
[0210]必须注意，除非上下文另外清楚指出，在本说明书和随附权利要求中所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数对象。
[0211]通过本说明书以及其后的实施例和权利要求，除非上下文另外需要，词语“包含(comprise)”以及变体如“包括(comprises)”和“含有(comprising)”将理解为暗示包括所述整数或步骤或一组整数或步骤，但是不排除任何其它整数或步骤或一组整数或步骤。
[0212]下列实施例代表本发明人在实施本发明方面时所采用的技术。应理解，虽然这些技术是用于本发明实施的优选实施方案的示例，本领域技术人员根据本公开将认识到可进行许多修改而不离开本发明的精神和预期范围。
·[0213]实施例
[0214]MM
[0215]D(-)甘露醇(Prod: 291484B，BDH 实验室供应)
[0216]PCR 装置(MyCycle, BioRad, CA,美国)
[0217]TNFa 和 IL-1 β ELISA(BioPlex Pro-小鼠糖尿病试剂盒 cat#: 171-F7001M 和小
[0218]鼠 Thl/Th2 试剂盒 cat#: 171-F7001M, BioRad, CA,美国)
[0219]血糖仪(Accucheck,Roche)
[0220]RNA-Save (cat#: 01-891-1B，Biological Industries,以色列).[0221]RNeasy mini 试剂盒(cat#:74106，Qiagen)用于 RT-PCR 的 EZ 第一链 cDNA 合
[0222]成的试剂盒(cat#:20-800-50，BiologicalIndustries,以色列)
[0223]GoTaq Green Master Mix(Cat#M7122, Promega)
[0224]PBS (目录号 02-023-5A，Biological industries)
[0225]Maxisorp96 孔板(目录号 4424O4, NUNC, F96Maxisorp).[0226]Tff-20 (目录号 0777-1L, Amresco)
[0227]BSA (目录号 160069，MP biomedicals,)
[0228]羊抗兔HRP缀合抗体(目录号7074，Cell signaling)
[0229]TMB (3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺，辣根过氧化物酶底物，目录号ES001-500ML，
[0230]Millipore)
[0231 ] H2SO4 (目录号 5552540，Frutarom)
[0232] 方法[0233]分子生物学通用方法
[0234]因为一些分子生物学领域的方法是本领域技术人员所公知的，所以不在本文详述。这样的方法包括PCR、cDNA表达、人类细胞的转染等等。描述这样方法的教科书是，例如 Sambrook 等人(1989)Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, ISBN:0879693096;F.M.Ausubel (1988)Current Protocols in MolecularBiology, ISBN:047150338X, John Wiley&Sons, Inc。此外，因为一些免疫学技术是本领域技术人员所公知的，所以不在本文所述的每个例子中详述，例如Western印迹。参见，例如 Harlow 和 Lane(1988)Antibodies:a laboratory manual, Cold Spring HarborLaboratory。
[0235]动物和治疗方案
[0236]从Harlan Biotech (耶路撒冷，以色列)购买20只7周龄C57B1/6雄性小鼠(每个实验)。所有小鼠都在公司设施的动物设施房间里饲养。给予小鼠标准实验采食和任意的饮水，并保持12小时光/暗循环。依照以色列当局对动物实验的《Care and Use ofLaboratory Animals))指南以及经过当局具体审批进行全部动物实验。
[0237]ELISA通用规程
[0238]通过使用与易于分析的酶相偶联的抗体或抗原，酶联免疫吸附分析(ELISA)将抗体的特异性与简单的酶敏感性分析相结合。ELISA可提供抗原或抗体浓度的有用测量。ELISA是五步程序:1)用稀释在PBS中的抗原包被微量滴定板的孔，在4°C孵育并洗涤；2)用BSA/FCS封闭所有未结合的位点以阻止假阳性结果，在PBS中孵育I小时，并洗涤；3)将抗体加至孔中，孵育I小时并洗涤；4)加入与酶缀合的抗人类IgG，孵育I小时并洗涤；5)使底物与酶反应以产生有色产物，因此表明阳性反应。
[0239]FACS 规程`
[0240]洗涤细胞，在冰冷的PBS、10%FCS、1%叠氮化钠中将悬浮液调至1_5χ106细胞/ml的浓度。加入0.1-10 μ g/ml的一级标记的抗体。如果必要，在3%BSA/PBS中制备稀释液。在室温或4°C孵育悬浮液至少30分钟,然后通过在400g离心5分钟并重悬于500 μ I至Iml的冰冷PBS、10%FCS、1%叠氮化钠中洗涤细胞3次。使用流式细胞仪分析细胞。
[0241]ELISA 程序
[0242]通过将标准蛋白在PBS中进行系列稀释制备2000pg/ml至31pg/ml的校正曲线。在37°C浴中迅速解冻样本。70 μ I —式两份的每个血液样本(未稀释)和70 μ I —式三份的标准样本上样于Maxisorp96孔板中，并在4°C摇动孵育过夜。随后移除液体并使用多头移液器用PBS中的300 μ 10.05%Tff-20洗涤板4次。为封闭，在每个孔中上样300 μ I的封闭缓冲液(在PBS中的5%BSA)，在室温摇动孵育板I小时。随后移除液体并使用多头移液器用PBS中的300 μ 10.05%Tff-20洗涤板4次。为检测，将特异性抗体在稀释剂中(在PBS中
0.05%Tff-20, 0.1%BSA)按1:250稀释，在每个孔中上样100 μ I的检测抗体，并在室温摇动孵育2小时。随后移除液体并使用多头移液器用PBS中的300 μ 10.05%Tff-20洗涤板4次。将羊抗兔HRP缀合抗体在稀释剂中按1:200稀释，在每孔中上样100 μ I的HRP缀合物，并在室温摇动孵育30分钟。随后移除液体并使用多头移液器用PBS中的300 μ 10.05%Tff-20洗涤板5次。为显色，将100 μ I的TMB (3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺，辣根过氧化物酶底物)加至每孔，并孵育直至蓝色显色。为终止显色，加入50 μ 12Ν H2S04。在微量板阅读器中在450nm处确定吸光度。
[0243]葡萄糖耐量实验
[0244]在实验的末期(两周)进行葡萄糖耐量实验(GTT)。在实验施用前，使小鼠饥饿过夜。腹膜内注射葡萄糖(1.P.) (2g/Kg体重)，在时间点O分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟测量血液葡萄糖水平。通过使用标准血糖仪取样尾静脉血，确定血液葡萄糖。
[0245]血浆胰高血糖素分析
[0246]刺破小鼠尾静脉，使用标准血糖仪分析血液葡萄糖。
[0247]胰岛素受体和GLUT-4PCR分析
[0248]处死小鼠并解剖。取15_20mg合适组织并将其稳定在RNA-Save中。使用RNeasy小量试剂盒从所述组织中提取RNA。使用22G的针和注射器进行均化。为RT-PCR，使用EZ第一链cDNA合成试剂盒从所述RNA中制备cDNA。使用GoTaq Green Master Mix并使用适当的引物(40循环，退火温度:62°C)进行样本的PCR。
[0249]血清TNF α和IL-1 β分析
[0250]从每只小鼠中抽血并分别收集在1.5ml管中。在室温中30分钟至I小时后，在4°C以300G离心凝结的血15分钟。将上清收集在新的1.5ml管中，并在300G再次离心15分钟。将上清收集在新的1.5ml管中，并在-70°C冰冻用于后续分析。当用于分析时，所述血液管在室温下在水浴中迅速解冻，随后在4°C以13，000G离心10分钟。根据Bio-Plex Pro分析说明手册使用平 底的黑色板来分析样本。
[0251 ]反转录酶 PCR (RT-PCR)
[0252]为建立分离的新型蛋白的表达模式，在各种组织中进行RT-PCR。应用的PCR条件是95°C下2分钟，接着40个循环:95°C下45秒、59°C下45秒以及72°C下5分钟，并具有72 °C下5分钟的末循环。
[0253]实施例1
[0254]分离APC_2cDNA
[0255]具有如SEQ ID N0.2所示的序列的cDNA，其编码肽APC_2(具有如SEQ ID N0.1所示的序列)，使用购自Clonetech的人类cDNA文库和此处如SEQ ID N0.3和4所示的引物将其扩增。
[0256]关于APC-2肽，其在本文也命名为Uz1-1，在氨基酸位置17和18之间确定p=0.760的最大切割位点可能性。
[0257]将PCR的产物测序。在琼脂糖凝胶上分析PCR产物，并使用CyberGreen (Invitrogene)染色,使用BioRad ChemiDoc分析仪评估PCR产物的强度。结果表明APC-2在人类心脏和淋巴细胞中表达。
[0258]实施例2
[0259]APC-2改善葡萄糖耐量
[0260]将雄性C57B1/6小鼠分成4组，每组5只小鼠。对照组(组I)接受5%甘露醇IV(一周3次，每次200 μ L)。组II接受一周3次的APC2(0.25mg/Kg体重)剂量。组III接受一周3次的APC2 (1.5mg/Kg体重)剂量。组IV接受一周3次的APC2 (15mg/Kg体重)剂量。将小鼠治疗2周。[0261]在实验的末期，如方法部分所述施用葡萄糖耐量实验(GTT)。在图1中显示GTT的结果。可以清楚看到，APC-2以剂量依赖方式改善葡萄糖耐量，其中对1.5mg/Kg体重的APC2剂量观察到最优反应。
[0262]实施例3
[0263]APC-2减少血浆胰高血糖素
[0264]除GTT之外，如方法部分所述分析小鼠血浆胰高血糖素水平。如图2所示，通过APC-2以剂量依赖的方式减少血浆胰高血糖素水平。
[0265]实施例4
[0266]APC-2在脾细胞中增加胰岛素受体和GLUT-4表达
[0267]在实验的末期，处死小鼠，从不同小鼠组中收集脾细胞，并分析HPRT (对照)、胰岛素受体和GLUT4的RNA水平。在图3A-3C中呈现这些Northern印迹分析的结果。如所示，在使用APC-2处理的小鼠中，胰岛素受体和GLUT4两者以剂量依赖的方式得以上调，其中在使用1.5mg/Kg体重处理的小鼠中观察到最大诱导。
[0268]通过实施例1-4显示的结果清楚地表明使用本发明的APC-2肽在治疗葡萄糖代谢相关疾病上的可行性。
[0269]实施例5
[0270]分离APC_3cDNA
[0271]具有如SEQ ID N0.6所示的`序列且编码肽APC-3 (具有如SEQ ID N0.5所示的序列)的cDNA，使用购自Clonetech的人类cDNA文库和此处如SEQ ID N0.7和8所示的引物将其扩增。
[0272]关于APC-3肽，其在本文也命名为Uz1-2，在氨基酸位置18和19之间确定p=0.544的最大切割位点可能性。
[0273]将PCR产物测序。在琼脂糖凝胶上分析PCR产物，并使用CyberGreen (Invitrogene)染色,使用BioRad ChemiDoc分析仪评估PCR产物的强度。结果表明APC-3在人类脾脏、睾丸、小肠、结肠和肾脏中表达。
[0274]实施例6
[0275]APC-3 减少 TNF α 和 IL-1 β
[0276]将雄性C57B1/6小鼠分成4组，每组5只小鼠。对照组(组I)接受5%甘露醇IV(一周3次，每次200 μ L)。组II接受一周3次的APC3(0.25mg/Kg体重)剂量。组III接受一周3次的APC3 (1.5mg/Kg体重)剂量。组IV接受一周3次的APC3 (15mg/Kg体重)剂量。将小鼠治疗2周。
[0277]在实验的末期，在小鼠血浆中测量TNFa和IL_1 β，结果分别显示在图4A和4B中。可以清楚看到，APC-3以剂量依赖方式都减少了炎性细胞因子的水平，其中对1.5mg/Kg体重的APC3剂量观察到最优反应。
[0278]因此，很明显地APC3可下调促炎细胞因子(体现在可观察到的血清IL-1 β和TNF-a减少上)，因为熟知高IL-1 β与糖尿病相关，所以APC3可用于治疗自身免疫疾病尤其是糖尿病。
[0279]实施例7
[0280]分离APC_4cDNA[0281]具有如SEQ ID N0.10所示的序列且编码肽APC_4(具有如SEQ ID N0.9所示的序列)的cDNA，使用购自Clonetech的人类cDNA文库和此处如SEQ ID N0.11和12所示的引物将其扩增。
[0282]关于APC-4肽，其在本文也命名为Uz1-3，在氨基酸位置20和21之间确定p=0.731的最大切割位点可能性。
[0283]将PCR产物测序。在琼脂糖凝胶上分析PCR产物，并使用CyberGreen (Invitrogene)染色,使用BioRad ChemiDoc分析仪评估PCR产物的强度。结果表明APC-4在人类脾脏、睾丸、结肠·、小肠、白细胞、心脏、胎盘、肝脏、肾脏和胰腺中表达。
【权利要求】
1.一种分离的多肽，其包含如SEQ ID N0.USEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列、及任何其片段、衍生物或类似物。
2.根据权利要求1所述的分离的多肽，其包含如SEQID N0.1所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
3.根据权利要求1所述的分离的多肽，其包含如SEQID N0.5所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
4.根据权利要求1所述的分离的多肽，其包含如SEQID N0.9所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
5.一种含有编码多肽的序列的分离的核酸分子，所述多肽包含如SEQ ID N0.USEQ IDN0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列、以及任何其片段、衍生物和类似物。
6.根据权利要求5所述的分尚的核酸分子,其包含如SEQID N0.2所不的核酸序列或任何其衍生物、突变体、片段或同系物，其中所述核酸分子编码含有如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的多肽。
7.根据权利要求5所述的分尚的核酸分子,其包含如SEQID N0.6所不的核酸序列或任何其衍生物、突变体、片段或同系物，其中所述核酸分子编码含有如SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列的多肽。
8.根据权利要求5所述的分尚的核酸分子,其包含如SEQID N0.9所不的核酸序列或任何其衍生物、突变体、片段或同系物，其中所述核酸分子编码含有如SEQ ID N0.10所示的氨基酸序列的多肽。
9.一种包含如SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.10中任一个所示的核酸序列、或任何其衍生物、突变体、片·段或同系物的核酸构建体，其中构建体可选地进一步包含可操作连接的调控元件。
10.一种包含根据权利要求9所述的核酸构建体的表达载体。
11.一种转化或转染有根据权利要求10所述的表达载体的宿主细胞。
12.—种含有至少一种分离的多肽、或编码所述分离的多肽的核酸序列的组合物，所述分离的多肽包含如SEQ ID N0.USEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物或类似物，所述组合物可选地进一步包括药学可接受载体、稀释剂或赋形剂。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述的多肽包含如SEQID N0.1所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
14.根据权利要求12所述的组合物，其中所述的多肽包含如SEQID N0.5所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
15.根据权利要求12所述的组合物，其中所述的多肽包含如SEQID N0.9所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
16.根据权利要求12至15任一项所述的组合物，其中所述组合物导致下列中至少一种:增强葡萄糖代谢、增加葡萄糖耐量、减少血浆胰高血糖素水平、诱导胰岛素受体表达、增加GLUT-4葡萄糖转运蛋白表达、减少TNFa的血清水平以及减少IL-1 β的血清水平。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物是用于治疗、改善、预防或推迟代谢紊乱和免疫相关疾病中至少一种的发作的药物组合物。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述组合物用于治疗、改善、预防或推迟代谢综合征或者包含所述代谢综合征的任何病况的发作。
19.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述组合物用于治疗、改善、预防或推迟II型糖尿病、I型糖尿病或任何糖尿病相关病况的发作。
20.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述多肽包含如SEQID N0.1和9中任一个所示的氨基酸序列，以及其中所述的增强葡萄糖代谢和增加葡萄糖耐量导致血清葡萄糖水平降低。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述组合物是用于治疗、改善、预防或推迟心脏疾病的发作的药物组合物。
22.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述组合物在有需要的受试者中调节Thl/Th2、Th3细胞平衡。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述组合物用于治疗、改善、预防或推迟免疫相关疾病的发作。
24.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述组合物进一步包括至少一种额外的治疗剂。
25.一种用于治疗、改善、预防或推迟代谢紊乱和免疫相关疾病中至少一种的发作的方法，所述方法包括如下步骤:向有需要的受试者施用治疗有效量的至少一种分离的多肽、编码所述分离的多肽的核酸序列、任何所述分离的多肽的组合或混合物或者含有所述分离的多肽的任何组合物，所述分离的多肽包含如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述多肽包含如SEQID N0.1所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或 类似物。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述多肽包含如SEQID N0.5所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述多肽包含如SEQID N0.9所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的方法，其中所述方法导致下列中的至少一种:增强葡萄糖代谢、增加葡萄糖耐量、减少血浆胰高血糖素水平、诱导胰岛素受体表达、增加GLUT-4葡萄糖转运蛋白表达、减少TNF α的血清水平以及减少IL-1 β的血清水平。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，用于治疗、改善、预防或推迟代谢综合征或者任何包含所述代谢综合征的病况的发作。
31.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，用于治疗、改善、预防或推迟II型糖尿病、I型糖尿病或任何糖尿病相关病况的发作。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述多肽包含如SEQID N0.1和9中任一个所示的氨基酸序列，以及其中所述的增强葡萄糖代谢和增加葡萄糖耐量导致血清葡萄糖水平降低。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述方法用于治疗、改善、预防或推迟心脏疾病的发作。
34.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述方法在有需要的受试者中调节Thl/Th2、Th3细胞平衡。
35.根据权利要求34所述的方法，用于治疗、改善、预防或推迟免疫相关疾病的发作。
36.根据权利要求25至35中任一项所述的方法，进一步包括施用至少一种额外的治疗剂的步骤。
37.至少一种分离的多肽、或编码所述分离的多肽的核酸序列在制备用于治疗、改善、预防或推迟代谢紊乱和免疫相关疾病中至少一种的发作的组合物中的用途，所述分离的多肽含有如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列、以及任何其片段、衍生物或类似物。
38.根据权利要求37所述的用途，其中所述多肽包含如SEQID N0.1所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
39.根据权利要求37所述的用途，其中所述多肽包含如SEQID N0.5所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
40.根据权利要求37所述的用途，其中所述多肽包含如SEQID N0.9所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
41.根据权利要求37至40中任一项所述的用途，其中所述组合物导致下列中的至少一种:增强葡萄糖代谢、增加葡萄糖耐量、减少血浆胰高血糖素水平、诱导胰岛素受体表达、增加GLUT-4葡萄糖转运蛋白表达、减少TNFa的血清水平以及减少IL-1 β的血清水平。
42.根据权利要求41所述的用途，其中所述组合物用于治疗、改善、预防或推迟代谢综合征或者任何包含所述代谢综合征的病况的发作。
43.根据权利要求41所述的用途，其中所述组合物用于治疗、改善、预防或推迟II型糖尿病、I型糖尿病或任何糖尿病相关病况`的发作。
44.根据权利要求41所述的用途，其中所述多肽包含如SEQID N0.1和9中任一个所示的氨基酸序列，以及其中所述的增强葡萄糖代谢和增加葡萄糖耐量导致血清葡萄糖水平降低。
45.根据权利要求44所述的用途，其中所述组合物是用于治疗、改善、预防或推迟心脏疾病的发作的药物组合物。
46.根据权利要求41所述的用途，其中所述组合物在有需要的受试者中调节Thl/Th2、Th3细胞平衡。
47.根据权利要求46所述的用途，其中所述组合物用于治疗、改善、预防或推迟免疫相关疾病的发作。
48.根据权利要求37所述的用途，其中所述组合物进一步包括至少一种额外的治疗剂。
49.一种用于治疗、改善、预防或推迟免疫相关疾病和代谢紊乱中至少一种发作的分离的多肽，其中所述多肽包含如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一个所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或类似物。
【文档编号】C12N15/12GK103857694SQ201280049380
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年8月6日 优先权日:2011年8月8日
【发明者】T·山德勒, O·德伟瑞 申请人:两合生物科技公司