Baff基因实时荧光pcr检测引物和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种BAFF基因实时荧光PCR检测引物，正向引物如SEQ?ID?NO.1所示；反向引物如SEQ?ID?NO.2所示；还提供给了一种利用本引物对进行BAFF基因进行荧光PCR检测的试剂盒，该试剂盒包括一种检测溶液，其检测溶液含有含SYBR?Premix?Ex?Taq(2×)、正向引物10μM、反向引物10μM、Rox?Dye。本发明采用SYBR?Green?I实时荧光PCR检测方法，对BAFF基因进行鉴定，具有检测实时性和高效性，并可以对早期BAFF基因表达进行检测，用于早期判断自身免疫性疾病。本发明采用SYBR?Green?I实时荧光PCR检测方法，对APRIL基因进行鉴定，具有检测实时性和高效性，并可以对早期APRIL基因表达进行快速检测。
【专利说明】BAFF基因实时荧光PCR检测引物和试剂盒
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及基因检测方法，尤其是涉及BAFF基因实时荧光PCR检测方法及其相关试剂盒。
【背景技术】
[0002]BAFF (B cell activation factor)，B细胞激活因子，肿瘤坏死因子家族成员，属于II跨膜蛋白，与同属于同一家族的APRIL有高度的同源性，在结构上两者是通过不同的D-E环结合它们共同受体，从而导致不同亲和。经蛋白酶水解形成可溶性[16]，可溶性BAFF在血清中主要是以三聚体的形式存在[M.Cao，P.Cao，H.Yanet al.,ApplBiochemBiotechnol, 2009, 157 (3):562-574]，是由免疫细胞分泌，包括肥大细胞，嗜中性粒细胞，DC细胞及B和T细胞等。BAFF促进B细胞及T细胞的增殖及分化，对成熟B细胞产生及维持有重要的作用，基因扰乱BAFF基因会导致成熟B2细胞和MZ B细胞明显的缺陷[Y.Laabi, A.Strasser, Science, 2000，289 (5481):883-884]。BAFF 可以结合 TNFR 家族的三种受体:TACI (transmembrane activator, calcium modulator, and cyclophilin ligandinteractor),BCMACB cell maturation Ag)和 BAFF-R(BAFF-receptor)。 TACI 和 BCMA 也可以结合APRIL，BCMA和TACI对B细胞的成熟及发育是必不可少，另外有研究表明TACI是BAFF负调节受体，引起B细胞的凋亡，调节B细胞的稳定。B细胞增殖主要是通过是由BAFF的第三受体BAFF-R进行诱导。
[0003]BAFF也参与自身免疫性疾病的发展。在自身免疫性疾病，如SLE，RA，病人血清中发现BAFF明显高于正常人，在BA FF的转基因小鼠中出现了严重的淋巴细胞紊乱和自身免疫性疾病的症状。BAFF的过量表达会促进低亲和性的自身反应B细胞的聚集，也会促进T细胞的过度活化，分化为效应T细胞，及抗凋亡因子Bcl2的表达和Thl细胞因子的分泌，从而引起自身免疫系统的紊乱；目前对于BAFF过量表达主要是通过血清浓度的直接检测，检测周期长，并且没有在国内医院系统内大范围的使用。
【发明内容】
[0004]为了解决上述现有技术的不足，本发明目的在于提供一种方便和快捷检测BAFF基因表达的引物和试剂盒。
[0005]本发明所采用的技术方案如下:
[0006]BAFF基因实时荧光PCR检测引物:
[0007]正向引物(SEQID N0.1):GATGACT CCACAGAAAG
[0008]反向引物(SEQID N0.2):ACAGCAGTTTCAAGC ；
[0009]并利用上述引物对进行荧光PCR检测的试剂盒，试剂盒包括一种检测溶液，其检测溶液含有含SYBR Premix Ex Taq(2X)、正向引物10 ii M、反向引物10 ii M、Rox Dye(50X)；
[0010]其中所述正向引物和方向引物为上诉的引物对。[0011]利用本试剂盒进行检测的步骤如下:
[0012]I)提取待检测样品的RNA，并反转录DNA溶液。
[0013]2)反应体系:取2ul步骤I)中所得的DNA溶液，并与上述试剂盒中的检测溶液14ul进行混合，并加入无菌超纯水至反应体积20ul ;加入到实时荧光反应管中，进行离心；
[0014]3)将步骤2)的反应体系按照下述条件进行实时荧光PCR检测:
[0015]预变性940C /30s, I次循环；变性950C /5s，延伸66°C /100s，40次循环。
[0016]本发明采用SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，对BAFF基因进行鉴定，具有检测实时性和高效性，并可以对早期BAFF基因表达进行检测，用于早期判断自身免疫性疾病，另外可以对病人进行个性诊断和治疗过程中，BAFF的基因表达情况的检测，并判断病人复发和加重病情的可能性。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是本发明实施例1检测试剂实时荧光PCR检测特异性扩增曲线；
[0018]图2是实施例1中PCR扩增数值对比；
[0019]图3是阴性对照和检测样品ELISA检测对比。
【具体实施方式】
[0020]根据实施例和附图对本发明作进一步的说明。
[0021]实施例1所示:`
[0022]1.设计BAFF基因实时荧光检测引物，针对BAFF cDNA的胞外区进行设计引物:
[0023]正向引物:GATGACTCCACAGAAAG
[0024]反向引物:ACAGCAGITTCAAGC；
[0025]2.构建利用上述引物对进行荧光PCR检测的试剂盒，试剂盒包括一种检测溶液，其检测溶液含有含SYBR Premix Ex Taq(2X)、正向引物10 ii M、反向引物10 ii M、Rox Dye(50X)；
[0026]3.检验样品的制备
[0027]离心待检测样品和阴性对照血液，提取下层细胞的RNA，并反转录cDNA溶液，低温保存备用；其中检测样品取自系统性红斑狼疮病人血液(1-6)作为检测对象，取6份正常人血清阴性对照。
[0028]4.PCR 反应
[0029]取2ul步骤3)中所得的cDNA溶液，并与上述试剂盒中的检测溶液14ul进行混合，并加入无菌超纯水至反应体积20ul ;加入到实时荧光反应管中，进行离心；
[0030]预变性94°C /30s, I次循环；变性95°C /5s，延伸66°C /100s，40次循环。
[0031]4.结果判断和分析。
[0032]如图1所示的PCR扩增曲线，附图2对阴性对照和病人进行荧光性比对分析。图1所示的扩增曲线表相本引物对具有良好的特异性，如附图2所示，检测样品1-6具有较阴性对照具有较高的BAFF基因表达情况。
[0033]5.对病人样品中的血清利用BAFF抗体进行ELISA验证检测，所述的BAFF抗体购自BioVision公司。如附图3所示，其中“***”表示p〈0.001，具有明显性差异，其中样品6没有显著性差异；如样品6外，ELISA检测结果与实时荧光PCR检测的趋势相符。
[0034]其中，利用实时荧光PCR检测BAFF基因表达后，分析检测样品1_6相对于阴性对照具有显著的差异，利用ELISA验证时，确定病人1-5血清中BAFF的浓度较高，进而判断为BAFF依赖性系统自身免疫性疾病，针对BAFF进行药物使用；对病人6再进行其他方面的分析。
[0035]上述实验表明，本发明所述的引物对具有良好的特异性，可用于BAFF基因表达检测，用于区别病人 自身免疫性疾病的病因。
【权利要求】
1.BAFF基因实时荧光PCR检测引物，其特征是:正向引物如SEQ ID N0.1所示; 反向引物如SEQ ID N0.2所示。
2.BAFF基因实时荧光PCR检测的试剂盒，其特征是:试剂盒包括一种检测溶液，其检测溶液含有含 SYBR Premix Ex Taq(2X)、正向引物 10 ii M、反向引物 10 ii M、Rox Dye (50X)； 其中所述正向引物和反向引物为权利要求1所示引物。
3.BAFF基因实时荧光PCR检测方法，利用权利要求2所述的试剂盒进行检测，其特征是，具体步骤如下: 1)提取待检测样品的RNA，并反转录DNA溶液； 2)反应体系:取2ul步骤I)中所得的DNA溶液，并与权利要求2所述试剂盒中的检测溶液14ul进行混合，并加入无菌超纯水至反应体积20ul ;加入到实时荧光反应管中，进行离心； 3)将步骤2)的反应体系按照下述条件进行实时荧光PCR检测，实时荧光PCR检测的条件如下: 预变性940C /30s, I次循环；变性950C /5s，延伸66V /100s，40次循环。
【文档编号】C12N15/11GK103498001SQ201310488978
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月17日 优先权日:2013年10月17日
【发明者】于惠, 管淑红, 李艳丽 申请人:于惠