具有强rna干涉效果的脂质修饰的双链rna的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2008年10月24日的中国发明专利申请 No. 20088011314L 7(PCT 申请号为 PCT/JP2008/069829)的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种能够有效地抑制靶基因表达的脂质修饰的双链RNA。更具体而言， 本发明涉及一种具有高核酸酶抗性及高细胞内导入率（uptake efficiency)并且产生优异 的RNA干涉效果的脂质修饰的双链RNA。
【背景技术】
[0003] 有效地治疗癌症和AIDS等难治疾病的药物的开发是生命科学领域中的一个重大 课题。攻克上述课题的一种有效的方法是使用仅作用于特定基因的基因药物。特别是，作 为这样的基因药物，利用长21个碱基的短双链RNA (小干涉RNA :siRNA)的RNA干涉（RNA interference :RNAi)法最近受到更多的关注。上述RNAi法在1998年由Fire等人首次报 道（参见非专利文献1)。根据Fire等人的报道，当与欲抑制功能的基因的特定区域同源的 100个碱基对左右的双链RNA被导入细胞内时，通过切酶（Dicer)的作用双链RNA分解成 20~25个碱基对左右的片段，之后与多种蛋白质复合，形成RNA/蛋白质复合体（该复合体 称作RISC :RNA诱导沉默复合体），所述复合体与由靶基因产生的mRNA的同源位点结合，从 而强力地抑制基因表达。但是，据报道：当将约30个碱基对或更长的长双链RNA导入哺乳 动物细胞中时，作为抗病毒应答的干扰素应答被诱导，结果导致细胞凋亡的现象。因此，认 为RNAi法难以适用于哺乳动物。Tuschl等人化学合成了在双链RNA的两个3'末端具有 悬端（dangling end)的21个碱基长度的双链RNA，并且报道当将这种双链RNA直接导入 哺乳动物细胞内时，该双链RNA能够序列特异性地强有力地抑制基因表达，同时避免干扰 素应答（参见非专利文献2)。Tuschl等人进一步合成了由19个碱基对的双链区域和位于 3'末端或5'末端的各种长度的悬端组成的短双链RNA，并且研宄了它们的RNA干涉效果。 结果观察到在两个3'末端具有2个碱基的悬端的21个碱基长度的SiRNA显示出非常强的 RNA干涉效果，而没有其它类型的短双链RNA显示出显著的RNA干涉效果。根据上述报道， 目前通常使用下述RNA干涉法，其采用21个碱基长度、在两个3'末端具有2个碱基的悬端 的双链RNA。此处为了与RNAi法相区别，将使用21个碱基长度的短双链RNA来抑制靶基因 表达的方法称作" siRNA法"。
[0004] 由于上述SiRNA法使用合成的RNA，所以较容易制备样品，操作也简单，并且能够 产生非常强的效果，因此，siRNA法不仅在生命科学领域，在生物技术商业领域也广泛受到 关注。
[0005] 但是，上述优异的SiRNA法也存在必须要解决的问题。如上所述，SiRNA由容易被 核酸酶的作用分解的RNA分子组成。双链RNA区域与单链RNA相比，对培养基及/或细胞 中含有的核酸酶具有相当的高抗性。但由19个碱基对组成的双链RNA几乎不产生已知的 RNA干涉效果。因此，有报道称，当被导入含有靶基因序列的细胞内时，虽然合成的siRNA在 大约2天~大约4天的时间里产生强基因表达抑制效果，但之后其RNA干涉效果迅速减弱， 到7日左右几乎完全消失。
[0006] 最近为了使合成的siRNA具有提高的细胞导入率和延长的高活性RNA干涉效果， 报道了各种化学修饰的siRNA。例如为了提高对核酸外切酶消化的抗性，合成了在SiRNA末 端用氨基、巯基或脱碱基位点修饰的siRNA。但是，已经有报道称，大多数末端修饰的21个 碱基长度的siRNA具有显著减弱的RNA干涉效果。
[0007] 近年来，J. Rossi等人报道了 27个碱基对的双链RNA比21个碱基长度的双链RNA 产生高100倍左右的RNA干涉效果（参见非专利文献3)。推断这是由于27个碱基对的RNA 被RNase III样酶切酶切割成21个碱基长度的siRNA后，蛋白质复合体RISC识别siRNA， 使得可以高效地产生siRNA效果。
[0008] 如上所述，由于27个碱基长度的RNA可以产生优异的RNA干涉效果，所以更期待 使用这种RNA作为基因药物。但是，完全不清楚何种技术方法对增强27个碱基长度的RNA 的RNA干涉效果有效。此外，也不清楚何种技术方法可提高具有RNA干涉效果的长于或短 于27个碱基的双链RNA的RNA干涉效果。
[0009] 具有RNA干涉效果的双链RNA通常构造为具有悬端。对不具有悬端（即，具有平 端）的RNA也进行了 RNA干涉效果的研宄。但是结果表明，在有义链的5'末端侧为平端的 双链RNA与在有义链的5'末端侧具有悬端的双链RNA相比，RNA干涉效果基本相同或者较 低（参见非专利文献4)。
[0010] 脂质具有高的细胞膜透过性，而且已知其对向细胞内转运药物有用。预期将脂质 与具有RNA干涉效果的双链RNA连接可提高细胞内导入率，从而产生更强的RNA干涉效果。 但是，如果将具有RNA干涉效果的双链RNA与脂质简单地连接，则会导致RNA干涉效果的显 著减弱。在现有技术中，现状是尚未构建兼有优异的RNA干涉效果与基于脂质的有用效果 的脂质修饰的双链RNA。
[0011] 非专利文献 I :Fire et al·，Nature, 391，806 - 811 (1998)
[0012] 非专利文献 2 :Tuschl et al·，EMBO Journal, 20, 6877 - 6888 (2001)
[0013] 非专利文献 3 :J. Rossi et al.，Nature Biotech.，23, 222 - 226 (2005)
[0014] 非专利文献 4 :J. T. Marques et al.，Nature Biotech.，24, 559 - 565 (2005)
【发明内容】
[0015] 本发明所要解决的问题
[0016] 本发明的一个目的在于提供一种具有高核酸酶抗性及高细胞内导入率并且能够 产生优异的RNA干涉效果的新型双链RNA。本发明的另一个目的在于提供一种含有上述新 型双链RNA的药物组合物。本发明的进一步的目的在于提供一种抑制靶基因表达的方法， 所述方法包括将新型双链RNA导入细胞来抑制靶基因表达。
[0017] 解决所述问题的手段
[0018] 本发明人等为了实现上述目的，进行了深入的研宄，结果发现如果脂质直接或通 过连接体连接到双链RNA的有义链中从5'末端起第1~6个核苷酸中的至少一个上，所述 双链RNA包含具有与靶基因中的靶序列互补的核苷酸序列的有义链，及具有与该有义链互 补的核苷酸序列的反义链，该双链RNA能够抑制所述靶基因的表达，则这样构建的双链RNA 具有高核酸酶抗性及高细胞内导入率，并且产生优异的RNA干涉效果。基于上述发现，通过 进一步的研宄完成了本发明。
[0019] 更具体而言，本发明提供下述脂质修饰的双链RNA、含有新型双链RNA的药物组合 物、抑制靶基因表达的方法等。
[0020] 项1、一种脂质修饰的双链RNA，其包含具有与靶基因中的靶序列互补的核苷酸序 列的有义链，及具有与上述有义链互补的核苷酸序列的反义链，上述双链RNA能够抑制所 述靶基因的表达，并且上述有义链具有直接或通过连接体连接到从5'末端起第1~6个核 苷酸中的至少一个上的脂质。
[0021] 项2、如项1所述的脂质修饰的双链RNA，其在有义链的5'末端侧为平端，并且在 有义链的3'末端侧为平端或具有悬端。
[0022] 项3、如项1所述的脂质修饰的双链RNA，其在有义链的5'末端侧及3'末端侧均 具有悬端。
[0023] 项4、如项1~3中任一项所述的脂质修饰的双链RNA，其中上述有义链由21~27 个核苷酸组成。
[0024] 项5、如项2所述的脂质修饰的双链RNA，其在有义链的5'末端侧及3'末端侧均 为平端，并且有义链及反义链各自由27个核苷酸组成。
[0025] 项6、如项2所述的脂质修饰的双链RNA，其在有义链的5'末端侧及3'末端侧均 为平端，并且有义链及反义链各自由23个核苷酸组成。
[0026] 项7、如项2所述的脂质修饰的双链RNA，其在有义链的5'末端侧为平端，有义链 由25个核苷酸组成，且反义链由23个核苷酸组成。
[0027] 项8、如项3所述的脂质修饰的双链RNA，其中有义链及反义链各自由21个核苷酸 组成。
[0028] 项9、如项1~8中任一项所述的脂质修饰的双链RNA，其中上述脂质为具有6~ 50个碳原子的脂肪酸。
[0029] 项10、如项1~9中任一项所述的脂质修饰的双链RNA，其中上述脂质为月桂酸、 硬脂酸、肉豆蔻酸或棕榈酸。
[0030] 项11、如项1~10中任一项所述的脂质修饰的双链RNA，其中上述脂质通过连接 体与从有义链的5'末端起第1~6个核苷酸中的至少一个连接，所述连接体由下述结构式 表示
[0031] -NH- (CH2) nl - (L - 4)
[0032] 其中，nl为1~40的整数。
[0033] 项12、一种药物组合物，含有项1~10中任一项所述