专利名称：表面修饰有pvtrppr片段的隐形脂质体及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体地说，是涉及一种表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体及其制备方法和用途。
背景技术：
传统的肿瘤治疗方法，除了手术治疗外，还包括放射治疗、化学治疗和生物因子治疗等。但这些治疗方法都不是特异性地针对肿瘤细胞，即缺乏靶向性。因此药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常组织细胞也产生广泛毒性，致使药物利用度有限，副作用大，使用剂量受限。由于肿瘤组织对具有一定粒径的纳米颗粒(10-500nm)具有EPR (高通透性和滞留)效应，即处在血循环中的纳米颗粒可被动靶向至肿瘤组织，发挥所包载药物的抗肿瘤作用。Neuropilin-I (NRP-1)是细胞表面的一种I型跨膜糖蛋白，通常表达在一些肿瘤细胞和血管内皮细胞表面，是血管内皮生长因子165 (VEGF165)的受体，在肿瘤转移、血管新生、调节血管通透性等方面发挥重要功能。人类许多肿瘤组织上有NRP-I的表达，包括前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌和神经胶质瘤，但在相应的正常组织上皮细胞中却没有表达。目前已有研究者利用NRP-I受体抑制剂来抑制肿瘤血管新生从而达到抑制肿瘤生长和转移的目的。PVTRPPR多肽是通过噬菌体展示技术筛选得到的一个直链七肽，是NRP-I的配体，它对NRP-I高表达的肿瘤细胞和肿瘤血管表现出特异亲和性。PVTRPPR多肽属于“肿瘤穿透肽”，具有肿瘤血管穿透性和肿瘤组织穿透性，这类多肽可以介导与其共价连接的药物分子或纳米递药系统穿透肿瘤血管壁并渗透进入肿瘤内部，分布到整个肿瘤组织中，与目前主流的主动靶向分子相比具有明显的优越性。目前尚未见利用NRP-I受体或PVTRPPR多肽介导纳米递药系统用于肿瘤靶向治疗的报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的不足提供一种表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体及其制备方法和用途。本发明利用率高，实效性能好，应用于肿瘤靶向诊断与治疗中。本发明可以通过以下技术方案来实现本发明涉及一种表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体。优选的，所述表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体包括如下各组分天然磷脂、胆固醇、甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物、PVTRPPR多肽-聚乙二醇-磷脂复合物。优选的，所述天然磷脂和胆固醇的摩尔比为(O. 2 5) 1，所述天然磷脂和甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物的摩尔比为1000: (O. I 100)，所述天然磷脂和PVTRPPR多肽-聚乙二醇-磷脂复合物的摩尔比为1000: (O. I 100)。优选的，所述甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中的甲氧基聚乙二醇的分子量为400 8000，所述PVTRPPR多肽-聚乙二醇-磷脂复合物中的聚乙二醇的分子量为400 8000。优选的，所述PVTRPPR片段为直链七肽片段。本发明还涉及一种制备表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体的方法，包括如下步骤(a)取隐形脂质体各组分溶于氯仿中，旋转蒸发，除去溶剂；(b)将(MM)2SO4溶液加上述步骤(a)所得产物中，超声分散；(c)将上述步骤(b)产物在水浴中旋转震荡，得空白隐形脂质体混悬液；(d)将空白隐形脂质体混悬液置透析袋中，透析；(e)将上述步骤(d)所得产物加热，碳酸脂膜挤压，得到表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体。本发明还涉及一种含有表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体的药物制剂，包括如下质量百分比的各组分抗肿瘤药物2 30%，隐形脂质体70 98%。优选的，所述药物制剂的平均粒径为30 lOOOnm。本发明还涉及一种制备药物制剂的方法，包括如下步骤(a)称取抗肿瘤药物，溶于水中；(b)将上述步骤(a)产物加入隐形脂质体，加热，即得药物制剂。优选的，所述抗肿瘤药物为阿霉素、表阿霉素、顺钼、柔红霉素、紫杉醇或多烯紫杉醇的一种或者多种混合。本发明还涉及一种表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体用于肿瘤靶向诊断与治疗药物的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体及其制备方法和用途，应用于肿瘤靶向诊断与治疗中，通过肿瘤EPR效应和PVTRPPR介导作用的相结合，将药物通过注射靶向至进入肿瘤部位，并可穿透肿瘤血管壁，渗透进入整个肿瘤组织内部，提高药物的抗肿瘤作用，利用率高，实效性能好。
图I为本发明实施例I红外(FTIR)图谱；
图2为本发明PVTRPPR-脂质体和脂质体粒径分布图3为粒度仪测定脂质体平均粒径结果图4为PVTRPPR-脂质体和脂质体分别与PC-3肿瘤细胞作用后的荧光显微照片
图5为活体成像仪检测效果图6为药效测试结果示意图 为活体成像仪检测效果相片。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。实施例I本实施例涉及一种表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体，包括如下摩尔数的各组分氢化大豆磷脂55、胆固醇45、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物2、PVTRPPR多肽-聚乙二醇-磷脂复合物O. 5 ；表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体的制备方法，包括如下步骤(a)取隐形脂质体各组分溶于氯仿中，旋转蒸发，除去溶剂；(b)将(MM)2SO4溶液加上述步骤(a)所得产物中，超声分散；(c)将上述步骤(b)产物在60°C水浴中旋转震荡，得空白隐形脂质体混悬液；(d)将空白隐形脂质体混悬液置透析袋中，透析；(e)将上述步骤(d)所得产物加热至60°C，可直接碳酸脂膜挤压，得到表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体。一种含有表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体的药物制剂，包括如下质量百分比的各组分抗肿瘤药物5%，隐形脂质体95%。前述药物制剂的方法包括如下步骤Ca)称取抗肿瘤药物，溶于水中；(b)将上述步骤(a)产物加入隐形脂质体，加热，即得药物制剂。实施效果(I)用红外图谱测定本实施例得到的表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体，结果见图1，表明合成成功；(2)用激光粒度分析仪测定含有表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体的药物制剂的粒径范围为30 lOOOnm，平均粒径均为90nm左右，见图2所示；(3)如图3所示经显微镜观察，可见表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体外观呈球状，结构清晰。(4)通过荧光示踪脂质体，考查肿瘤细胞分别对载羧基荧光素(FAM)的PVTRPPR修饰脂质体和未修饰脂质体的摄取，结果证实PVTRPPR多肽在体外能介导脂质体进入肿瘤细胞，见图4、图7所示；(5)通过近红外染料DiR标记脂质体,将包载DiR的PVTRPPR修饰脂质体和未修饰脂质体经静脉注射于肿瘤动物模型体内，在活体成像仪下观测，证明PVTRPPR修饰脂质体对肿瘤组织具有很好的靶向性，见图5所示；(6)采用免疫荧光染色法，考查载FAM的PVTRPPR修饰脂质体和未修饰脂质体在肿瘤组织中的渗透扩散能力，证明PVTRPPR修饰脂质体可渗透分布到整个肿瘤组织，而未修饰脂质体则主要分布在血管附近，见图5、图6、图7所不。实施例2本实施例涉及一种表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体，包括如下摩尔数的各组分氢化大豆磷脂55、胆固醇45、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物2、PVTRPPR多肽-聚乙二醇-磷脂复合物O. 5。表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体的制备方法，包括如下步骤(a)取隐形脂质体各组分溶于氯仿中，旋转蒸发，除去溶剂；(b)将(MM)2SO4溶液加上述步骤(a)所得产物中，超声分散；(c)将上述步骤(b)产物在60°C水浴中旋转震荡，得空白隐形脂质体混悬液；(d)将空白隐形脂质体混悬液置透析袋中，透析；
(e)将上述步骤(d)所得产物加热至60°C，可直接碳酸脂膜挤压，得到表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体。一种含有表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体的药物制剂，包括如下质量百分比的各组分抗肿瘤药物25%，隐形脂质体75%。前述药物制剂的方法，包括如下步骤(a)称取抗肿瘤药物，溶于水中；(b)将上述步骤(a)产物加入隐形脂质体，加热，即得药物制剂。实施效果(I)用红外图谱测定本实施例得到的表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体，结果见图1，表明合成成功；(2)用激光粒度分析仪测定含有表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体的药物制剂的粒径范围为30 lOOOnm，平均粒径均为90nm左右，见图2所示；(3)如图3所示经显微镜观察，可见表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体外观呈球状，结构清晰。(4)通过荧光示踪脂质体，考查肿瘤细胞分别对载羧基荧光素(FAM)的PVTRPPR修饰脂质体和未修饰脂质体的摄取，结果证实PVTRPPR多肽在体外能介导脂质体进入肿瘤细胞，见图4、图7所示；(5)通过近红外染料DiR标记脂质体,将包载DiR的PVTRPPR修饰脂质体和未修饰脂质体经静脉注射于肿瘤动物模型体内，在活体成像仪下观测，证明PVTRPPR修饰脂质体对肿瘤组织具有很好的靶向性，见图5所示；(6)采用免疫荧光染色法，考查载FAM的PVTRPPR修饰脂质体和未修饰脂质体在肿瘤组织中的渗透扩散能力，证明PVTRPPR修饰脂质体可渗透分布到整个肿瘤组织，而未修饰脂质体则主要分布在血管附近，见图5、图6、图7所不。实施例3、PVTRPPR-脂质体体外肿瘤细胞靶向性验证取对数生长期的单层培养肿瘤细胞，用O. 25%胰蛋白酶和O. 025%乙二胺四乙酸二钠消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔I X 105个细胞接种于培养皿中，每孔体积1ml，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37°C，5% 二氧化碳及饱和湿度条件下培养过夜，使细胞贴壁。次日，用含1%胎牛血清的DMEM培养液配制一系列不同浓度的脂质体/FAM和PVTRPPR-脂质体/FAM溶液。将培养皿中的培养液吸出，加入脂质体/FAM和PVTRPPR-脂质体/FAM的系列溶液，37°C孵育lh，吸弃上清液。用PBS溶液洗皿两次，在激光共聚焦显微境下观察细胞内化情况。结果显示脂质体/FAM几乎不被摄取，而PVTRPPR-脂质体/FAM则被大量摄取，说明PVTRPPR-脂质体/FAM对肿瘤细胞具有良好的体外靶向性，见图4所示。实施例4、PVTRPPR-脂质体体内静脉注射后对肿瘤靶向性的验证将处于对数生长期的PC-3细胞胰酶消化，PBS洗涤，分散于PBS中，以I X IO7细胞(ΙΟΟμ I)浓度皮下注射接种于裸鼠右侧肩胛骨部位，SPF环境下饲养。取成瘤裸鼠模型6只，随机分为两组，分别尾静脉注射脂质体/DiR和PVTRPPR-脂质体/DiR，给药后24小时将裸鼠麻醉，在活体动物成像系统内扫描脂质体/DiR和PVTRPPR-脂质体/DiR在裸鼠肿瘤组织的分布。结果显示与脂质体/DiR相比，PVTRPPR-脂质体/DiR在裸鼠肿瘤组织内的分布显著增加，表明PVTRPPR的修饰实现了脂质体对肿瘤的靶向递药，见图5所示。 实施例5、PVTRPPR-脂质体的肿瘤组织穿透性研究将处于对数生长期的PC-3细胞胰酶消化，PBS洗漆，分散于PBS中，以I X IO7细胞(ΙΟΟμ I)浓度皮下注射接种于裸鼠右侧肩胛骨部位，SPF环境下饲养。取成瘤裸鼠模型6只，随机分为两组，分别尾静脉注射脂质体/FAM和PVTRPPR-脂质体/FAM，给药后8小时将
6裸鼠处死，后取出皮下瘤，进行冰冻切片，对肿瘤血管进行免疫染色，荧光显微镜下观察，结果显示，脂质体/FAM主要分布在肿瘤血管附近区域，而PVTRPPR-脂质体/FAM则可分布于整个肿瘤组织，表明PVTRPPR的修饰使脂质体具有了肿瘤组织穿透性，见图5所示。综上所述，本发明表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体有显著的增强阿霉素脂质体的抗肿瘤作用，同时有良好的肿瘤靶向性，药物利用率高，实效性能好，含有表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体的药物制剂还可以应用于肿瘤靶向诊断与治疗中。
权利要求
1.一种表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体。
2.如权利要求I所述的表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体，其特征在于，包括如下各组分天然磷脂、胆固醇、甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物、PVTRPPR多肽-聚乙二醇-磷脂复合物。
3.如权利要求2所述的表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体，其特征在于，所述天然磷脂和胆固醇的摩尔比为(O. 2 5):1，所述天然磷脂和甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物的摩尔比为1000:(0. I 100)，所述天然磷脂和PVTRPPR多肽-聚乙二醇-磷脂复合物的摩尔比为 1000: (O. I 100)。
4.如权利要求2或3所述的表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体，其特征在于，所述甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中的甲氧基聚乙二醇的分子量为400 8000，所述PVTRPPR多肽-聚乙二醇-磷脂复合物中的聚乙二醇的分子量为400 8000。
5.如权利要求I所述的表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体，其特征在于，所述PVTRPPR片段为直链七肽片段。
6.一种制备如权利要求I所述的表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体的方法，其特征在于，包括如下步骤(a)取隐形脂质体各组分溶于氯仿中，旋转蒸发，除去溶剂；(b)将(MM)2SO4溶液加上述步骤(a)所得产物中，超声分散；(c)将上述步骤(b)产物在水浴中旋转震荡，得空白隐形脂质体混悬液；Cd)将空白隐形脂质体混悬液置透析袋中，透析；Ce)将上述步骤(d)所得产物加热，碳酸脂膜挤压，得到表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体。
7.一种含有如权利要求I所述的表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体的药物制剂，其特征在于，包括如下质量百分比的各组分抗肿瘤药物2 30%，隐形脂质体70 98%。
8.如权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的平均粒径为30 IOOOnm0
9.一种制备如权利要求7所述的药物制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤(a)称取抗肿瘤药物，溶于水中；(b)将上述步骤(a)产物加入隐形脂质体，加热，即得药物制剂。
10.如权利要求7所述的药物制剂，其特征在于所述抗肿瘤药物为阿霉素、表阿霉素、顺钼、柔红霉素、紫杉醇或多烯紫杉醇的一种或者多种混合。
11.一种如权利要求I所述的表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体在制备诊断与治疗肿瘤靶向药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种生物医药领域的表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体及其制备方法和用途；所述隐形脂质体，包括如下各组分天然磷脂、胆固醇、甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物、PVTRPPR多肽-聚乙二醇磷脂复合物，本发明还涉及表面修饰有PVTRPPR片段的隐形脂质体的制备方法及含有PVTRPPR修饰的隐形脂质体的药物制剂及其制备方法。本发明以PVTRPPR修饰在隐形脂质体的表面，PVTRPPR多肽作为靶向头基，静脉给药，载药隐形脂质体通过肿瘤穿透肽PVTRPPR介导主动靶向作用将所载药物主动靶向至肿瘤血管，直接渗透整个肿瘤组织内，从而提高了药物的治疗效果。本发明操作简单，效率高，实效性能好，有较好的应用前景。
文档编号A61P35/00GK102935067SQ20121030647
公开日2013年2月20日 申请日期2012年8月24日 优先权日2012年8月24日
发明者杨一祎, 闫志强, 魏岱旭, 钟建, 金彩虹, 余震, 何丹农 申请人:上海交通大学, 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司