一种合成特立帕肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成特立帕肽的方法。
【背景技术】
[0002] 特立帕肽是一种合成的34肽，为人甲状旁腺素 PTH的1-34氨基酸片段，氨基酸顺 序如下：
[0003] H-Serl-Val2-Ser3-Glu4-Ile 5-Gln6-Leu7-Met8-His9-Asn io-Leull-Gly12-Lys13-His 14-Leui5-Asnl6-Seri7-Met l8-Glui9-Arg2o-Val2i-Glu 22-Trp23-Leu24-Arg25-Lys 26-Lys27-Leu28-Gln29 -Asp30-Val31-His32-Asn33-Phe 34-OH
[0004] 该片段是含有84个氨基酸的内源性甲状旁腺素 PTH具有生物活性的N-末端区 域。本品的免疫学和生物学特性与内源性甲状旁腺素 PTH以及牛甲状旁腺素 PTH(bPTH)完 全相同。
[0005] 特立帕肽是第一种获得美国食品及药物管理局FDA批准的骨形成剂类新药，这种 甲状旁腺激素的衍生物可以通过增加成骨细胞的活性及数量而促进骨生长，而目前的常规 骨质疏松药物一般只是作用于破骨细胞而减缓或阻断骨质流失，特立帕肽是由礼来药厂生 产的，涉及到1637例绝经后骨质疏松症患者的临床研宄结果显示，与那些只服用了钙和维 生素 D补加剂的患者相比，96%的患者在接受该药治疗后，其脊柱和臀部的骨（矿物质）密 度BMD均表现出显著增加，此外还发现，该药能够分别减少发生脊柱骨折和其他类型骨折 危险的65%和53%。
[0006] 对于本品制备的方法，已有专利技术进行公开。中国专利CN102731643A公开了以 2_氯三苯甲基氯树脂（2-CTC树脂）为固相载体风味5个片段进行偶联，虽然该方法可以缩 短合成周期，但是其总收率最高仅为32. 2%。
[0007] 当下比较流行的合成方法为固相逐步合成法（SPPS)，该方法具有操作简单和设 备要求低的优点，但是该方法也因为总收率较低而限制了特立帕肽的生产效率。如专利 CN103467595A，其在逐步合成偶联到17位丝氨酸时，以未保护的丝氨酸和16位天冬酰胺 羧基进行酯缩合，在获得粗肽后再将酯键转化为酰胺键，其总收率最高为42. 1 %。专利 CN104017064A也公开了一种逐步合成方法，其在合成16-17位氨基酸时采用假脯氨酸二 肽、并以特定的裂解液裂解，其总收率最高为38%。专利CN104530218A公开了一种逐步合 成方法，以王树脂或2-CTC树脂为固相载体合成，其总收率为34. 72%。
[0008] 综合上述现有的特立帕肽的合成方案来看，其总收率均不高，最高的为42. 1%，虽 然CN103467595A在其中声称其总收率介于30-50 %，但是根据其实施例的详细记载，最高 仅为42. 1%。较低的总收率是限制特立帕肽生产效率的主要因素，需要改善现有的合成方 案来提高其总收率。
【发明内容】
[0009] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种特立帕肽的制备方法，使得本发明所述方 法在保证较高的纯度前提下，提高特立帕肽的总收率。
[0010] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0011] -种合成特立帕肽的方法，包括以下步骤：
[0012] 步骤I、N端偶联有保护基的Phe在偶联试剂和活化试剂作用下和HMP Linker树 脂进行酯化反应，得到肽树脂1 ;
[0013] 步骤2、按照特立帕肽氨基酸序列C端到N端的顺序，从肽树脂1出发，在缩合试剂 和活化试剂作用下，将其余保护氨基酸进行逐一延伸偶联，每次延伸偶联后均得到对应的 肽树脂，最终获得特立帕肽树脂，然后酸解获得特立帕肽粗品，特立帕肽粗品纯化转醋酸盐 得到特立帕肽纯品。
[0014] 特立帕肽主链氨基酸有34个，组成如下：
[0015] H-Serl-Val2-Ser3-Glu4-Ile 5-Gln6-Leu7-Met8-His9-Asn io-Leull-Gly12-Lys13-His 14-Leui5-Asnl6-Seri7-Met l8-Glui9-Arg2o-Val2i-Glu 22-Trp23-Leu24-Arg25-Lys 26-Lys27-Leu28-Gln29 -Asp30-Val31-His32-Asn33-Phe 34-OH
[0016] 本发明针对现有技术中均采用王树脂或2-CTC树脂为固相载体，造成特立帕肽总 收率较低的缺陷，选择HMP Linker树脂作为固相载体进行特立帕肽的逐步合成，在保证特 立帕肽纯度的前提下提高了其总收率。
[0017] 本发明所述保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链以及侧链上氨基、 羧基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应， 生成杂质，对于本发明中需要保护侧链的氨基酸来说，本领域技术人员公知其侧链结构 以及知晓采用常用保护基来保护氨基酸侧链上的氨基、羧基等基团，作为优选，本发明通 过tBu保护基保护丝氨酸的侧链；通过Pdf保护基保护精氨酸的侧链；通过OtBu保护基 保护门冬氨酸、谷氨酸的侧链；通过Trt保护基保护组氨酸、门冬酰胺、谷酰胺的侧链；通 过Boc保护基保护赖氨酸、色氨酸的侧链。此外，在本发明所述方法涉及的保护氨基酸中， N端均优选通过Fmoc保护基进行保护。被保护基保护的氨基酸称为保护氨基酸。作为优 选，所述其余保护氨基酸为 Boc_Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Asp(OtBu)-〇H、Fmoc_Asn(Trt)-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -OH、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser (tBu)-OH、 Fmoc-Trp(Boc) -OH、Fmoc-Val-OH0
[0018] 作为优选，步骤I所述保护基为Fomc保护基。
[0019] 作为优选，所述 HMP Linker 树脂为 HMP Linker Amide 树脂、HMP Linker BHA 树 脂或HMP Linker MBHA树脂。各树脂结构如下（P代表代表聚合物）：
[0020]
[0022] 作为优选，所述N端偶联有保护基的Phe和HMP Linker树脂的摩尔比为1-6:1，更 优选为 2. 5-3. 5:1。
[0023] 作为优选，所述肽树脂1的取代值为0. 2-1. Ommol/g肽树脂1，更优选为 0. 3-0. 6mmol/g 肽树脂 1。
[0024] 作为优选，所述缩合试剂优选为N，N-二异丙基碳二亚胺（DIC)、N，N-二环己基碳 二亚胺（DCC)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有机碱（PyBOP/有机碱）、 2_ (7-氮杂-IH-苯并三氮唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯/有机碱（HATU/有机 碱）、苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸盐/有机碱（HBTU/有机碱）、0-苯并三 氮唑-Ν，Ν，Ν'，Ν'_四甲基脲四氟硼酸酯/有机碱（TBTU/有机碱）中的一种。所述缩合试 剂的摩尔用量优选为肽树脂中摩尔数的1~6倍，更优选为2. 5~3. 5倍。
[0025] 需要说明的是，所述PyBOP/有机碱、HATU/有机碱、HBTU/有机碱、TBTU/有机碱， 在本发明中属于四种双体系的缩合试剂，即PyBOP、HATU、HBTU在使用时需要分别和有机碱 组合在一起成为一种缩合试剂使用，其中所述有机碱和PyBOP、HATU、HBTU、TBTU的摩尔比 优选为为1. 3-3. 0:1，更优选为1. 3-2:1。
[0026] 作为优选，所述缩合试剂中的有机碱优选为N，N-二异丙基乙胺（DIPEA)、三乙胺 (TEA)或N-甲基吗啡啉（NMM)，更优选为DIPEA。
[0027] 作为优选，所述活化试剂为1-羟基苯并三唑（HOBt)或N-羟基-7-氮杂苯并三氮 唑（HOAt)。所述活化试剂的用量优选为肽树脂中摩尔数的1~6倍，更优选为2. 5~3. 5 倍。
[0028] 作为优选，所述偶联试剂为N，N-二异丙基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶（DIC/DMAP) 双体系偶联试剂。
[0029] 作为优选，所述酯化反应和延伸偶联的反应溶剂均采用DMF。
[0030] 本发明所述延伸偶联是指在第一个氨基酸与氨基树脂偶联后，剩余氨基酸按照特 立帕肽氨基酸的C端到N端的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应（主链氨基和 羧基的缩合反应）进行偶联。本发明偶联时，每次延伸偶联时所述保护氨基酸和对应肽树 脂的摩尔比优选为1-6:1，更优选为2. 5-3. 5:1 ;所述偶联反应时间优选为60~300分钟， 更优选为100~140分钟。所述对应的肽树脂是指按照特立帕肽氨基酸序列C端到N端的 顺序，从肽树脂1出发，每一个保护氨基酸在逐步偶联时，其需要偶联的肽树脂。
[0031] 在延伸偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端保护基再偶 联，这对本领域技术人员来说是公知常识。本发明优选用PIP/DMF(哌啶/N，N-二甲基甲酰 胺）混合溶液脱除N端保护基，混合溶液中含哌啶为10~30% (V)，其余为DMF。去N端保 护基时间优选为10~60分钟，优选的为15~25分钟。去N端保护基试剂的用量优选为 每 0· 05mol 肽树脂 1000-1600mL。
[0032] 需要说明的是，本发明所述肽树脂指任意个数氨基酸按照特立帕肽氨基酸顺序和 HMP Linker树脂相连接形成的肽树脂，这其中也包括肽树脂1。
[0033] 作为优选，所述酸解采用由体积百分比为80-95%的TFA、体积百分比为1-10%的 EDT、余