含有脯氨酸或其衍生物以及抗肿瘤抗体的抗癌组合物的制作方法

专利名称：含有脯氨酸或其衍生物以及抗肿瘤抗体的抗癌组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物组合物，其含有脯氨酸或脯氨酸衍生物或它们的盐、酯、异构体或药物前体以及抗癌配体，该抗癌配体优选针对肿瘤抗原的抗体。本发明还针对脯氨酸或脯氨酸衍生物或其盐、酯、异构体或药物前体用于制备治疗癌症的药物组合物的应用，本发明还涉及通过给药所述组合物的治疗癌症的方法。
癌症是世界上重要的健康问题。尽管在癌症检测和治疗中已经有了进展，但目前仍没有可以用的疫苗或其它普遍有效的预防或治疗方法。目前，对该疾病的治疗依赖于早期诊断和积极治疗，其可以包括一种或多种各类治疗，例如手术、放射疗法、化学疗法和激素疗法。尽管这些疗法为许多患者提供了帮助，但仍观察到了许多癌症的高死亡率。改进的抗肿瘤药物的开发将促进癌症的预防和治疗。
不幸的是，在男性和女性中，癌症是心脏病之后的第二主要的死亡原因。在对抗癌症的斗争中，已经开了发许多技术，这些技术是目前研究的主题，针对理解该疾病的性质和原因、以及提供其控制或治疗的方法。
尽管已经评价了数千种可能的抗癌试剂，但对人类癌症的治疗仍充满了复杂情况，其经常提供一系列的不是最佳的治疗选择。同样地，化学治疗药物，其具有很少或者没有毒性，可便宜获得或制备，能够被患者充分忍受，并能够容易给药，是目前肿瘤学家可以获得的治疗方法的期望的添加物。同样期望的是能够选择性地使恶性组织对较低剂量的射线或治疗变得敏感，以达到相同的治疗效果，而对健康组织具有较少损害的药物。同样地，还期望防止出现或再次出现癌症的药物。本发明的治疗方法通过提供这类化学疗法和致敏的药物，满足了这些需求。
因此，本发明的技术问题是提供可以替换的或者被较合适改性的表现抗癌活性的化合物，并从这些化合物产生可以用作抗癌治疗的药物组合物。同样是本发明目标的是提供一种抗癌组合物，其能够在出现多药抗性之后被给药。
通过在提供权利要求中所限定的实施方式解决了本发明的问题。
令人吃惊地，已经发现脯氨酸或例如顺式-4-羟基-L-脯氨酸的脯氨酸衍生物与优选针对肿瘤细胞抗原(受体)的抗体的抗癌配体的组合，能够用于治疗癌症或者似癌的疾病。已经发现了这些结合的协同效果。这些结合组合物有效抑制癌细胞的存活和/或生长，并且/或者全面抑制不期望的细胞生长。
本发明还提供了药物组合物，其含有结合抗肿瘤抗体的治疗有效量的脯氨酸或脯氨酸衍生物或它们的盐、酯、异构体或药物前体，还提供了采用所述化合物组合的治疗方法。特别的，本发明涉及通过给药结合抗肿瘤抗体的脯氨酸或脯氨酸衍生物或者它们的盐、异构体、酯或药物前体之一来治疗癌症的方法，其中，抗肿瘤抗体优选单克隆抗体或者双特异性抗体，脯氨酸或脯氨酸衍生物优选顺式-4-羟基-L-脯氨酸、4-羟基-1-甲基-脯氨酸、1-甲基-4-苯基氨基-羰基氧-脯氨酸或1-甲基-4-苯基氨基-羰基氧-脯氨酸。根据本发明可以被使用的其它优选脯氨酸是顺式-4-羟甲基-L-脯氨酸、反式-4-羟甲基-D-脯氨酸、反式-4-羟甲基-L-脯氨酸、反式-4-甲基-L-脯氨酸和顺式-3-氨基-L-脯氨酸或者任何它们相应的盐。根据本发明所使用的脯氨酸及其衍生物是熟知的化合物，其是商业上可以获得的。所使用的优选脯氨酸衍生物包括酯，特别是甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、丁酯或异丁酯。
在本发明优选实施方式中所使用的抗体是单克隆抗体，并选自含有Trastuzumab(Herceptin)、Cetuximab、Rituximab、Avastatin或EGFR-mAb的组。所使用的抗体是熟知并商业上可以获得的针对肿瘤抗原的抗体。
根据本发明，还可以使用双特异性抗体和/或多特异性抗体。
本发明还针对在已经出现多药物抗性时，通过给药上述抗肿瘤/抗癌药物和/或结合组合物来治疗癌症的方法。
因此，本发明提供了一种将脯氨酸或其异构体或其衍生物与针对癌抗原的抗体进行结合的方法，因此具有抑制异常细胞生长的能力，特别是能够抑制肿瘤细胞生长、并抑制血管生成和内皮细胞的血管化。
还主张了一种用于抑制异常细胞生长的试剂盒，其包括两种抗癌组合物的活性物质，特别是CHP、4-羟基-1-甲基-脯氨酸或者1-甲基-4-苯基氨基-羰基氧-脯氨酸或者它们的盐、异构体、酯或药物前体以及抗癌抗体。在试剂盒中，将所述脯氨酸或其衍生物或它们的盐、酯、异构体或药物前体存储在与抗癌抗体不同的容器中。还包括如何使用试剂盒每一部分的信息。通过将该药物组合物的两种活性物质分别放置，可以以不同的方式(同时或者依次)给药所述物质。
本发明还涉及一种修饰肿瘤细胞受体的方法，其中使用本发明的结合组合物或者脯氨酸或脯氨酸衍生物或它们的盐、酯、异构体或药物前体对肿瘤细胞在体外或者体内进行处理。
在描述本发明的组合物、制剂和方法之前，可以理解的是，本发明并不限于这里所描述的特定方法、组合物和细胞，因为这些方法、组合物和细胞当然可以变化。还可以理解的是这里所使用的术语只是为了描述特定的实施方式的目的，而不是为了限制在所附的权利要求中所描述本发明的保护范围。
在这里以及包括所附的权利要求中所使用的，单词的单数形式例如“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括其相应的复数形式，除非文中以其他方式明确说明。这样，例如参考“一种生物”还包括一种或者多种不同的生物，参考“一种细胞”还包括一种或者多种这样的细胞，参考“一种方法”包括本领域技术人员已知的相应的等价步骤，等等。
除非以其他方式说明，这里所使用的技术和科学术语在本发明中具有与本领域技术人员所通常理解的相同的意思。尽管与这里所描述的相似或者等价的方法和材料可以用于本发明的实施或者测试中，但下面所描述的是适合的方法和材料。这里提供的上面讨论的所有出版物、专利申请以及其他参考文献，只是因为它们公开于本申请的提交日之前。此处，没有成为是允许本发明不是在其在先发明所公开内容之前的。此处以其全部引入了这里所提到的所有出版物、专利申请以及其他参考文献作为参考，包括所有的图表和附图。
在说明本发明之前，提出后面将使用的某些术语的定义对其理解是有帮助的。
为了本发明目标的“患者”包括人类和其他动物，特别是哺乳动物以及其他生物。这样所述方法可以用于人类的治疗以及兽医的应用。在优选的实施方式中，患者是哺乳动物，最优选的是人类。
术语“动物”涉及具有封闭的血管循环系统的生物，并包括鸟类、哺乳动物以及鳄鱼。这里所使用的术语“动物”还包括人类对象。
术语“血管生成”涉及新生血管产生入细胞、组织、器官或肿瘤内。
术语“转移”涉及肿瘤细胞扩散入身体较远部分的过程。此处所使用的该术语还涉及通过转移过程发展的肿瘤。
此处所使用的术语“接触”可以与下列交换使用结合、加入、混合、通过、孵育、流经等。而且，本发明的所述化合物可以通过任何传统的方法进行“给药”例如此处所描述的经肠胃外、口服、局部和吸入给药路线。
这里所使用的术语“安全和有效量”涉及在以本发明的方法进行使用时，与合理的益处/风险比值相当的，产生期望治疗反映而没有不适当的副作用(例如毒性、发炎或者过敏反应)的组分的充分量。术语“治疗有效量”的意思是产生期望的治疗反应的本发明化合物的量。例如，有效延缓癌症、或者肉瘤或者淋巴瘤的发展、或者使癌减小或者不转移的量。安全和治疗有效的具体量将根据许多因素而变化，例如所治疗的病症的特定类型、患者的身体状况、被治疗的哺乳动物的类型、治疗的持续时间、一同治疗的类型(如果有)以及所采用的具体制剂和该化合物或其衍生物的结构。
“抗血管生成”量涉及有效压制、止住或抑制血管生成的化合物或组合物的量，或者达到改善与血管生成疾病相关的症状的量。其期望的结果是由临床医生或者有资格的观测者所记录的症状的主观减缓，或者在剂量的接受方面客观上可以确认的改进，或者内皮细胞的血管化的降低，或者血管生成率的降低。
术语“治疗癌症”、“治疗”等通常涉及在患有癌症的哺乳动物中的任何改善，其中所述改善可以被归于使用本发明的化合物进行的治疗。所述改善可以是主观或者客观的。例如，如果哺乳动物是人类，则患者可以注意到提高的活力或者生命力或者降低的痛苦，作为主观症状的改善、或者对治疗的反应。可以替换的是，临床医生可以基于物理检测、实验室参数、肿瘤标记物或者放射显影的发现注意到肿瘤体积或者肿瘤负载(tumor burden)的降低。临床医生可以观察到的用于检查对治疗的任何反应的某些实验室得到的结果包括测试的标准化例如白细胞记数、红细胞记数、血小板计数、红血球沉降速率以及各种酶水平。另外，临床医生可以观察到可以检测到的肿瘤标记物的降低。可以替换的是，可以使用其他的测试来评估客观的改善，例如超声波扫描图、核磁共振检测和正电子散射测试。
“抑制肿瘤细胞的生长”可以通过任何可以接受的、检测是否肿瘤细胞的生长已经被减缓或者减少的方法来进行评估。这包括直接观察和间接评估例如上述的主观症状或者客观迹象。
这样，将本发明的组合物给药给细胞。这里“给药”的意思是为细胞培养或者患者中的细胞给药治疗有效剂量的本发明的候选药物。这里，“治疗有效量”的意思是产生进行给药的效果的剂量。确切剂量将依赖于治疗的目的，并且可以被本领域技术人员通过使用已知的技术确定的。正如本领域已知的，根据与局部释放相对的全身释放、年龄、体重、全面体质(general health)、性别、饮食、给药时间、药物相互作用以及症状的严重程度进行调节是必要的，并可以被本领域技术人员通过通常的实验而确定。这里的“细胞”的意思是其中有丝分裂和减数分裂可以被改变的几乎所有的细胞。
因此，本发明涉及使用脯氨酸或或脯氨酸衍生物或其盐、酯、异构体或药物前体以及抗癌配体(优选抗体)在制备用于治疗细胞增殖失调的药物组合物中的应用。本发明的药物组合物可以含有一种或者多种药物上可以接受的佐剂、赋形剂、载体、缓冲剂、稀释剂和/或常规的药物辅助物质。以药物上可以接受的制剂进行给药本发明的结合组合物。本发明涉及任何药物上可以接受的制剂例如以大分子复合物、纳米颗粒、微球或者珠形式的合成或者天然聚合物，以及基于脂质的制剂包括水包油乳剂、胶团、混合胶团、合成膜囊以及重封闭红细胞。除了所述的组合物和药物上可以接受的聚合物，在本发明的方法中所使用的药物上可以接受的制剂可以含有其他药物上可以接受的载体和/或赋形剂。正如这里所使用的，药物上可以接受的载体包括任何和所有的生理上兼容的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌药物和抗真菌药物、等渗剂和延迟吸收的试剂等。例如，所述载体可以适合注射入血液中。赋形剂包括药物上可以接受的稳定剂和分解质。在另一个实施方式中，药物上可以接受的制剂包括基于脂质的制剂。在本发明的实施中可以使用任何已知的基于脂质的药物释放系统。例如多囊脂质体(MVL)、多层脂质体(multilamellarliposomes)(也被称作多层囊或MLV)、单层脂质体包括小单层脂质体(也被称作单层囊或SUV)和大单层脂质体(也被称作大单层囊或LUV)都可以被使用，只要能够建立被封装的本发明的结合组合物的持续不变的释放速率。在一个实施方式中，所述基于脂质的制剂可以是多囊脂质体系统。合成膜囊的组合物通常是磷脂的结合物，通常结合类固醇特别是胆固醇。也可以使用其他的磷脂或其他脂类。可以用于合成膜囊产品的脂类的例子包括磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇氨(phosphatidyl-ethanolaminos)、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。可以使用优选的磷脂，包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油和二油酰磷脂酰甘油。在另一个实施方式中，可以将含有本发明结合组合物的组合物加入或者注入到生物可吸附的基质中。另外，所述基质可以含有所述生物聚合物。本发明的适当生物聚合物还可以包括一种或者多种能够从下列所组成的组中选择的一种或者多种大分子胶原、弹性蛋白、纤粘连蛋白、玻璃粘连蛋白、层粘连蛋白、聚乙二醇酸、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸肝素、肝素、纤维蛋白、纤维素、胶质、多聚赖氨酸、海胆粘连蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白、桑椹胚粘着蛋白、双糖链蛋白聚糖、核心蛋白聚糖和右旋糖酐。将这些大分子配成生物聚合物是本领域中熟知的。在优选的实施方式中，在以治疗为目的为人类患者给药时，治疗性组合物不产生免疫。
本发明的治疗性组合物可以包括此处组分的药物上可以接受的盐。药物上可以接受的盐包括由无机酸例如盐酸或磷酸，或者有机酸例如乙酸、酒石酸、苦杏仁酸等所形成的酸加成盐(acid addition salt)。由脯氨酸和脯氨酸衍生物的自由羧基所形成的盐也可以衍生自无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、氢氧化钙和氢氧化铁、以及有机碱例如异丙胺、三甲基胺、2-乙基胺乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。生理上可以忍受的载体是本领域已知的。示范性的液体载体是无菌水溶液，其除了活性成分和水之外不含其他材料，或者以生理量的盐水中含有缓冲液例如在生理pH值的磷酸钠，或者都含有，例加磷酸缓冲的盐水。进一步，水性载体可以含有一种以上的缓冲液盐以及诸如氯化钠和氯化钾、右旋糖、丙二醇、聚乙二醇和其他的溶质。除了水以外，液体组合物还可以含有液相。这些额外液相的示范性例子包括甘油、植物油例如棉籽油、有机酯例如油酸乙酯和水-油乳化物。治疗性组合物含有本发明的组合物，通常以每重量总治疗组合物至少0.1重量百分比的组合物的量。重量百分比是本发明组合物与总组合物的重量比值。这样，例如0.1重量百分比是每100g总组合物有0.1g脯氨酸、其异构体、盐和片断以及抗癌配体。
术语“药物上可以接受的盐”涉及保持游离碱的生物效率和性能的那些化合物盐，其是通过与无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等的反应所获得的。药物上可以接受的盐包括碱金属盐例如钠盐和钾盐，碱土金属盐以及铵盐。
含有活性成分的药物组合物可以以适合口服应用的形式，例如作为药片、片剂、锭剂、水性悬浮液或油性悬浮液、可分散的粉末或者颗粒、乳剂、硬胶囊或软胶囊、或糖浆或酏剂。用于口服的组合物可以根据任何本领域已知的制备药物组合物的方法进行制备，并且这类组合物可以含有一种或者多种从由下列所组成的组中选择的试剂，以提供药物上优质和口味好的制剂甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。药片含有活性成分，其与适合制备药片的无毒的药物上可以接受的赋形剂混合。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化剂和分解剂例如玉米淀粉或褐藻酸；接合剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或云母。药片可以没有被涂覆，或者通过已知的技术进行涂覆以延缓在肠胃道中的分解和吸收，以进而提供更长时间持续不变的作用。例如可以采用时间延缓材料诸如单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯。也可以通过在美国专利No.4,256,108、4,166,452和4,265,874中所描述的技术对其进行涂覆以形成用于控释的渗透性治疗药片。药物组合物还可以或者可以替换地含有一种或者多种药物，在该组合物中其可以连接到修试剂上或者是游离的。事实上，任何药物都可以以与这里所描述的修试剂的结合进行给药，已达到下面所描述的各种目的。可以与修试剂进行给药的药物类型的例子包括止痛药、麻醉药、防心绞痛药、抗真菌药、抗生素、抗癌药(例如紫杉醇或丝裂霉素C)、抗炎药(例如布洛芬和茚甲新)、驱虫剂、抗抑郁病药、解毒剂、止吐药、抗组胺剂、抗高血压药、抗疟药、抗微管药(例如秋水仙碱或长春花属生物碱(vinca alkaloids))、抗偏头痛药、抗微生物药、抗精神病药物、退热药、杀菌剂、抗信号传导药(例如蛋白激酶C抑制剂或者胞内钙流动的抑制剂)、治风湿药、抗凝血酶药、抗结核药、止咳药、抗病毒药、食欲抑制剂、心脏病药物、化学依赖性药物、泻药、化学治疗药物、冠状动脉、脑部或外周血管扩张药物、避孕药、镇静剂、利尿剂、除痰剂、生长因子、激素类药物、催眠药、抑制免疫反应的药物、麻醉拮抗剂、副交感神经阻滞药、止痛药、刺激剂、类交感神经药物、毒素(例如霍乱毒素)、镇定剂和尿道抗感染药。
用于口服的制剂还可以作为硬胶质胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土，或者作为软胶质胶囊，其中活性成分与水或油性介质混合例如花生油、液体石蜡或橄榄油。
水悬浮液含有与适合制备水悬浮液的赋形剂混合的活性材料。这类赋形剂是悬浮剂例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟基-丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮藻酸钠、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或湿润剂可以为天然出现的磷脂例如卵磷脂、或亚烃基氧化物与脂肪酸的缩合产物例如聚氧乙烯硬脂酸酯、或乙烯氧化物与长链脂肪醇的缩合产物例如十七乙烯基氧十六烷醇、或者乙烯氧化物与衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯的缩合产物(例如聚氧乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的缩合产物)例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。水悬浮液还可以含有一种或者多种防腐剂例如安息香酸乙酯或安息香酸正丙酯、对羟基安息香酸酯、一种或者多种着色剂、一种或者多种调味剂以及一种或者多种甜味剂例如蔗糖或糖精。
可以通过将活性成分悬浮在植物油例如落花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中或矿物油例如液体石蜡中来制备油性悬浮液。油性悬浮液可以含有增稠剂例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂例如上面所提出的，以及调味剂来提供口味好的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸来进行保存。
适合通过加入水制备水悬浮液的可分散的粉末和颗粒提供与分散剂或湿润剂混合的活性成分。适当的分散剂或湿润剂以及悬浮剂的例子是也可以存在例如甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物组合物还可以是水包油乳化物的形式。油相可以是植物油例如橄榄油或落花生油或矿物油例如液体石蜡或这些的混合物。适当的乳化剂可以是天然出现的胶例如阿拉伯胶或黄蓍胶、天然出现的磷脂例如大豆(soya bean)、卵磷脂和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯/部分酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯，和所述部分酯与乙烯氧化物的缩合产物例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。该乳化物还可以含有甜味剂和调味剂。
可以使用甜味剂配制糖浆和酏剂，例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖。这类制剂还可以含有镇痛剂、防腐剂、调味剂和着色剂。该药物组合物还可以是无菌的可注射的水性悬浮剂或油性悬浮剂的形式。根据现有技术使用上面所述的适当的分散剂或湿润剂和悬浮剂可以配制这种悬浮物。无菌的可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射的溶液或悬浮液的形式，例如作为1，3-丁二醇中的溶液。在这些可以接受的媒介和溶剂中，可以采用的是水、Ringer溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的非挥发油通常被用作溶剂或者悬浮介质。为了这个目的，可以采用任何温和的非挥发油包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸例如油酸可以在制备可注射制剂中使用。
为了对患者进行给药，本发明的活性物质被与药物上可以接受的载体或者稀释剂根据通常程序进行混合。通过静脉内灌输或皮下注射进行给药治疗制剂。如果期望，该制剂还可以含有其他的治疗药物。
在治疗上述病症中规定为每天每千克体重大约0.05mg～大约140mg的剂量水平是有用的(每天每患者大约2.5mg～大约7g)。例如，可以通过给药每天每千克体重大约0.01mg～50mg的化合物有效地治疗炎症(每天每患者大约0.5mg～大约3.5mg)。可以与载体材料结合以产生单一剂型的活性成分的量将依赖于所处理的主体以及给药的具体模式而变化。例如用于人类口服给药的制剂可以在总组合物的大约5％～大约95％变化。单元剂型通常含有大约1mg～大约500mg的活性成分。然而，可以理解的是，对于任何特定患者的具体剂量水平会根据各种因素而变化，包括所采用具体化合物的活性、年龄、体重、全面体质(general health)、性别、饮食、给药时间、给药路线、排泄速率、药物结合以及经历治疗的特定疾病的严重程度。根据本发明的化合物的有效剂量的量将根据许多因素而变化，包括具体化合物、毒性和抑制活性、所治疗的病症以及该化合物是单独给药还是结合其他治疗。通常有效的剂量在大约0.0001mg/kg体重～大约1500mg/kg体重的范围内，更优选1～1000mg/kg体重，更加优选大约1～150mg/kg体重，最优选大约50～100mg/kg体重。本发明还涉及一种治疗上述疾病病症的过程或方法。本发明的化合物可以对需要这类治疗的温血动物例如人进行给药以用于预防或者治疗，优选以有效抵抗上述紊乱的剂量，其中该化合物优选以药物组合物的形式进行使用。
药物上可以接受的赋形剂和载体溶液的配制对于本领域技术人员是熟知的，正如开发适当的剂量和治疗方案以在各种治疗方案中使用这里所描述的特定组合物，治疗方案包括例如口服、非经肠胃、经静脉内、经鼻内和经肌肉给药和制剂。
A.口服释放在某些应用中，这里所公开的药物组合物可以通过口服给药进行释放。同样的，这些组合物可以与惰性稀释剂或者与能被吸收的可使用载体进行配制，或者他们可以被封闭在硬壳胶质胶囊或软壳胶质胶囊中，或者他们可以被压成药片、或者他们可以直接被加入到饮食的食物中。
甚至，活性化合物中可以加入赋形剂并以可吸收的药片、口含片、片剂、胶囊、酏剂、悬浮物、糖浆、薄片等形式进行使用。药片、片剂、药丸、胶囊等还可以含有下列粘结剂例如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或胶质；赋形剂例如磷酸二钙；分解剂例如玉米淀粉、土豆淀粉、褐藻酸等；润滑剂例如硬脂酸镁；以及甜味剂例如蔗糖、乳糖或糖精可以被加入，或者调味剂例如薄荷油、鹿蹄草油或者樱桃调味剂。如果单元剂型是胶囊，则除了上述类型的材料外，其可以含有液体载体。可以存在各种其他材料作为涂层，或者以其他方式修饰剂量单元的物理形状。例如药片、药丸或者胶囊可以被覆盖虫胶、糖或者两者。酏剂的糖浆可以含有活性化合物蔗糖作为甜味剂，尼泊金甲酯或尼泊金丙酯作为防腐剂，染料和调味剂例如樱桃味或者桔子味。当然，在制备任何剂量单元中所使用的任何材料都应当是药物纯的，并实质上在所采用的量时无毒。另外，所述活性化合物可以被加入到缓释制备物和制剂中。
通常，这些制剂含有至少0.1％的本发明的活性化合物或者更多，尽管活性成分的百分比当然会变化，但通常会在总制剂的重量或体积的大约1或2％～大约60％或70％或者更多之间。自然，在可以制备的每种治疗中可以使用的组合物中活性化合物的量，是以一种在任何给定的化合物单元剂量中得到适当剂量的方式。制备这类药物制剂的本领域技术人员将考虑到诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、给药路线、保质期以及其他药物上需要考虑的因素，同样的各种剂量和治疗方法可以是合适的。
可以替换的，对于口服给药，本发明的组合物可以加入一种或者多种赋形剂，以漱口水、牙粉、口含片、口腔喷雾或者舌下口腔给药的制剂的形式。例如，可以将所需量的活性成分与适当溶剂例如硼酸钠溶液(Dobell溶液)相结合来制备漱口水。可以替换的是，可以将活性成分加入到口腔溶液中例如含有硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的口腔溶液，或者分散在牙粉中或者以治疗有效的量加入到组合物中，其中该组合物可以含有水、粘结剂、研磨剂、调味剂、起泡剂和保湿剂。可以替换的是，该组合物可以是药片或者溶液的形式，其可以被置于舌下或者以其他方式溶解在嘴中。
B.可注射的释放在某些情况下，期望经肠胃外、经静脉内、经肌肉或者甚至经腹膜释放这里所公开的药物组合物。在水中，适当地与表面活性剂例如羟丙基纤维素进行混合，可以制备作为游离碱或者作为药物上可以接受的盐的活性化合物的溶液。还可以在甘油、液态聚乙二醇及其混合物以及在油中制备分散液。在通常的存储和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。
适合可注射应用的药物形式包括无菌水溶液或者分散液以及无菌粉末，用于无菌可注射溶液或分散液的临时制剂。在所有的情况中，该剂型必须是无菌的，并且必须是可流动的达到容易的注射的程度。其在制备和存储的条件下必须是稳定的，并且必须被防腐，以防止微生物例如细菌和真菌污染发生。载体可以为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适当的混合物和/或植物油。可以保持适当的流动性，例如通过使用涂层例如卵磷脂，在分散液的情况下维持所需的颗粒尺寸，以及通过使用表面活性剂。通过各种抗细菌和抗真菌药物来防止微生物活动，例如对羟基苯甲酸酯类(parabens)、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等。在许多情况中，优选的是含有等渗试剂例如糖或氯化钠。通过在组合物中应用延缓吸收的试剂例如单硬脂酸氨和胶质能够引起可注射组合物的延长的吸附。
对于在水溶液中经肠胃外给药，例如该溶液应该是被适当缓冲的(如果必要)，并且该液体稀释剂首先使用充分的盐水或葡萄糖保持等渗。这些特定的水溶液对于经静脉内、经肌肉、经皮下和经腹膜给药特别适合。关于这一点，可以采用的无菌水介质对于本领域技术人员根据本发明的公开将是已知的。例如，一种剂量可以被溶解在1ml等渗NaCl溶液中，或者被加入到1000ml皮下输液液体中或者在设计的灌输处进行注射。根据治疗的对象的情况将出现某些必要的剂量变化。在任何情况下，负责给药的人将确定个体对象的适当剂量。而且，对于人类给药，制剂应该符合国家或者地区生物标准部门所要求的无菌、致热性以及整体安全性和纯度标准。
通过将在具有各种上述列举的成份的适当溶剂中加入所需量的活性化合物，接着进行过滤灭菌来制备无菌的可注射溶液。通常，分散液是通过将各种无菌的活性成份加入到含有基础分散介质以及其它上面所列举的成份的无菌载体中制备的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制剂方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成份的粉末加来自前面其过滤灭菌溶液的任何额外的期望成份。
这里所公开的组合物可以被配制为中性或者盐的形式。药物上可以接受的盐包括酸加成盐(通过蛋白质的自由氨基形成的)，以及通过无机酸例如盐酸或磷酸形成的，或者通过有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等形成的。通过自由羧基形成的盐还可以衍生自无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、氢氧化钙和氢氧化铁以及有机碱例如异丙胺、三甲基胺、组氨酸、普鲁卡因等。配制之后，溶液将以与剂型适合的方式以及治疗有效的量进行给药。这些制剂能够以不同的剂型进行给药例如可注射的溶液、药物释放胶囊等。
这里所使用的“载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、载体、涂层、稀释剂、抗细菌药物和抗真菌药物、等渗剂和延迟吸收的试剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶体等。这类介质和试剂的在药物活性物质的应用是本领域已知的。除了任何与活性成份不兼容的任何传统介质或试剂外，可以预计其在治疗性组合物中的应用。还可以将辅助性活性成份加入到组合物中。
术语“药物上可以接受”涉及在对人类进行给药时，不产生过敏或者类似不利反映的分子部分或组合物。含有蛋白质作为活性成份的含水组合物的制备是本领域熟知的。通常，这样的组合物被制备为可以注射的液体溶液或者悬浮液；还可以制备适合在注射前溶解或者悬浮在液体中的固体形式。该制剂也可以被乳化。
C.经鼻释放在某些实施方式中，药物组合物可以通过鼻内喷射、吸入和/或其它气雾剂释放载体进行释放。类似的，使用鼻内微粒树脂和溶血磷脂酰甘油化合物的药物释放也是药物领域中熟知的。
D.脂质体、纳米胶囊和微颗粒介质的释放在某些实施方式中，发明人设计了脂质体、纳米胶囊、微颗粒、微球、液体颗粒、载体等在将本发明的组合物导入适当的寄主细胞中的应用。特别是，本发明的组合物可以被配制为封装在脂质颗粒、脂质体、载体、纳米球或纳米颗粒等中来释放。
这类制剂可以优选用于使用这里所公开的药物上可以接受的结合-组合物或者构成的制剂。脂质体的形成和应用通常是本领域技术人员已知的。最近，脂质体被开发为具有改进的血清稳定性和循环半衰期(Gabizon和Papahadjopoulos，1988)。而且，已经对各种脂质体和脂质体类制剂作为潜在药物载体的制备方法已经进行了综述(Takakura，1998；Chandran等人，1997；Margalit，1995；美国专利No.5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868和5,795,587，在此将每一份都特别地全部引入，作为参考)。除了脂质体的特征外，在结合的化合物中重要的确定因素是化合物自身的物理化学特征。将极性化合物结合入含水的空间中，而非极性化合物结合到囊的脂双层上。通过渗透或者在双层被破坏时，释放极性化合物，但非极性化合物仍保持与双层结合，除非其被温度或者暴露到脂蛋白而被破坏。两种类型在相转化温度下都表现出了最大流出速度。脂质体通过四种不同的机制相互作用通过网状内皮系统的吞噬细胞例如巨噬细胞和中性粒细胞的内吞作用；吸附到细胞表面，通过非特异性的弱疏水力或静电力，或者通过与细胞表面组分的特异性相互作用；与血浆细胞膜融合，其通过脂质体的脂双层插入到血浆膜，同时脂质体的内含物被释放到细胞质中；以及通过脂质体脂转移到细胞膜或亚细胞膜，或者相反，而没有结合脂质体内含物。通常困难的是确定何种机制是有效的，并且同时可以运行一种以上。
经静脉内注射的脂质体的命运和分配依赖于他们的物理性质例如尺寸、流动性和表面电荷。它们可以保持在组织中几小时或者几天，这依赖于他们的组合物，在血液中的半衰期在几分钟到几小时的范围内。较大的脂质体例如MLV和LUV被网状内皮系统的吞噬细胞所快速吸收，但循环系统的生理学抑制了这类大分子在大部分位点的离开。他们只有在毛细管内皮中存在大开口或者大孔的地方(例如肝脏或者脾脏的窦)才能离开。这样，这些器官是摄入的主要位点。另一方面，SUV表现出了较宽的组织分配，但仍大量保留在肝脏和脾脏。通常，这种体内行为将脂质体的靶向能力限制到仅有的这些可以接受其大尺寸的器官和组织。这些包括血液、肝脏、脾脏、骨髓和淋巴组织。
在本发明中，靶向通常不是限制。然而，如果期望特异性的靶向，则可以使用完成此目的的方法。抗体可以用于结合到脂质体表面，并指导该抗体和其药物内含物到达位于特定细胞类型表面的特异抗原受体。也可以使用糖类决定簇(在细胞间识别、相互作用和粘附中发挥作用的糖蛋白或糖脂类细胞表面组分)作为识别位点，因为他们具有指导脂质体到达特定细胞类型的能力。大多数情况下，可以预期的是可以使用经静脉内注射脂质体制剂，但也可以设想其它的给药途径。
可以替换的是，本发明提供了本发明组合物的药物上可以接受的纳米胶囊制剂。通常，纳米胶囊能够以稳定和可再生的方式包入化合物(Henry-Michelland等人，1987；Quintanar-Guerrero等人，1998；Douglas等人，1987)。为了避免由于细胞内聚合物超载的副作用，这类超细颗粒(大约0.1.mu.m)应该被设计使用能够在体内降解的聚合物。在本发明中设想了使用符合这些要求的生物可降解聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒。
被治疗的对象通常包括哺乳动物，并优选是人类对象，例如人类癌症对象。本发明的化合物可以被单独使用或者结合使用。另外，被处理过的化合物可以用于其它类型的治疗例如癌症治疗。例如，对象化合物可以与其它的化学治疗例如它莫西芬、紫杉醇、甲氨蝶呤、生物制剂例如抗体、生长因子、淋巴因子或射线等共同使用。结合治疗可以达到协同的结果。优选的标志是癌症，优选之前所鉴定的癌症。
这里所提供的组合物和方法对于治疗包括实体肿瘤例如皮肤癌、乳腺癌、脑癌、宫颈癌、睾丸癌等的癌症特别有用。更特别的是可以被本发明的组合物和方法治疗的癌症包括但不限于心脏肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和脂肪肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸形瘤；肺支气管癌(鳞状上皮细胞、未分化小细胞、未分化大细胞和腺癌)、肺泡(支气管)癌、支气管腺癌、肉瘤、淋巴瘤、软骨瘤、错构瘤和间皮瘤；肠胃食管(鳞状上皮细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺(导管腺癌、胰岛瘤、高血糖素瘤、促胃液素瘤、类癌瘤、VIP肿瘤)、小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、Karposi瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、肠管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)；泌尿生殖器道肾(腺癌、Wilm肿瘤[肾母细胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道(鳞状上皮细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睾丸(精原细胞瘤、畸形瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间隙细胞癌、纤维瘤、纤维性瘤、腺瘤肿瘤、脂肪瘤)；肝肝细胞瘤(肝细胞癌)、胆管细胞癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤；骨成骨肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、Ewing肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞肿瘤脊索癌、软骨瘤(软骨外渗osteocartilaginous exostoses)、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞肿瘤；神经系统头骨(骨瘤、血管瘤、肉芽瘤、黄瘤、畸形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑脊膜瘤(meningiosarcoma)、胶质瘤)、脑(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室鼓膜瘤、胚生殖细胞瘤[松果体瘤]、多行性胶质细胞瘤、少枝胶质细胞瘤、神经鞘瘤、眼癌、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；妇科子宫(子宫内膜癌)、宫颈(宫颈癌、肿瘤前宫颈异常)、卵巢(卵巢癌[浆液性囊腺癌、粘液性囊腺瘤、未分类的癌]、粒细胞-膜细胞肿瘤、Sertoli-Leydig细胞肿瘤、无性细胞瘤、恶性畸形瘤)、外阴(鳞状上皮细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑色素瘤)、阴道(透明细胞癌、鳞状上皮细胞癌、葡萄簇肉瘤(胚胎横纹肌肉瘤]、输卵管(癌)；血液病血液(骨髓白血病[急性和慢性]、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、Hodgkin疾病、非Hodgkin淋巴瘤[恶性淋巴瘤]；皮肤恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状上皮细胞癌、Karposi肉瘤、胎记发育异常痣(moles dysplasticnevi)、脂肪瘤、血管瘤、真皮纤维瘤、瘢痕瘤、牛皮癣；和肾上腺成神经细胞瘤。因此，这里所提供的术语“癌细胞”包括患有任何一种上述病症的细胞。
因此，这里所使用的“癌症”涉及在哺乳动物中发现的所有类型的癌、瘤或恶性肿瘤，其包括癌和肉瘤。癌症的例子是脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和成神经管细胞瘤。
术语“白血病”广泛地涉及形成血液的器官的恶性疾病，通常其特征是白细胞及其在血液和骨髓中的前体紊乱的增殖和发育。临床上通常基于如下将白血病进行分类(1)急性疾病或慢性疾病的持续时间和特征；(2)所参与细胞的类型；骨髓的(骨髓性)、淋巴的(淋巴性)或单核细胞的；以及(3)在血液-白血病或非白血病(亚白血病)中异常细胞数目的提高和非提高。P388白血病模型被广泛接受为可以体内预测抗白血病活性。相信在P388检验中测试阳性的化合物将通常表现出体内的某些抗白血病活性水平，而不管所治疗的白血病的类型。因此，本发明包括治疗白血病的方法，优选治疗下列的方法急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、成熟T细胞白血病、非白血病型白血病(aleukaemic leukaemia)、白血病型白血病、嗜碱粒细胞增多性白血病、原始血细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞白血病、白血病皮肤(leukaemiacutis)、胚胎白血病、嗜曙红细胞白血病、Gross白血病、发细胞白血病、成血细胞白血病、血胚细胞白血病、组织细胞白血病、干细胞白血病、急性单细胞白血病、白细胞减少白血病、淋巴腺白血病、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴白血病、淋巴白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、微成髓细胞白血病、单细胞白血病、成髓细胞白血病、髓细胞白血病、骨髓粒细胞白血病、髓样单核细胞白血病(myelomonocytic leukaemia)、Naegeli白血病、血浆细胞白血病、浆细胞白血病、早幼粒细胞白血病、Rieder细胞白血病、Schilling白血病、肝细胞白血病、亚白血病型白血病以及未分化细胞白血病。
术语“肉瘤”通常涉及由类似胚胎结缔组织的物质所构成的肿瘤，并通常含有紧密压缩的被包含在纤维状或同类物质之内的细胞。可以使用本发明的结合组合物并可选择地使用增效剂和/或化学治疗药物进行治疗的肉瘤包括软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy肉瘤、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色白血病肉瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、Wilms肿瘤肉瘤、子宫内膜肉瘤、基质肉瘤、Ewing肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、Hodgkin肉瘤、先天性多色素出血性肉瘤(idiopathic multiple pigmentedhemorrhagic sarcoma)、B细胞的成免疫细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞的成免疫细胞肉瘤、Jensen瘤、Kaposi瘤、Kupffer细胞肉瘤、血管肉瘤、白色肉瘤、恶性间质肉瘤、骨旁肉瘤、网织红细胞肉瘤、Rous肉瘤、桨液性囊肿肉瘤(serocystic sarcoma)、滑液肉瘤和血管扩张型肉瘤。
术语“黑色素瘤”是为了表示从皮肤和其他器官的黑色素细胞系统产生的肿瘤。可以使用所述结合组合物和可选择地使用增效剂和/或其他化学治疗药物进行治疗的黑色素瘤包括肢端型黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、良性青少年黑色素瘤、Cloudman黑色素瘤、S91黑色素瘤、Harding-Passey黑色素瘤、青少年黑色素瘤、恶性小痣黑色素瘤、恶性黑色素瘤、结节型黑色素瘤、甲下黑色素瘤，以及表面扩展的黑色素瘤。
术语“癌”涉及由倾向于渗透入周围组织进而引起扩散的上皮细胞所构成的恶性新生物。可以使用所述结合组合物和可选择地使用增效剂和/或化学治疗药物进行治疗的典型的癌包括例如腺泡癌、泡状癌、腺囊肿癌、腺样囊性癌、腺瘤癌、肾上腺皮层癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基质细胞癌(carcinoma basocellulare)、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡细胞癌、细支气管癌、支气管原癌、脑形癌、胆管细胞癌、绒毛癌、胶样癌、粉刺癌、主体癌(corpus carcinoma)、筛状癌、胸甲状癌(carcinoma encuirasse)、皮肤癌、柱状细胞癌、圆柱状细胞癌、管癌、硬质癌(carcinomadurum，)、胚胎性癌、脑样癌、类上皮癌、上皮腺样癌、外发性癌、无溃烂癌(carcinoma ex ulcer)、纤维样癌(carcinoma fibrosum)、凝胶状(gelatinifomi)癌、类凝胶(gelatinous)癌、巨细胞癌、巨细胞样癌(carcinoma gigantocellulare)、腺状癌、粒层细胞癌、发基质癌、血样癌、肝细胞癌、Hurthle细胞癌、透明质癌、透明细胞癌、幼稚型胚胎细胞癌、原位癌，内皮细胞癌、上皮内细胞癌、Krompecher癌、Kulchitzky细胞癌、大细胞癌、豆状癌、豆样癌(carcinomalenticulare)、脂肪瘤癌、淋巴上皮癌、癌骨髓、骨髓癌、黑色素癌、软癌(carcinoma molle)、粘质癌、粘液状癌、粘膜细胞癌、粘膜上皮细胞癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液样(mucous)癌、粘液瘤、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化癌(carcinoma ossifican)、类骨(osteoid)癌、乳头状癌、门静脉周围癌、扩散前癌、棘细胞癌、软糊状癌、肾的肾细胞癌、储备细胞癌、恶性肿瘤癌、乳头状瘤癌、硬癌、阴囊癌，印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、螺丝管状癌、类球体细胞癌、纺锤型细胞癌、海绵体癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、线状癌、毛细血管扩张癌(carcinoma telangiectaticum)、毛细血管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、结节性癌(carcinoma tuberosum)、结节癌(tuberous carcinoma)、阴茎疣状癌和绒毛癌(carcinoma villosum)。
可以使用本发明的组合物进行治疗的其它癌症包括例如Hodgkin病、非Hodgkin淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰腺癌(malignant pancreatic insulanoma)、恶性类癌瘤、单一性膀胱癌、前恶性皮肤病变、睾丸癌、淋巴癌、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和前列腺癌。
本发明涉及脯氨酸或脯氨酸衍生物或它们的盐、酯、异构体或药物前体用于提高和/或优化抗癌抗体结合到肿瘤抗原和/或细胞受体的应用。因此，本发明的另一个目的是一种提高抗体靶选择性的方法，其中该靶被在体外或体内使用本发明的结合组合物或使用脯氨酸或脯氨酸衍生物或它们的盐、酯、异构体或药物前体进行处理。
本发明中所描述的药物被认为具有下列目标■优化细胞受体以抗体结合到肿瘤抗原■促进/提高细胞循环进程的抑制■加速细胞的最终分化或调亡■降低依赖抗体的细胞毒性(ADCC)■激活酪氨酸激酶抑制剂■提高肿瘤细胞对细胞因子例如肿瘤坏死因子的灵敏度■提高抗体和/或化学治疗和/或抗肿瘤药物在患者中的抗肿瘤反应。这将导致达到更高的抗体和/或化学治疗和/或抗肿瘤药物的治疗效率，以及降低不利事件，并提高患者的生活质量。
这里所包含的说明书的概述包括本领域技术人员通过考虑下面的定义可以理解的多个术语术语“抗体”涉及由免疫系统的细胞产生的蛋白质，其结合到被身体识别为不是其自身正常组织一部分的某些化学制品。抗体辅助身体抵御感染甚至癌症。
单克隆抗体(mAb)是抗体的特殊类型，其能够在实验室中大量产生。Trastuzumab(Herceptin)是第一个用于治疗患有乳腺癌的女性的单克隆抗体药物。其通过阻止HER2/neu蛋白质免于促进过多的乳腺癌细胞的过多生长，并还可以有助于免疫系统抵抗癌症。
在临床试验中被检测的识别HER2/neu的其它单克隆抗体是阻断乳腺癌细胞其它生长促进分子的单克隆抗体。已经被设计为直接针对肿瘤的引导免疫系统细胞、化学治疗药物或者放射治疗的单克隆抗体也被测试。
单克隆抗体结合到在人类细胞表面发现的并在细胞生长调节中发挥作用的特异性蛋白上，例如Herceptin结合到被称作HER2的蛋白上。在实验室试验中，Herceptin通过其结合作用抑制肿瘤细胞的生长。在转移的乳腺癌细胞的情况中，大约80％的肿瘤产生过量的HER2。
抗体可以单独用于杀死癌细胞，或者作为也用于诊断目的治疗的其它物质的载体。例如化学治疗药物可以被结合到单克隆抗体上以直接为肿瘤细胞释放高浓度的这些毒性物质。理论上，该方法是比传统的化学治疗有较少毒性和更高效率，因为其减少了将有害的药物释放给正常组织。
在诊断过程中，单克隆抗体可以用于将放射性物质传递给身体内的癌细胞，这样确定了之前通过其它方法检测不到的转移位置。
单克隆抗体的潜在副作用可能包括呼吸困难(气短)和轻微的哮喘、发烧、头痛、皮疹、恶心和呕吐、心动过速、(心跳快)和/或过敏反应。
包括顺铂、卡铂、紫杉醇、5FU等的所有化学治疗药物都是高度毒性的，并且通常难以忍受。化学治疗药物的潜在副作用可能包括血液毒性例如血小板减少、白血球减少、贫血，非血液毒性例如肾脏毒性、耳毒性、神经毒性和呕吐、注射位点综合症、败血症，心血管影响例如低血压和心搏徐缓、腹泻、粘膜炎，皮肤影响例如秃头症，呼吸影响例如间质性肺炎、肺部纤维化和肺栓塞，代谢/营养影响例如体重减少、外周水肿和/或脱水。
本发明名的关键概念可以总结如下■本发明涉及脯氨酸或脯氨酸衍生物或它们的盐、酯、异构体或药物前体用于提高和/或优化抗体结合到肿瘤抗原和/或细胞受体的应用。
■因此，本发明的另一个目的是一种提高抗体靶选择性的方法，其中该靶被在体外或体内使用本发明的结合组合物或使用脯氨酸或脯氨酸衍生物或它们的盐、酯、异构体或药物前体进行处理。
■本专利的结合组合物、化合物以及治疗方法的应用的主要目的和优点是降低抗体的给药量，和/或提高所给药抗体和抗肿瘤药物的治疗效率，和/或降低所给药抗体的毒性副作用，其将达到提高和改进接受治疗的的癌症患者的生活质量。
下面的总结将解释在复合作用中参与的细胞外信号传导分子/细胞表面受体、抗体和脯氨酸衍生物的可能的不同功能和作用模式。
细胞外信号传导分子/细胞表面受体■细胞外信号传导分子是由信号传导细胞合成和释放的，并只在具有信号传导分子的受体的靶细胞中产生特异性反应。在多细胞生物中，在这种类型的细胞间通信中使用大量的化学制品包括小分子(例如氨基酸或脂类衍生物、乙酰胆碱)、肽和蛋白质。
■七类主要的细胞表面受体是■蛋白质偶联的受体■细胞因子受体■受体酪氨酸激酶■TGF受体■Hedgehog(Hg)受体■Wnt受体■Notch受体■细胞外信号传导分子调节单细胞器官之间的相互作用，并是多细胞器官的生理和发育中关键的调节物。
■细胞外信号传导分子结合到细胞表面受体会引发最终调节细胞代谢、功能或基因表达的细胞内信号传导通路。
■外部信号包括锚定在膜上和分泌的蛋白质和肽、小亲脂分子(例如类固醇激素、甲状腺素)、衍生自氨基酸的小亲水分子(例如肾上腺素)、气体(例如一氧化氮)和物理刺激(例如光)。
■来自一个细胞的信号能够对附近的细胞(旁分泌)、远处的细胞(内分泌)或者对信号传导细胞自身(自分泌)发挥作用。
■受体以显著的特异性与配体结合，其通过配体与受体蛋白质中特异的氨基酸之间的非共价相互作用来确定。
■细胞对特定配体的最大反应通常发生在大部分受体仍没有被占据的配体浓度时。
■通过细胞外信号的通信通过包括下列步骤由信号传导细胞(1)合成和(2)释放信号传导分子；(3)将信号传递给靶细胞；(4)特异的受体蛋白结合信号，这导致其激活；(5)活化的受体起始一种或者多种细胞外的信号传统通路；(6)细胞功能、代谢和发育的特异性改变；以及(7)去除信号，这通常结束细胞反应。大部分的受体是通过结合分泌的或结合在膜上的分子而被激活的(例如激素、生长因子、神经递质和外激素)。然而，某些受体是通过改变代谢物(例如氧或营养物)的浓度或者通过物理刺激(例如光、接触和热)而被激活的。
mAb、bs-Ab和多克隆抗体■脯氨酸或脯氨酸衍生物或和它们的盐、酯、异构体和药物前体优化和/或提高mAb对细胞受体的靶选择性。与正常的相似，这些抗体是结构复杂的多功能大分子。它们的活性中的某些但不是全部依赖于特异性抗原结合位点的互补决定区。
■在针对信号传导分子时，诸如CD20、c-erbB-2/HER-2和EGFR、mAb可以表现出竞争或者拮抗行为。换句话，它们能够表现出“去除”和/或“关闭”它们的靶抗原，这导致抗增殖作用。
■所以，即使考虑到mAb的直接作用，清楚的是由抗原、抗体和细胞环境所决定的可能的反应的多样性。
■患者的个体反应是多种因素的和，其包括靶抗原的表达(以及如果前者失活可能补充的其它信号传导分子)、Ig(免疫球蛋白)或者免疫复合体的循环水平以及它们效应细胞的功能状态。
■主体免疫反应也可以通过使用双特异性抗体(bs-Ab)而被诱导，在bs-Ab上，一个Fab臂识别肿瘤抗原以及在T细胞(CD3)或特异性FcγR的其它参与抗原决定簇。
■即使在肿瘤被预先选择为抗原阳性，也只有少数患者对使用mAb的治疗有反应。
脯氨酸衍生物顺式-4-羟基-L-脯氨酸(CHP)是人类内源化合物，其具有未知的生理功能。CHP的反式异构体在胶原和弹性蛋白中以高浓度出现，因此其对于结缔组织的合成和结构是重要的。曾经在从健康志愿者和癌症患者所收集的血浆和尿样中确定了CHP的内源浓度。使用高剂量的口服CHP处理的癌症患者表现出了血浆中的高浓度CHP和反式-4-羟基-L-脯氨酸(THP)。这些结果说明CHP和THP可以具有还未被阐明的相应生理作用。
基于讨论细胞外信号传导分子、细胞表面受体、mAb、bs-mAb和多克隆抗体中所提到的概念，以及基于下面所提供的结果，吃惊地发现CHP、4-羟基-1-甲基-脯氨酸、1-甲基-4-苯基氨基-羰基氧-脯氨酸以及上面所述的其他脯氨酸衍生物(其是在本发明的观点和权利要求中所包含的脯氨酸衍生物)，其可以以令人吃惊地导致提高mAb和/或双特异性抗体(bs-Ab)和/或其他靶向特异肿瘤抗原例如EGFR的抗体的效率的特异性方法，可以引起细胞变化、修饰、细胞的产生和/或正常化和/或提高肿瘤细胞的聚集行为。
能够以不同的方案，使用抗体和/或药物试剂、药物以及任何成分(之前、同时或之后)进行给药脯氨酸、脯氨酸衍生物或它们的盐、酯、异构体或药物前体。能够以任何药物制剂例如灌输、注射、经肌肉、经皮下等进行给药本发明所描述的药物。
下面的实施例说明了用于研究脯氨酸衍生物对抗体的活性和效果的影响的实验结果。
这些实施例不限于本专利中的结合组合物和化合物和/或治疗的方法的应用。
实施例1.介绍研究了顺式-4-羟基-1-脯氨酸(CHP)和一些其衍生物结合Cetuximab、Rituximab、Avastatin和针对一组癌细胞系的特异性EGFR-抗体。
根据所描述的，进行MTT增殖测试。将未处理的细胞和CHP预处理的细胞的增殖对照设置为100％。
使用所有抗体，用作供给临床应用。以＞50倍的稀释使用该制剂。
2.材料和方法2.1细胞系除非特别说明，所有细胞系得自American Type Culture Collection(ATCC，Rockville，MD)并在潮湿的培养器(5％CO2，37℃)中的RPMI-1640碳酸氢盐培养基(Seromed，Berlin，Germany)中培养成铺满的单层。对细胞进行支原体污染。将该培养基补充10％热灭活的胎牛血清(Seromed)和4mM谷氨酰胺。通过胰蛋白酶处理，对细胞进行次培养(含0.02％EDTA的0.03％胰蛋白酶，每周3次)。使用TOA Sysmex微量细胞计数器(TOA，Tokyo，Japan)计算细胞数目。
2.2化学试剂和溶液除非特别说明，所有化学试剂均从Sigma(St.Louis，MO)获得。要被测试的化合物按照所提供的进行使用。在不同实施例中以所指出的浓度使用CHP、其衍生物和抗体。
2.3化学灵敏性检验将104细胞/孔分配入96孔微量滴定板(100μl培养基)，并以另外100μl体积，加入要检测的化合物。将所有化合物以三倍进行稀释，或者在大部分情况中以四倍进行稀释。在组织培养的条件下将板进行孵育4天，除了研究应用时间和反应之间关系的测试，并使用改良的MTT检验(通过线粒体的还原从四唑盐形成的甲 (formazane)染料；EZ4U，Biomedica，Vienna，Austria)来检测细胞存活力，其评定线粒体活性进而评定细胞存活力/细胞数目。简单的讲，将所补充的底物稀释在激活剂溶液中，并在每孔中加入20μl的该混合物2小时。使用空白孔作为参照，在微孔板读数器(Eurogenetics，Brussels，Belgium)中检测450nm处的光学密度。对于每种细胞系，将8个孔用于检测不含测试底物的培养基对照的MTT信号，并计算相对于被设定为100％的对照值，测试孔中的增殖。0.3～1.5光学密度之间的结果分别记录缓慢增殖和快速增殖的细胞。
实施例1细胞系A431和SW620的Cetuximab和增殖活性A431表皮样癌表现出显著的过表达表皮生长因子受体(EGFR；在我们试验中，与EGFR-阳性结肠癌细胞系相比大约20倍)。SW620chp4和A341chp4细胞代表在组织培养条件下使用400μg/mlCHP进行预处理5天的细胞(con＝未处理的对照；*＝显著不同)。
实施例1.1SW620con SW620chp4Cetuximab(μg/ml)100,5±4,398,5±3,250101,7±2,799,2±2,925100,2±4,098,6±2,612.5102,7±1,897,8±4,1*6.3101,8±2,192,7±0,6*3.2101,5±1,593,9±2,1*1.6


图1中描述了这些结果。
实施例1.2A431Con A431chp4 Cetuximab(μg/ml)92,3±2,498,4±4,6*5094,7±1,9101,1±2,8*2589,3±1,698,7±3,8*12.591,3±4,799,4±1,5*6.393,3±1,9101,9±3,4*3.289,5±2,692,6±9,1 1.6*＝显著不同图2中描述了这些结果。
结论SW620低表达EGFR的细胞系与CHP预孵育令人吃惊地导致Cetuximab在低浓度(1.6～6.3μg/ml)的更强的抑制活性。
A431过表达EGFR的细胞系将A431细胞与CHP预孵育(其降低EGFR的表达)令人吃惊地导致与Cetuximab的诘抗相互作用。
高表达EGFR-预孵育CHP→令人吃惊地降低Cetuximab的活性。
低表达EGFR-预孵育CHP→令人吃惊地造成Cetuximab的增强。
实施例2Cetuximab和细胞系Colo205和SW620的增殖活性以固定的浓度40μg/ml使用Cetuximab(C205cetu，SW620cetu)，CHP从400～6.3μg/ml变化以直接结合用于Colo205结肠癌和SW620结肠癌细胞(con＝未处理的对照；*＝显著不同)。
实施例2.1C205con C205cetuCHP9.9±0.412.7±1.5*40015.7±1.0 17.4±0.7*20045.5±3.2 41.1±0.8 10084.2±2.1 88.9±2.2*5094.4±6.2 97.8±7.3 2592.2±1.4 93.8±3.6 12.599.4±0.2 100.7±2.1 6.3图3中描述了这些结果。
实施例2.2SW620conSW620cetu CHP51.3±3.7 49.3±2.0 40069.9±2.6 67.8±1.1 20085.2±0.7 86.1±1.1 10091.9±4.1 98.8±8.7*5092.3±0.9 98.7±6.8*2598.7±3.0 110.1±5.0*12.599.5±0.4 104.5±7.0*6.3*＝显著不同图4中描述了这些结果。
结论令人吃惊地，CHP以较高的CHP浓度(50、200和400μg/ml)对Colo205细胞诘抗Cetuximab，而以较低的CHP浓度(6.3～50μg/ml)对SW620细胞诘抗Cetuximab。Colo205在细胞表面表达显著量的EGFR，而SW620似乎具有非常低的EGFR表达(未显示数据)。
CHP-Cetuximab的直接结合令人吃惊地表现出在细胞系colo205和SW620中的诘抗作用。
实施例3Cetuximab和细胞系HT29、WI38和DLD1(CHP预处理)的增殖活性使用更多的细胞系进行相似的实验，即HT29结肠癌细胞、WI38正常成纤维细胞和DLD1结肠癌细胞。使用200μg/ml CHP对细胞预处理5天，并使用稀度范围为40～1.3μg/ml的Cetuximab进行测试。
(*＝显著不同)HT29con HT29chp2 WI38con WI38chp296,9±1,1101,6±2,2*93,1±1,8110,5±6,1*100,3±2,4 102,5±4,6 91,8±3,8118,8±10,1**99,9±1,8103,5±1,1 87,1±5,0125,6±0,5*100,4±4,4 104,5±3,7 84,1±0,5116,0±2,5*97,6±8,8106,1±6,6 88,5±2,0117,9±1,1*96,6±7,390,1±3,8 94,7±0,9116,5±7,4*DLD1con DLD1chp293,4±5,2103,3±3,5*99,8±0,2108,7±15,1*98,1±4,9106,8±7,1109,3±6,8 107,1±8,1106,8±6,2 112,9±2,1102,7±1,1 91,7±9,5*结论依次结合令人吃惊地显示在WI38中以及以高浓度Cetuximab在HT29和DLD1中的拮抗作用。
实施例4Cetuximab以及细胞系C205的增殖活性(Cetuximab与CHP直接结合)
以两倍稀释将Cetuximab从40μg/ml稀释为1.25μg/ml，并以与400μg/ml的单克隆抗体的直接结合进行应用CHP(C205 comb)。(*＝显著不同)C205conC205comb CETUXIMAB100,1±4,6101,5±4,6 40103,1±3,0106,7±5,3 2099,1±3,2 100,8±5,8 10100,7±7,9108,6±0,7*5101,7±4,3113,9±11,3*2.5101,6±7,1101,2±2,8 1.2598,0±3,5 101,6±4,2 0.6104,2±6,8110,0±4,7 0.394,8±5,9 97,6±6,5 0.15图5中描述了这些结果。
结论通过直接结合Cetuximab，CHP令人吃惊地在低CHP浓度下(5和2.5μg/ml)具有拮抗作用，而以其他浓度，没有显著的相互作用。
实施例5Cetuximab和细胞系BxPC3和MIAPaCa2的增殖活性(与200μg/ml CHP预孵育)。
使用更多的细胞系进行与CHP预孵育的实验，即BxPC3和MIAPaCa2胰腺癌细胞。使用200μg/ml CHP将细胞进行预处理5天，并进行Cetuximab(40～1.3μg/ml)的测试。(*＝显著不同)BxPC3con BxPC3chp2 MIAcon MIAchp299,1±5,9 100,2±2,0104±6,8 106,2±18,2102,0±7,197,1±6,3 95,8±10,5 103,8±24,4107,4±14,6 92,3±4,7*93,7±3,3120,2±17,9*108,3±13,3 96,6±13,689,6±11 101,5±1,6*101,9±9,398,0±9,0 86,1±2,9105,0±13,6*91,6±0,5 85,1±3,9 70,4±3,880±17,2
结论令人吃惊地观察到了CHP-Cetuximab在MIAPaCa2中的拮抗相互作用。
实施例6Cetuximab以及在与CHP预孵育之后细胞系C205的增殖活性在将细胞与每种衍生物(A1.21、A1.23和A2.23)在组织培养中孵育5天后测试Colo205细胞对Cetuximab的灵敏度(50μg/ml)。(*＝显著不同)C205con A1.21 A1.23 A2.2397.9±11 101.4±2.1107.1±2.2101.6±5.995.9±6.399.4±2.1 107.05±2.5*107.6±5.5*96.5±9.9100.9±1.999.0±6.5 106.0±9.194.9±4.699.4±3.0 99.9±8.0 108.3±10.3*95.4±8.294.5±1.7 104.8±11.8 106.8±12.993.1±2.592.7±2.5 93.9±2.9 113.2±13.9*A1.21＝4-羟基-1-甲基-脯氨酸乙酯A1.23＝1-甲基-4-苯基氨基-羰基氧-脯氨酸乙酯A2.23＝1-甲基4-苯基氨基-羰基氧-脯氨酸异丁酯结论与这里所检测的三种衍生物的每一种对Colo205细胞预处理，令人吃惊地或者不改变细胞对Cetuximab的敏感性，或者是轻微拮抗。
实施例7Rituximab和在与CHP预处理后细胞系C205、CR02B和MIAPaCa-2的增殖活性在组织培养中使用400μg/ml CHP(chp4)对一组细胞系(即CRO2B类癌瘤细胞、MIAPaCa-2胰腺癌和Colo205结肠癌细胞)进行预处理5天，并暴露到Rituximab(160-5μg/ml)。(*＝显著不同)
CRO2BconCRO2Bchp4MIAcon MIAchp4105.3±14.6 97.1±1.797.1±1.293.5±1.8*97.1±2.9 93.5±2.295.8±0.590.8±0.1*95.5±3.5 93.1±1.295.5±2.491.1±0.6*92.8±2.7 94.1±3.196.0±0.791.9±2.0*94.3±4.2 90.6±1.193.7±0.890.3±2.0*100.2±5.8 96.9±1.497.3±2.089.2±4.9*C205con C205chp496.1±1.6 85.0±18.795.3±1.1 85.0±20.197.5±1.1 83.9±17.092.2±7.4 81.7±19.091.7±10.3 78.5±18.990.1±6.5 74.8±13.2结论细胞被认为是CD20-阴性。令人吃惊地表现出对MIAPaCa2与CHP的协同。
实施例8Avastatin和在使用CHP预处理后细胞系C205、CR02B和MIAPaCa-2的增殖活性使用CHP(chp4)对于上面(Rituximab)相同的细胞系进行预处理，并使用Avastatin进行测试(200-6.3μg/ml)。(*＝显著不同)
CRO2Bcon CRO2Bchp4MIAcon MIAchp498,1±0,694,9±1,8*92,9±1,092,6±0,192,5±0,692,1±1,693,0±1,588,6±0,2*94,3±2,092,9±0,792,6±0,589,4±0,2*94,1±4,391,9±1,094,7±1,585,7±0,1*98,0±1,193,8±1,0*92,7±0,593,8±6,0103,4±1,4 101,2±2,0 100,7±2,094,3±0,0*C205con C205chp496,8±,0191,3±4,2*92,0±0,187,8±1,8*94,7±1,591,8±3,3*97,1±2,69,6±5,1*98,1±0,994,7±4,2100,2±1,4 91,5±13,0结论Avastatin-CHP预孵育在高浓度Avastatin下在MIAPaCa2和Colo205中有轻微的协同作用。
实施例9进行利用分析型EGFR-抗体结合CHP针对colo250结肠癌细胞系的实验。该抗体的最高浓度为0.25μg/ml。
结论令人吃惊的，浓度为200μg/ml的CHP浓度和浓度为0.25μg/ml的EGFR-抗体表现出34.6±11％的高增殖作用。
权利要求
1.一种药物组合物，其含有脯氨酸或脯氨酸衍生物或它们的盐、酯、异构体或药物前体以及抗肿瘤抗体，并且可选择地，还含有药物上可以接受的载体、赋形剂或稀释剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗肿瘤抗体是单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述单克隆抗体选自包括Trastuzumab(Herceptin)、Cetuximab、Rituximab、Avastatin或EGFR-抗体的组。
4.根据权利要求1所述的组合物，其包括脯氨酸衍生物，所述脯氨酸衍生物选自包括顺式-4-羟基-L-脯氨酸(CHP)、4-羟基-1-甲基-脯氨酸或1-甲基-4-苯基氨基-羰基氧-脯氨酸或者它们的盐或酯的组。
5.一种修饰肿瘤细胞受体的方法，其中所述肿瘤细胞在体外或体内被通过使用根据权利要求1的组合物、或者使用脯氨酸或脯氨酸衍生物或它们的盐、酯、异构体或药物前体进行处理。
6.一种提高抗体对肿瘤抗原和/或肿瘤细胞受体的靶选择性的方法，其中所述靶在体外或体内被通过使用根据权利要求1的组合物、或者使用脯氨酸或脯氨酸衍生物或它们的盐、酯、异构体或药物前体进行处理。
7.一种治疗癌症或者癌症病症的方法，其包括为需要其的对象进行给药治疗有效量的权利要求1的组合物、或者给药治疗有效量的脯氨酸或脯氨酸衍生物或它们的盐、酯、异构体或药物前体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述癌症或者癌症病症选自由下列所组成的组白血病、实体肿瘤、肉瘤、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、头颈癌、间皮瘤、骨髓瘤、食管癌/口腔癌、睾丸癌、甲状腺癌、宫颈癌、骨癌、肾癌、子宫癌、前列腺癌、脑癌、肺癌、卵巢癌、皮肤癌、肝癌和肠癌和胃癌、肿瘤和黑色素瘤。
9.一种试剂盒，其含有根据权利要求1所述的抗癌组合物的活性物质，其中由脯氨酸、脯氨酸衍生物或它们的盐、酯、异构体或药物前体所组成的活性物质被保存在与由抗肿瘤抗体所组成的活性物质不同的容器中，该试剂盒还包括有关试剂盒各部分的使用信息。
10.脯氨酸或脯氨酸衍生物或它们的盐、酯、异构体或药物前体与抗肿瘤抗体在制备用于治疗癌症的药物组合物中的应用。
11.根据权利要求10的应用，其中使用脯氨酸衍生物或脯氨酸衍生物的盐或酯，该脯氨酸衍生物选自包括顺式-4-羟基-L-脯氨酸(CHP)、4-羟基-1-甲基-脯氨酸或1-甲基-4-苯基氨基-羰基氧-脯氨酸的组。
12.根据权利要求10的应用，其中使用单克隆抗体。
13.根据权利要求12的应用，其中所述单克隆抗体选自包括Trastuzumab(Herceptin)、Cetuximab、Rituximab、Avastatin或EGFR-抗体的组。
14.脯氨酸或脯氨酸衍生物和/或它们的盐、酯、异构体、外消旋物、对映体或药物前体与抗肿瘤抗体和/或抗肿瘤药物和/或抗血管生成酶(anti-angiogenase)在制备用于治疗癌症的药物组合物和/或根据权利要求9所述的试剂盒中的应用。
15.使用根据权利要求14所述的结合物治疗癌症的方法。
全文摘要
本发明涉及一种药物组合物，其含有脯氨酸或脯氨酸衍生物或它们的盐、酯、异构体、外消旋物、对映体或药物前体与抗癌配体，该抗癌配体优选针对肿瘤抗原的抗体。本发明还针对脯氨酸或脯氨酸衍生物或它们和盐、酯、异构体或药物前体在制备用于治疗癌症的药物组合物中的应用，还涉及一种通过给药所述组合物治疗癌症的方法。
文档编号A61K31/4015GK1997365SQ200580023811
公开日2007年7月11日 申请日期2005年6月7日 优先权日2004年6月14日
发明者措泽·B.·扎拉马 申请人:措泽·B.·扎拉马