专利名称：应用硫酸多糖治疗出血障碍的方法
技术领域：
本发明涉及包括先天性凝血功能障碍、后天性凝血功能障碍以及创伤引发的出血病症在内的出血障碍的治疗。特别是，本发明涉及在血友病中用非抗凝血的硫酸多糖(NASP)以改善凝血并止血。
背景正常的血液凝固是一种复杂的生理和生化过程，涉及凝血因子级联系统活化，在局部血管收缩的同时引起血纤蛋白形成和血小板聚集(Davie等，Biochemistry 3010363，1991评论)。凝血级联由被认为是启动正常凝血的主要方式的“外源性”途径和有助于扩大凝血响应的“内源性”途径组成。对出血性创伤正常的响应包括外源性途径的活化。当血液与一种创伤后暴露于或表达在组织上的凝血因子VII的辅因子——组织因子(TF)接触时，启动外源性途径的活化。TF与FVII形成复合物，以促进FVIIa的产生。然后，FVIIa与TF结合，将FX转化为丝氨酸蛋白酶Fxa，其为凝血酶原酶复合物的关键组分。通过FXa/FVa/钙/磷脂复合物将凝血酶原转化为凝血酶，刺激了血纤蛋白的形成和血小板的活化，这一切都是正常凝血所必需的。此外，通过内源性途径因子IXa和VIIIa进一步增强了正常止血，其也是将FX转化为Fxa。
出血障碍中的凝血不充分，这可能是由先天性凝血功能障碍、后天性凝血功能障碍或创伤引发的出血病症所引起。出血是一种最严重的且表现明显的疾病，可从局部发生或延及全身。局部性出血与损伤相关，且因有缺陷的止血机制而进一步复杂化。任何凝血因子先天性或后天性的缺乏都伴随着出血倾向。先天性凝血功能障碍包括血友病，其是一种包括凝血因子VIII缺乏(血友病A)或凝血因子IX缺乏(血友病B)和血管性血友病(von Willebrands disease)在内的隐性X-连锁疾病。其中的血管性血友病是一种包括重度血管性血友病因子缺乏在内的罕见的出血障碍。由于疾病过程，后天性凝血功能障碍可在无既往出血史的个体中出现。例如，后天性凝血功能障碍可由凝血因子抑制剂或抗凝血因子的自身免疫所引起，所述凝血因子例如凝血因子VIII、血管性血友病因子、凝血因子IX、V、XI、XII和XIII；或由诸如肝病引发的止血障碍所引起，其与合成的凝血因子减少相关。通常，凝血因子缺乏是通过因子置换来治疗，其昂贵、不便(静脉注射)，且不一定总是有效。有20％的接受长期凝血因子置换疗法的患者可能产生抗置换因子的中和抗体。
因此，需要有新的疗法用于治疗出血障碍。适用于众多出血障碍的安全、便利且有效的单一药剂将有利地影响着临床实践。
发明概述本发明提供了使用非抗凝血的硫酸多糖(NASPs)作为促凝血剂、治疗出血障碍的方法和组合物。NASPs可作为单一药剂给药，或与另一种NASPs或其它的止血剂联合给药。特别是，本文描述了NASPs在治疗包括先天性凝血功能障碍，后天性凝血功能障碍，以及创伤引起的出血病症的出血障碍中的应用。
在一方面，本发明提供了一种治疗需要增强凝血的受治疗者的方法，该方法包括给予所述受治疗者治疗有效量的含有非抗凝血的硫酸多糖(NASP)的组合物。在某些实施方案中，本发明提供了一种治疗具有出血障碍的受治疗者的方法，该方法包括给予所述受治疗者治疗有效量的含有NASP的组合物。在某些实施方案中，NASP选自由N-乙酰基-肝素(NAH)、N-乙酰基-脱-O-硫酸化肝素(NA-de-o-SH)、脱-N-硫酸化肝素(De-NSH)、脱-N-硫酸化乙酰化肝素(De-NSAH)、高碘酸氧化肝素(POH)、化学硫酸化海带多糖(CSL)、化学硫酸化褐藻酸(CSAA)、化学硫酸化果胶(CSP)、硫酸葡聚糖(DXS)、肝素衍生的寡糖(HDO)、戊聚糖多硫酸酯(PPS)和岩藻依聚糖组成的组。
在其它实施方案中，NASP选自由先前所列化合物的低分子量片段组成的组。在优选的实施方案中，当在dPT测定中测试时，NASP的片段减少了血液凝血时间。在一个实施方案中，所述NASP是一种岩藻依聚糖片段，其在dPT测定中测试时减少了血液凝血时间。
在其它实施方案中，所述NASP能与一种或多种不同的NASPs同时给药，和/或与一种或多种其它的治疗剂联合给药。
在某些实施方案中，给予受治疗者NASP以治疗由以下所列出血障碍组成的组血友病A，血友病B，血管性血友病，原发性血小板减少症，一种或多种接触因子的缺乏，例如凝血因子XI、凝血因子XII、前激肽释放酶和高分子量激肽原(HMWK)，一种或多种与临床上明显可见的出血相关的凝血因子的缺乏，例如凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II(低凝血酶原血)和血管性血友病因子，维生素K缺乏症，纤维蛋白原病症包括纤维蛋白原缺乏血症，低纤维蛋白原血症和异常纤维蛋白原血症，α2-抗血纤蛋白酶缺乏症以及过量流血，例如由肝病、肾脏病、血小板减少症、血小板机能障碍、血肿、内出血、关节积血、外科手术、创伤、低体温、行经以及怀孕引起的过量流血。
在某些实施方案中，给予受治疗者NASP以治疗由血液因子缺乏引起的先天性凝血功能障碍或后天性凝血功能障碍。所述血液因子缺乏可由一种或多种凝血因子缺乏所致，包括但不限于凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII和血管性血友病因子。
在某些实施方案中，联合给予所述具有出血障碍的受治疗者治疗有效量的含有NASP的组合物以及另一种治疗剂。例如，可给予所述受治疗者治疗有效量的含有NASP的组合物以及一种或多种选自由凝血因子XI、凝血因子XII、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II、凝血因子VIIa和血管性血友病因子组成的组的凝血因子。治疗可进一步包括给予促凝血剂例如凝血酶；内源性凝血途径活化剂，包括凝血因子Xa、凝血因子IXa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa和VIIIa、前激肽释放酶和高分子量激肽原；或外源性凝血途径活化剂，包括组织因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子Xa。用于治疗具有出血障碍的受治疗者的治疗剂可在相同或不同的组合物中，并且在与NASP同时、之前或之后给予。
在另一方面，本发明提供了一种逆转受治疗者中抗凝血剂效应的方法，该方法包括给予受治疗者治疗有效量的含有非抗凝血的硫酸多糖(NASP)的组合物。在某些实施方案中，受治疗者可以是已用抗凝血剂进行了治疗，这些抗凝血剂包括但不限于肝素、诸如丙酮苄羟香豆素或双香豆素的香豆素衍生物、组织因子通道抑制剂(TFPI)、抗凝血酶III、狼疮抗凝剂、线虫抗凝肽(NAPc2)、活性位点封闭的凝血因子VIIa(凝血因子VIIai)、凝血因子IXa抑制剂、凝血因子Xa抑制剂、包括磺达肝癸钠(fondaparinux)、达肝癸钠(idraparinux)、DX-9065a和瑞扎沙班(razaxaban)(DPC906)，凝血因子Va和VIIIa抑制剂、包括激活蛋白C(APC)和可溶性血栓调节蛋白，凝血酶抑制剂，包括水蛭素、比伐卢定(bivalirudin)、阿加曲班(argatroban)和希美加曲(ximelagatran)。在某些实施方案中，所述受治疗者中的抗凝血剂可以是结合凝血因子的抗体，包括但不限于结合到凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II、凝血因子XI、凝血因子XII、血管性血友病因子、前激肽释放酶或高分子量激肽原(HMWK)的抗体。
在某些实施方案中，NASP可与一种或多种不同的NASPs同时给药和/或与一种或多种其它的治疗剂联合给药用于逆转受治疗者中抗凝血剂效应。例如，可给予所述受治疗者治疗有效量的包含NASP和一种或多种凝血因子的组合物，所述凝血因子选自由凝血因子XI、凝血因子XII、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II、凝血因子VIIa以及血管性血友病因子组成的组。治疗可进一步包括给予促凝血剂，例如内源性凝血途径活化剂，包括凝血因子Xa、凝血因子IXa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa和VIIIa、前激肽释放酶以及高分子量激肽原；或外源性凝血途径活化剂，包括组织因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子Xa。与NASP联合使用以逆转受治疗者中抗凝血剂效应的治疗剂可在相同或不同的组合物中，并且在与NASP同时、之前或之后给予。
在另一方面，本发明提供了一种治疗经受外科或侵入性操作的受治疗者以改善其凝血的方法，该方法包括给予受治疗者治疗有效量的包含非抗凝血的硫酸多糖(NASP)的组合物。在某些实施方案中，所述NASP可与一种或多种不同的NASPs同时给予和/或与一种或多种其它的治疗剂联合给予经历外科或侵入性操作的受治疗者。例如，可给予所述受治疗者治疗有效量的一种或多种选自由凝血因子XI、凝血因子XII、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II、凝血因子VIIa和血管性血友病因子的凝血因子组成的组。治疗可进一步包括给予促凝血剂，例如内源性凝血途径活化剂，包括凝血因子Xa、凝血因子IXa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa和VIIIa、前激肽释放酶和高分子量激肽原；或外源性凝血途径活化剂，包括组织因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子Xa。用于治疗经历外科或侵入性操作的的受治疗者的治疗剂可在相同或不同的组合物中，并且在与NASP同时、之前或之后给予。
在另一方面，本发明提供了一种抑制受治疗者中TFPI活性的方法，所述方法包括给予受治疗者治疗有效量的包含NASP的组合物。
在另一方面，本发明提供了一种抑制生物样品中TFPI活性的方法，所述方法包括将所述生物样品(如血液或血浆)与足够量的非抗凝血的硫酸多糖(NASP)结合以抑制TFPI活性。
在另一方面，本发明提供了一种包含NASP的组合物。在某些实施方案中，所述NASP由选自N-乙酰基-肝素(NAH)、N-乙酰基-脱-O-硫酸化肝素(NA-de-o-SH)、脱-N-硫酸化肝素(De-NSH)、脱-N-硫酸化乙酰化肝素(De-NSAH)、高碘酸氧化的肝素(POH)、化学硫酸化海带多糖(CSL)、化学硫酸化褐藻酸(CSAA)、化学硫酸化果胶(CSP)、硫酸葡聚糖(DXS)、肝素衍生的寡糖(HDO)、戊聚糖多硫酸酯(PPS)和岩藻依聚糖组成的组。在其它实施方案中，NASP选自由先前所列化合物的低分子量片段组成的组。在某些实施方案中，所述组合物可进一步包含药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，所述组合物可进一步包含一种或多种不同的NASPs，和/或一种或多种治疗剂，和/或试剂。例如，所述组合物可进一步包含一种或多种选自由凝血因子XI、凝血因子XII、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II和血管性血友病因子、组织因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子Xa、凝血因子IXa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa以及VIIIa的凝血因子组成的组；和/或一种或多种选自由APTT试剂、凝血激酶、血纤蛋白、TFPI、鲁塞尔氏蝰蛇毒、微粉化的二氧化硅颗粒、逆没食子酸、硫脑苷脂和高岭土的试剂组成的组。
在另一方面，本发明提供了一种在生物样品中利用NASP测定凝血加速的方法，所述方法包括a)将所述生物样品与包含NASP的组合物结合，b)测定所述生物样品的凝血时间，c)比较所述生物样品与不暴露于NASP的相应生物样品的凝血时间，其中，如果观察到暴露于NASP的生物样品的凝血时间减少，则表明NASP加速了凝血。
在某些实施方案中，可添加一种或多种不同的NASPs和/或治疗剂、和/或试剂到生物样品中用于测定凝血时间。例如，可添加一种或多种凝血因子，包括但不限于凝血因子XI、凝血因子XII、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II和血管性血友病因子、组织因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子Xa、凝血因子IXa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa以及VIIIa；和/或一种或多种试剂，包括但不限于APTT试剂、组织因子、凝血激酶、血纤蛋白、TFPI、鲁塞尔氏蝰蛇毒、微粉化的二氧化硅颗粒、逆没食子酸、硫脑苷脂和高岭土。
鉴于在此公开的内容，本发明技术人员能容易地想到本发明的这些和其它实施方案。
附图概述
图1显示了通过dPT测定法所测定的在组织因子通道抑制剂(TFPI)存在下，血友病A(Hem-A)血浆的凝血时间增加了。凝血时间(s)对TFPI浓度(μg/ml)所作的图显示了凝血时间随TFPI剂量呈线性增加。
图2比较了可能的NASPs、N-乙酰基-肝素(NAH)、N-乙酰基-脱-O-硫酸化肝素(NA-de-O-SH)、脱-N-硫酸化肝素(De-N-SH)、脱-N-硫酸化乙酰化肝素(De-N-SAH)、戊聚糖多硫酸酯(PPS)、岩藻依聚糖和肝素的抗凝血活性。在Hem-A血浆中于不同浓度下测试所选择的多糖。图2显示了凝血时间(s)对NASP浓度(nM)所作的图。所显示的数据点是两次重复测量的平均值。
图3比较了当使用aPTT测定法测定时，NAH、PPS、岩藻依聚糖和肝素对含1.25％FACT血浆的Hem-A血浆凝血时间的影响。图3显示了凝血时间(s)对NASP浓度(nM)所作的图。所显示的数据点是两次重复测量的平均值。
图4显示了NASPs，包括NAH、PPS和岩藻依聚糖加速了含重组TFPI的Hem-A血浆的凝血。在添加血浆前，将NASPs与TFPI简短地预温育。用dPT测定法测定凝血时间。显示了凝血时间(s)对NASP浓度(nM)所作的图。所显示的数据点是两次重复测量的平均值。NASP对TFPI活性的抑制导致了减少的血浆凝血时间。
图5显示了NASPs，包括NAH、PPS和岩藻依聚糖加速了含重组TFPI的血友病B(Hem-B)血浆的凝血。在添加血浆前，将NASPs与TFPI简短地预温育。使用dPT测定法测定凝血时间。显示了凝血时间(s)对NASP浓度(nM)所作的图。所显示的数据点是两次重复测量的平均值。NASP对TFPI活性的抑制导致了减少的血浆凝血时间。
图6显示了NAH、PPS和岩藻依聚糖加速含TFPI的Hem-A血浆的凝血，在TFPI引入血浆前TFPI不与NASPs预温育。显示了凝血时间(s)对NASP浓度(nM)所作的图。使用dPT测定法测定凝血时间。所显示的数据点是两次重复测量的平均值。
图7显示了在不存在外源TFPI补充下，PPS和岩藻依聚糖加速Hem-A血浆的凝血。比较NASPs和用于加强外源性途径活化的阳性对照物凝血因子VIIa的剂量-响应。图7显示了凝血时间(s)对NASP浓度(nM)所作的图。使用dPT测定法测定凝血时间。所显示的数据点是两次重复测量的平均值。
图8显示了在dPT测定中岩藻依聚糖和PPS加速凝血因子VII-缺乏的血浆的凝血。在凝血因子VII-缺乏的血浆与不同浓度岩藻依聚糖或PPS预温育后测定凝血时间。图8显示了凝血时间(s)对NASP浓度(nM)所作的图。所显示的数据点是两次重复测量的平均值。
发明详述除非另作指示，实现本发明将应用到在本领域现有技术之内的药理学、化学、生物化学、凝血、重组DNA技术和免疫学的常规方法。这些技术已在文献中得到了充分的说明，参见如Handbook of ExperimentalImmunology，Vols.I-IV(D.M.Weir和CC.Blackwell编.，BlackwellScientific Publications)；A.L.Lehninger，Biochemistry(WorthPublishers，Inc.，current addition)；Sambrook，等，MolecularCloningA Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)。
I.定义在本发明描述中，将使用以下术语，其定义为如下所述。
应当指出的是，除非该内容清楚地另作指示，在本说明书和附加的权利要求书中使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数对象。因此，例如，所提及的“a NASP”包括两种或更多种这样的试剂等等的混合物。
在此使用的“NASP”所指的硫酸多糖是在稀释凝血酶原时间(dPT)或活化部分凝血激酶时间(aPTT)凝集测定中显示出抗凝血剂活性的硫酸多糖，其具有不超过未分级肝素(分子量范围8,000-30,000；平均18,000道尔顿)三分之一、优选低于十分之一摩尔抗凝血(凝血时间统计学显著地增加了)活性。NASPs可以是从天然来源(如褐藻类、树皮、动物组织)纯化和/或改性的，或可以是从头合成的，分子量范围在100道尔顿-1,000,000道尔顿。NASPs可用于本发明的方法中在治疗出血障碍特别是与凝血因子缺乏相关的那些出血障碍中用于改善止血，或用于逆转抗凝血剂效应。使用各种体外凝集测定法(如dPT和aPTT测定法)和体内出血模型(如在血友病小鼠或狗中测定剪去尾部、横向切口的全血凝血时间或表皮出血时间)能容易地确定出NASPs促进凝血和减少出血的能力。参见如PDR Staff.Physicians′Desk Reference.2004，Anderson等，(1976)Thromb.Res.9575-580；Nordfang等，(1991)Thromb Haemost.66464-467；Welsch等，(1991)Thrombosis Research 64213-222；Broze等，(2001)Thromb Haemost 85747-748；Scallan等，(2003)Blood.1022031-2037；Pijnappels等.(1986)Thromb.Haemost.5570-73；和Giles等，(1982)Blood 60727-730。
在此使用的“促凝血剂”指任何能启动或加速血凝块形成的因子或试剂。本发明的促凝血剂包括任何内源性或外源性凝血途径的活化剂，例如选自由凝血因子Xa、凝血因子IXa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa和VIIIa、前激肽释放酶、高分子量激肽原、组织因子、凝血因子VIIa以及凝血因子Va的凝血因子组成的组。其它促进凝血的试剂包括激肽释放酶、APTT抑制剂(即一种含有磷脂和接触活化剂的试剂)、鲁塞尔氏蝰蛇毒(RW时间)以及凝血激酶(用于dPT)。可用于本发明方法中作为促凝血剂的接触活化剂，包括本领域技术人员公知的微粉化的二氧化硅颗粒、逆没食子酸、硫脑苷脂、高岭土或等等。促凝血剂可以是天然粗提物，血液或血浆样品、分离的和基本上纯化了的、合成的或重组的。促凝血剂可包括保持生物活性(即促进凝血)的天然存在的凝血因子或其片段、变体或共价修饰的衍生物。本领域技术人员可测定促凝血剂的最佳浓度。
在此使用的术语“多糖”指一种包含多个(即两个或更多个)以共价键链接的糖残基的聚合物。键可以是天然的或非天然的。天然键包括例如糖苷键，而非天然键则可包括例如酯、胺或肟键部分。多糖可具有任意宽范围的平均分子量(MW)值，但通常至少为约100道尔顿。例如，多糖可具有至少约500、1000、2000、4000、6000、8000、10,000、20,000、30,000、50,000、100,000、500,000道尔顿或更高的分子量。多糖可具有直链或支链结构。多糖可包括由更大的多糖降解(如水解)所产生的多糖片段。可使用本领域技术人员公知的任何一种方法进行降解，包括用酸、碱、加热或酶处理多糖以产生降解的多糖。多糖可以是化学改性的，亦可是改性的，包括但不限于硫酸化、聚硫酸化、酯化以及甲基化。
在此使用的术语“衍生自”用于确定分子的原始来源，但并不旨在限制所述分子的制备方法，其可以是如通过化学合成或重组方法制备的。
术语“变体”、“类似物”和“突变蛋白”指参照分子的生物活性衍生物。它们在治疗在此所述的出血障碍中保持期望活性，例如凝血活性。一般而言，关于多肽(如凝血因子)的术语“变体”和“类似物”指具有一个或多个氨基酸添加、取代(一般在特性上保守)和/或缺失的天然多肽序列和结构的化合物，相对于天然分子，只要所述修饰并不破坏生物活性，其就是与如下所定义的参照分子“基本上同源的”。一般来说，当两条序列比对时，这样的类似物的氨基酸序列应与参照序列具有高度的序列同源性，如超过50％的氨基酸序列同源性、通常超过60％-70％、甚至更特别地为80％-85％或更高，例如至少90％-95％或更高。通常，所述类似物应包括相同数目的氨基酸，但应包括在此所解释的取代。术语“突变蛋白”进一步包括具有一个或多个氨基酸样分子的多肽，包括但不限于仅包含氨基和/或亚氨基分子的化合物，包含一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)的多肽，具有取代的键的多肽，以及其它本领域公知的修饰，天然存在或非天然存在的(如合成)，环化的、含支链分子等等。该术语也包括包含一个或多个N-取代的甘氨酸残基(“类肽”)以及其它的合成氨基酸或肽的分子(参见如，美国专利号5,831,005；5,877,278和5,977,301；Nguyen等，Chem Biol.(2000)7463-473以及Simon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)899367-9371对于类肽的描述)。更适宜地，所述类似物或突变蛋白与天然分子具有至少相同的凝血活性。本领域公知制备多肽类似物和突变蛋白的方法描述如下。
如上所解释的，类似物通常包括在特性上保守的取代，即在侧链相关的氨基酸家族内所发生的那些取代。具体来说，氨基酸通常分为四个家族(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性-赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被归类为芳香族氨基酸。例如，可合理地预测用异亮氨酸或缬氨酸单独取代亮氨酸、用谷氨酸单独取代天冬氨酸、用丝氨酸单独取代苏氨酸、或用结构上相关的氨基酸单独取代氨基酸的类似的保守取代，将不会对生物活性起大的影响。例如，目的多肽可包括多达约5-10个保守或非保守的氨基酸取代，或甚至多达约15-25个保守或非保守的氨基酸取代，或在5-25个之间任何整数个取代，只要分子仍然保持完整的期望功能即可。通过参考本领域众所周知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle图，本领域技术人员可容易地确定目的分子能容忍改变的区域。
“衍生”意指目的参照分子或其类似物任何合适的修饰，例如硫酸化、乙酰化、糖基化、磷酸化、聚合物结合(例如与聚乙二醇)，或外源部分的其他添加，只要参照分子仍然保持期望生物活性(如凝血活性、抑制TFPI活性)即可。例如，可用一种或多种有机或无机基团衍生化多糖。实例包括用另一基团(如硫酸基、羧基、磷酸基、氨基、腈、卤素、甲硅烷基、胺基、酰基、脂肪族、芳香族或糖基)取代至少一个羟基的多糖，或环上的氧已被硫、氮、亚甲基等取代的多糖。多糖可进行化学改性，例如以改善促凝血剂功能。这样的改性可包括但不限于，硫酸化、聚硫酸化、酯化和甲基化。制备类似物和衍生物的方法通常能从现有技术中获得。
“片段”意指一种仅由完整全长序列和结构的一部分组成的分子。多糖片段可通过降解(如水解)更大的多糖而产生。多糖活性片段通常应包括至少约2-20个全长多糖的糖单元，优选至少约5-10个全长分子的糖单元或在2个糖单元至全长分子之间的任何整数个糖单元，只要该片段保持生物活性，例如凝血活性和/或抑制TFPI活性的能力即可。多肽片段可包括天然多肽的C-末端缺失和N-末端缺失、和/或中间缺失。特定蛋白质的活性片段通常以包括至少约5-10个全长分子的连续氨基酸残基，优选至少约15-25个全长分子的连续氨基酸残基，最优选至少约20-50个或更多个全长分子的连续氨基酸残基，或在5个氨基酸到全长序列之间的任意整数个连续氨基酸残基，只要正该片段仍然保持生物活性例如在此描述的凝血活性即可。
“基本上纯的”通常指分离物质(如硫酸多糖)以使得所述物质在其所存在的样品中占绝大百分数。一般来说，样品中基本上纯的组分包含50％、优选80％-85％、更优选90-95％的样品。本领域众所周知用于纯化目的多糖、多核苷酸以及多肽的技术，包括如离子交换层析、亲和层析以及密度沉降法。
当涉及多糖或多肽时，“分离的”意指所指示的分子与其天然存在的所有有机体是分开且分离的，或以基本上不存在同种类型的其它生物大分子的形式存在。
“同源性”指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的同一性百分数。当序列在规定分子长度的范围内具有至少约50％、优选至少约75％、更优选至少约80％-85％、优选至少约90％以及最优选至少约95％-98％序列同一性时，两条核酸或两条多肽序列是彼此“基本上同源的”。在此使用的基本上同源的也指显示与所指定序列具有完全同一性的序列。
具体而言，“同一性”分别指两条多核苷酸或多肽序列精确的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的对应。同一性百分数可通过直接比较两个分子(参照序列和与相对于所述参照序列具有未知％同一性的序列)之间的序列信息，通过排列序列、计算两条排列序列之间匹配的精确数目、除以参照序列的长度并将结果乘以100来测定。可使用容易获得的计算机程序帮助分析，例如ALIGN，Dayhoff，M.O.in Atlas of Protein Sequence andStructure M.O.Dayhoff编，5 Suppl.3353-358，National biomedicalResearch Foundation，Washington，DC，其改写了Smith和WatermanAdvances in Appl.Math.2482-489，1981用于肽分析的局部同源性算法。确定核苷酸序列同一性的程序可由Wiscons in Sequence AnalysisPackage，第8版获得(获得自Genetics Computer Group，Madison，WI)，例如，同样基于Smith和Waterman算法的BESTFIT、FASTA和GAP程序。利用厂商所推荐及描述于上述提及的Wisconsin Sequence AnalysisPackage中的缺省参数，这些程序很容易执行。例如，可使用带有缺省得分表和6核苷酸位置缺口罚分的Smith和Waterman的同源性算法来确定特定核苷酸序列与参照序列的同一性百分数。
本发明文中另一种确定同一性百分数方法是使用爱丁堡大学版权所有的、由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发并通过IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)分发的MPSRCH程序包。Smith-Waterman算法可用于这一套程序包中，在此缺省参数用于得分表(例如，缺口开放罚分12、缺口延伸罚分1以及缺口为6)。由产生“匹配”值的数据反映了“序列同一性”。其它用于计算序列之间同一性或相似性百分数的合适程序为本领域所常知，例如，另一种比排列序是使用缺省参数的BLAST。例如，可被使用的BLASTN和BLASTP可使用如下缺省参数遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述(Descriptions)＝50条序列；分类＝高得分(HIGH SCORE)；数据库＝非冗余的，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss protein+Spupdate+PIR。这些程序的细节容易获得。
或者，同源性可通过在同源区域之间形成稳定的双链体的条件下杂交多核苷酸、然后用单链特异性核酸酶消化，并测定所消化片段的大小来测定。基本上同源的DNA序列可在Southern杂交实验中于例如对于该特定系统所规定的严格条件下鉴定。确定合适的杂交条件属于本领域技术范畴之内。参见如Sambrook等.，见上；DNA Cloning，见上；Nucleic AcidHybridization，见上。
在此用于描述核酸分子的“重组”意指基因组的多聚核苷酸、cDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸根据其来源或操作不与天然多核苷酸的全部或部分相关。在涉及蛋白质或多肽时所使用的术语“重组”意指通过表达重组多核苷酸产生的多肽。一般而言，目的基因被克隆，然后在转化的生物体中表达，如下将作进一步描述。宿主生物体在表达条件下表达外源基因以产生蛋白质。
“脊椎动物研究对象”意指脊索动物亚门的任何成员，包括不限于人和其它灵长类，包括非人灵长类，例如黑猩猩和其它猿类以及猴子；家畜例如牛、绵羊、猪、山羊和马；驯化的哺乳动物例如狗和猫；实验室动物包括啮齿类动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟类，包括驯化的、野生的和猎鸟，例如鸡、火鸡和其它鹑鸡类鸟类、鸭、鹅等等。该术语并不指示具体的年龄。因此旨在包括成年和新生的个体。在此描述的本发明意在用于任何上述的脊椎动物。
术语“患者”指患有或易患可通过给予本发明的NASP预防或治疗的病症的活生物体，包括人和动物。
在此使用的“生物样品”指组织样品或分离自受治疗者的液体，包括但不限于，例如血液，血浆，血清，排泄物，尿液，骨髓，胆汁，脊髓液，淋巴液，皮肤样品，皮肤、呼吸器官、肠和生殖泌尿道的外分泌物，泪液，唾液，乳液，血细胞，器官，活组织检查以及体外细胞培养组分的样品，包括但不限于培养基中细胞和组织培养的条件培养物，如重组的细胞和细胞组分。
NASP、血液因子或其它治疗剂的“治疗有效剂量或治疗有效量”意指在按照这里所描述的情形给药时，产生阳性治疗反应例如减少出血或缩短凝血时间的量。
在此使用的术语“出血障碍”指任何与过量流血相关的病症，例如先天性凝血功能障碍、后天性凝血功能障碍或创伤引起的出血病症。这样的出血障碍包括但不限于，血友病A，血友病B，血管性血友病，原发性血小板减少症，一种或多种接触因子的缺乏，例如凝血因子XI、凝血因子XII、前激肽释放酶和高分子量激肽原(HMWK)，一种或多种与临床上明显可见的出血相关的凝血因子的缺乏，例如凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II(低凝血酶原血)和血管性血友病因子，维生素K缺乏症，纤维蛋白原病症包括纤维蛋白原缺乏血症，低纤维蛋白原血症和异常纤维蛋白原血症，α2-抗血纤蛋白酶缺乏症以及过量流血，例如由肝病、肾脏病、血小板减少症、血小板机能障碍、血肿、内出血、关节积血、外科手术、创伤、低体温、行经以及怀孕引起的过量流血。
II.实现本发明的方法在详述本发明之前，应当明白的是本发明并不限于特定的配方或工艺参数，当然自身可以改变。也应当明白的是在此使用的术语目的仅在于描述本发明的特定实施方案，并不意在限制。
尽管许多类似于或等价于在此描述的方法和物质均能用于实现本发明，但是在此描述的是优选的物质和方法。
A.概述凝血障碍包括通常采用因子置换治疗的血友病(Hem)A和Hem B、重度血管性血友病(svWD)以及重度凝血因子VII(FVII)缺乏。例如，对于HemA和svWD用凝血因子VIII置换治疗，对于Hem B用凝血因子IX置换治疗，对于FVII-缺乏以及其他用凝血因子VII(a)置换治疗(最近评论于Bishop等，(2004)Nat.Rev.Drug Discov.3684-694；Carcao等，(2004)Blood Rev.18101-113；Roberts等，(2004)Anesthesiology100722-730；和Lee(2004)Int.Anesthesiol.Clin.4259-76中)。虽然这样的治疗通常是有效的，但是其应用受到如高成本、不方便(即通过静脉注射给药)以及产生中和抗体等的限制(Bishop等，见上；Carcao等，见上；Roberts等，见上；Lee，见上；和Bohn等，(2004)Haemophilia10 Suppl.12-8)。虽然FVIIa越来越多地应用于多种出血障碍中(Roberts等，见上)，但开发出可避免前述约束条件、并有广泛应用的可替换的单一化合物促凝血剂治疗方案仍引起人们的兴趣。
一种改善有出血障碍的个体的止血的常规方法是通过上调凝血外源性途径以改善凝血启动。尽管凝血内源性和外源性途径都有助于凝血酶产生和血纤蛋白凝块形成(Davie等，(1991)Biochemistry3010363-10370)，但是对于启动以及帮助体内凝血传播而言，外源的或组织因子(TF)介导的途径是关键的(Mann(2003)Chest 124(3Suppl)1S-3S；Rapaport等，(1995)Thromb.Haemost.747-17)。一种上调外源性途径活性的可能的机制是减弱组织因子通道抑制剂(TFPI)。TFPI是一种FVIIa/TF的Kunitz型蛋白酶抑制剂，其提供外源性途径活化的滋补下调(参见Broze(1992)Semin.Hematol.29159-169；Broze(2003)J.Thromb.Haemost.11671-1675；和Johnson等，(1998)Coron.Artery Dis.9(2-3)83-87评论)。实际上，在小鼠中杂合的TFPI缺乏可导致加剧血栓形成(Westrick等，(2001)Circulation 1033044-3046)，且TFPI基因突变亦是人血栓症的危险因素(Kleesiek等.(1999)Thromb.Haemost.821-5)。Nordfan等和Wun等描述了在血友病中通过靶向TFPI调节凝血，他们揭示出了抗-TFPI抗体能缩短血友病血浆的凝血时间(Nordfang等，(1991)Thromb.Haemost.66464-467；Welsch等，(1991)Thromb.Res.64213-222)，且抗-TFPI IgG改善了凝血因子VIII缺乏的兔子的出血时间(Erhardtsen等，(1995)Blood Coagul.Fibrinolysis6388-394)。
作为一类物质，硫酸多糖的特点在于多血质的生物活性，其在动物和人中具有通常有利的耐受分布图。这些聚阴离子分子一般来自植物和动物组织，包含大量的亚类包括肝素、粘多糖、岩藻依聚糖、角叉胶、戊聚糖多硫酸酯和皮肤素或硫酸葡聚糖(Toida等，(2003)Trends inGlycoscience and Glycotechnology 1529-46)。已报道了较低分子量、低异质性以及化学合成的硫酸多糖，并已达到不同的药物开发阶段(Sinay(1999)Nature 398377-378；Bates等，(1998)Coron.ArteryDis.965-74；Orgueira等，(2003)Chemistry 9140-169；McAuliffe(1997)Chemical Industry Magazine 3170-174；Williams等，(1998)Gen.Pharmacol.30337-341)。通过与抗凝血酶III和/或肝素辅因子II相互作用的介导，肝素类硫酸多糖显示出差异抗凝血活性(Toida等，见上)。值得注意的是，某些天然来源或化学修饰的化合物在基本上不具有抗凝血活性的浓度(或剂量)上显示出其它生物活性(Williams等，1998)Gen.Pharmacol.30337-341；Wan等，(2002)Inflamm.Res.51435-443；Bourin等，(1993)Biochem.J.289(Pt 2)313-330；McCaffrey等，(1992)Biochem.Biophys.Res.Commun.184773-781；Luyt等，(2003)J.Pharmacol.Exp.Ther.30524-30)。此外，也已显示硫酸化肝素与TFPI具有强的相互作用(Broze(1992)Semin.Hematol.29159-169；Broze(2003)J.Thromb.Haemost.11671-1675；Johnson等，(1998)Coron.Artery Dis.983-87；Novotny等，(1991)Blood；78(2)394-400)。
与那些与抗凝血相关的相比，在此描述的某些硫酸多糖与TFPI相互作用并在更低浓度下抑制其活性。这样的分子可用于血凝块形成受损的地方。
B.作为凝血促进剂的NASPs本发明基于非抗凝血的硫酸多糖(NASPs)在治疗具有出血障碍的患者中可用作促凝血剂的发现。发明人在此已发现一种用于调节止血的新方法，即反常地使用了诸如肝素类硫酸多糖的硫酸多糖来促进凝血。在此描述的所选择的硫酸多糖在很大程度上不具有抗凝血活性或在显著低于其具有抗凝血活性的浓度的浓度下具有促凝血活性，因此被称之为“非抗凝血的硫酸多糖”。
如实施例4-6所示，根据稀释凝血酶原时间(dPT)和活化部分凝血激酶时间(aPTT)凝集测定，NASPs促进患血友病A(Hem-A)或血友病B(Hem-B)的受治疗者的血浆凝血。此外，NASPs减少血友病A和B小鼠模型受伤后的出血时间(实施例7)。在本文所披露的试验中，与肝素比较，在凝集测定中所示的某些候选NASPs被证实具有至少10倍更低的抗凝血活性。此外，NASPs的一亚类，包括戊聚糖多硫酸酯(PPS)和岩藻依聚糖，当在稀释凝血酶原时间(dPT)测定中于4-500nM浓度范围下测试时，抑制了组织因子通道抑制剂(TFPI)并改善了(即加速)人血友病A和血友病B血浆或具有减少的FVII水平的血浆的凝血时间。于低剂量皮下给予PPS或岩藻依聚糖或NASP与因子补充物的组合后，在血友病A或B小鼠中观察到了改善的体内止血。也观察到了在出血激发后因子缺乏的小鼠存活率的增加。这些结果表明系统地给予选择的NASPs可能代表着一种用于调节出血障碍中止血的独特方法。
因此，本发明涉及使用NASPs来控制具有包括先天性凝血功能障碍，后天性凝血功能障碍以及创伤引起的出血病症在内的出血障碍的受治疗者的止血。
C.NASPs供本发明方法使用的NASPs是具有促凝血剂活性的硫酸多糖。潜在NASPs的非凝血特性使用稀释凝血酶原时间(dPT)或活化部分凝血激酶时间(aPTT)凝集测定来确定。非凝血的硫酸多糖具有不超过未分级的肝素(分子量范围8,000-30,000；平均18,000道尔顿)三分之一、优选小于十分之一的抗凝血活性(通过凝血时间的统计学显著增加所测定)。
具有潜在NASP活性的硫酸多糖包括但不限于，粘多糖(GAGs)、肝素类分子包括N-乙酰基肝素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和N-脱硫酸化肝素(Sigma-Aldrich)、类硫酸(sulfatoids)、多硫酸化寡糖(Karst等.(2003)Curr.Med.Chem.101993-2031；Kuszmann等，(2004)Pharmazie.59344-348)、硫酸软骨素(Sigma-Aldrich)、硫酸皮肤素(CelsusLaboratories Cincinnati，OH)、岩藻依聚糖(Sigma-Aldrich)、戊聚糖多硫酸酯(PPS)(Ortho-McNeil Pharmaceuticals，Raritan，NJ)、硫酸岩藻吡喃酮(Katzman等，(1973)J.Biol.Chem.24850-55)以及新的类硫酸例如GM1474(Williams等，(1998)General Pharmacology 30337)和SR 80258A(Burg等，(1997)Laboratory Investigation 76505)和新的类肝素及其类似物。NASPs可以是从天然来源(如褐藻类、树皮、动物组织)纯化和/或改性的，或可以是从头合成的，且分子量范围在100道尔顿-1,000,000道尔顿。具有潜在NASP活性的其他的化合物包括高碘酸氧化的肝素(POH)(Neoparin，Inc.，San Leandro，CA)、化学硫酸化海带多糖(CSL)(Sigma-Aldrich)、化学硫酸化褐藻酸(CSAA)(Sigma-Aldrich)、化学硫酸化果胶(CSP)(Sigma-Aldrich)、硫酸葡聚糖(DXS)(Sigma-Aldrich)、肝素衍生的寡糖(HDO)(Neoparin，Inc.，SanLeandro，CA)。
原则上，任何糖结合物的单糖组分上的游离羟基皆可通过硫酸化得到改性以产生硫酸化的糖结合物均可以用作为实现本发明的NASP。例如，这样的硫酸化糖结合物可包括但不限于粘多糖(D-葡糖胺和D-葡萄糖醛酸残基)、凝胶多糖(羧甲基乙醚，硫化氢，羧甲基化的凝胶多糖)(Sigma-Aldrich)、硫酸化裂殖菌多糖(Itoh等，(1990)Int.J.Immunopharmacol.12225-223；Hirata等，(1994)Pharm.Bull.17739-741)、硫酸化粘多糖、硫酸多糖-粘肽复合物、硫酸化烷基麦芽寡糖(Katsuraya等，(1994)Carbohydr Res.26051-61)、硫酸支链淀粉、N-乙酰基-肝素(NAH)(Sigma-Aldrich)、N-乙酰基-脱-O-硫酸化肝素(NA-de-o-SH)(Sigma-Aldrich)、脱-N-硫酸化肝素(De-NSH)(Sigma-Aldrich)和脱-N-硫酸化乙酰化肝素(De-NSAH)(Sigma-Aldrich)。
使用各种体外凝集测定法(如dPT和aPTT测定法)和体内出血模型(如在血友病小鼠或狗中测定剪去尾部、横向切口的全血凝血时间或表皮出血时间)能容易地确定NASPs促进凝血和减少出血的能力。参见如PDRStaff.Physicians′Desk Reference.2004，Anderson等，(1976)Thromb.Res.9575-580；Nordfang等，(1991)Thromb Haemost.66464-467；Welsch等，(1991)Thrombosis Research 64213-222；Broze等，(2001)Thromb Haemost 85747-748；Scallan等，(2003)Blood.1022031-2037；Pijnappels等，(1986)Thromb.Haemost.5570-73；和Giles等，(1982)Blood 60727-730。凝集测定可在NASPs和一种或多种血液因子、促凝血剂或其它试剂存在下进行。例如，可添加一种或多种因子，包括但不限于凝血因子XI、凝血因子XII、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II和血管性血友病因子、组织因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子Xa、凝血因子IXa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa以及VIIIa；和/或一种或多种试剂，包括但不限于APTT试剂、凝血激酶、血纤蛋白、TFPI、鲁塞尔氏蝰蛇毒、微粉化的二氧化硅颗粒、逆没食子酸、硫脑苷脂和高岭土。
实施例3-4和图2-3证实了在此提及作为NASPs的试剂确实是“非抗凝血的”，即在所研究的整个浓度范围内它们不显著增加凝血时间。这样的化合物可用于本发明方法和组合物中，只要它们所具有的任何抗凝血活性仅出现在显著高于它们的促凝血剂活性的浓度的浓度上。出现不期望抗凝血特性的浓度与出现期望促凝血剂活性的浓度的比值称为NASP的治疗指数。本发明的NASPs的治疗指数可以是5、10、30、100、300、1000或更高。
D.药物组合物任选地，本发明的NASP组合物可进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂以提供药物组合物。赋形剂的实例包括但不限于，碳水化合物、无机盐、抗微生物剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱及它们的组合。适用于可注射组合物的赋形剂包括水、乙醇、多羟基化合物、甘油、植物油、磷脂和表面活性剂。碳水化合物，诸如糖、由糖醇、糖醛酸和酯化糖的衍生的糖、和/或糖聚合物可作为赋形剂。具体的碳水化合物赋形剂包括，例如单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等等；多糖，例如蜜三糖、松三糖、糊精、葡聚糖、淀粉等等；以及醛醇，例如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡萄糖醇)、吡喃糖基山梨糖醇、肌醇等等。赋形剂也可包括无机盐或缓冲剂，例如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠及它们的组合。
本发明组合物亦可包括用于预防或阻止微生物生长的抗微生物剂。适合本发明使用的抗微生物剂的非限制性实例包括氯化苯，苄索氯铵、苯甲醇、西吡氯铵、三氯叔丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、噻汞撒(thimersol)及它们的组合。
组合物中也可含有抗氧化剂。抗氧化剂被用于防止氧化，因此防止NASP或制剂其它组分的降解。适合本发明使用的抗氧化剂包括，例如，抗坏血酸棕榈酸脂、丁羟基茴香醚、丁羟基甲苯、次磷酸、二羟基丙硫醇、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸钠、焦亚硫酸钠及它们的组合。
表面活性剂可作为赋形剂存在。表面活性剂的例子包括聚山梨醇酯，例如“吐温20(Tween20)”和“吐温80(Tween80)”以及诸如F68和F88的普流罗尼类(pluronics)(BASF，Mount Olive，New Jersey)；山梨醇酐酯；脂类，例如诸如卵磷脂和其它磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺(尽管脂质体类型并不是优选的)的磷脂、脂肪酸和脂肪酯；甾族化合物，例如胆固醇；螯合剂，例如EDTA；以及锌和其它适合的阳离子。
在组合物中酸或碱可作为赋形剂存在。可使用的酸的非限制性实例包括选自由盐酸、醋酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸及其组合的那些酸组成的组。合适的碱的实例包括但不限于，选自由氢氧化钠、醋酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、醋酸铵、醋酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸钾及其组合的碱组成的组。
组合物中NASP(如当含有在药物递送系统中时)的量取决于众多因素而变化，但最佳的是当所述组合物以单位剂量形式或在容器(如管形瓶)里存在时的治疗有效剂量。确定治疗有效剂量可通过重复给予递增量的组合物以确定能产生临床期望终点的量来进行。
组合物中任何单独赋形剂的量取决于该赋形剂的特性和功能以及组合物的特定需求而变化。通常任何单独赋形剂的最佳量可通过常规试验确定，即通过制备含有不同量赋形剂(范围从低到高)的组合物，检查稳定性和其它参数，接着确定获得最佳性能而无明显不利效应的范围。但是，一般而言，按赋形剂重量计，组合物中所存在的赋形剂量应为约1％至约99％，优选为约5％至约98％，更优选为约15至约95％，最优选含量低于30％。上述这些药物赋形剂以及其它赋形剂描述于“RemingtonThe Science &Practice of Pharmacy”，第19版，Williams & Williams，(1995)，the“Physician′s Desk Reference”，第52版，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)和Kibbe，A.H.，Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，American Pharmaceutical Association，Washington，D.C.，2000中。
组合物包括所有类型的剂型，特别是那些适于注射的剂型，如在使用前可用溶剂重建的粉剂或冻干剂，以及注射备用溶液或混悬液，在使用前与赋形剂结合的干的不溶性组合物，以及乳剂和在给药前稀释的液体浓缩物。适于在注射前重建固体组合物的稀释剂的实例包括用于注射的抑菌水、5％葡萄糖水溶液、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、盐水、无菌水、去离子水及它们的组合。就液体药物组合物而言，预想的是溶液和混悬液。其它优选的组合物包括那些经口、经眼或局部递送的组合物。
根据不同的递送和使用的期望方式，这里的药物制剂亦可置于注射器、植入装置等等中。更适宜地，在此描述的NASP组合物以预测量的或预包装的单位剂量形式存在，意味着是适于单次剂量的本发明的接合物或组合物的量。
在此NASP组合物可任选地包括一种或多种附加试剂，例如止血剂、血液因子或其它用于治疗受治疗者病症或疾病的药物。特别优选的是包括一种或多种血液因子，例如凝血因子XI、凝血因子XII、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II、凝血因子VIIa和血管性血友病因子的复方制剂。NASP组合物也可包括其它促凝血剂，例如内源性凝血途径活化剂，包括但不限于凝血因子Xa、凝血因子Ixa、凝血因子Xia、凝血因子XIIa和VIIIa、前激肽释放酶以及高分子量激肽原；或外源性凝血途径活化剂，包括但不限于组织因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子Xa。NASP组合物可包括天然存在的、合成或重组的凝血因子，或它们的保持了生物活性(即促凝血)的片段、变体或共价修饰的衍生物。或者，这样的试剂可包含于与NASP分离的组合物中并与本发明的NASP组合物同时给药、或在其给药之前或之后给药。
E.给药给予受治疗者至少一个治疗有效周期的NASP治疗。“治疗的治疗有效周期”意指就治疗出血障碍个体而言，在给药时产生阳性治疗反应的治疗周期。特别感兴趣的是改善止血的NASP治疗周期。“阳性治疗反应”意指个体经过本发明的治疗后，表现出一种或多种出血障碍症状的改善，包括诸如缩短血液凝血时间和减少出血和/或减少因子置换治疗需要的改善。
在某些实施方案中，多次治疗有效剂量的组合物包含一种或多种NASPs和/或其它治疗剂，例如止血剂、血液因子或其它应给予的药物。尽管不是必需的，本发明的组合物通常是经口、通过注射(皮下、由静脉内或肌内)、通过输注或局部给予。药物制剂可在刚给药前以液体溶液或混悬液形式存在，但也可以其它方式存在，例如糖浆剂、霜剂、软膏剂、片剂、胶囊、粉剂、凝胶、基质、栓剂等等。亦考虑其它给药方式，例如肺、直肠、经皮、经粘膜、鞘内、心包、动脉内、大脑内、眼内、腹膜内等等。依照本领域公知的任何医学上可接受的方法，包含NASPs和其它试剂的药物组合物可使用相同或不同的给药途径给予。
在一个特定实施方案中，本发明的组合物用于局部递送NASP，例如用于治疗损伤、受伤或外科手术所引起的出血。根据本发明的制剂也适合于局部治疗。例如，可通过在出血部位注射或以固体、液体或软膏剂的形式给予NASP，优选通过胶带或伤口覆盖物给予。亦可使用栓剂、胶囊特别是抗胃液胶囊、滴剂或喷雾剂。选择具体的制剂和合适的给药方法以靶向出血部位。
在另一个实施方案中，包含NASPs和/或其它试剂的药物组合物被预防性地给予，例如在计划的外科手术前进行。对于具有已知之前存在凝血障碍的受治疗者而言，这样的预防性应用特别有价值。
在本发明的另一个实施方案中，包含NASPs和/或其它试剂的药物组合物是持续释放剂型或使用持续释放装置给药的剂型。这样的装置是本领域众所周知的，包括例如，透皮贴剂和微型植入泵。所述微型植入泵能在一段时间内以连续、稳定的方式在不同剂量下使用非持续释放的药物组合物，以提供药物递送以达到持续释放效果。
本发明也提供了一种将含有在此提供的NASP的结合物给予患者的方法，该患者所患的病症对该含有NASP的结合物或组合物有响应。所述方法包括通过任何在此描述的方式给予治疗有效量的结合物或药物递送系统，优选的是作为药物组合物一部分所提供。该给药方法可用于治疗任何响应NASP治疗的病症。更特别地，在此的组合物能有效地治疗出血障碍，包括血友病A，血友病B，血管性血友病，原发性血小板减少症，一种或多种接触因子的缺乏，例如凝血因子XI、凝血因子XII、前激肽释放酶和高分子量激肽原(HMWK)，一种或多种与临床上明显可见的出血相关的凝血因子的缺乏，例如凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II(低凝血酶原血)和血管性血友病因子，维生素K缺乏症，纤维蛋白原病症包括纤维蛋白原缺乏血症，低纤维蛋白原血症和异常纤维蛋白原血症，α2-抗血纤蛋白酶缺乏症以及过量流血，例如由肝病、肾脏病、血小板减少症、血小板机能障碍、血肿、内出血、关节积血、外科手术、创伤、低体温、行经以及怀孕引起的过量流血。
本领域技术人员应当明白特定NASP所能有效治疗的病症。所要给予的实际剂量取决于受治疗者的年龄、体重和一般状况以及被治疗的病症的严重程度、卫生保健专家的评价以及要给予的结合物。本领域技术人员能确定治疗有效量，并可依每一特定病例之特定需求而调节。
一般来说，治疗有效量应在每日约0.01mg/kg至200mg/kg的NASP范围内，更优选每日约0.01mg/kg至20mg/kg，最优选每日约0.02mg/kg至2mg/kg。更适宜地，这样的剂量在0.01-50mg/kg每天四次(QID)、0.01-10mg/kg QID、0.01-2mg/kg QID、0.01-0.2mg/kg QID、0.01-50mg/kg每天三次(TID)、0.01-10mg/kg TID、0.01-2mg/kg TID、0.01-0.2mg/kg TID、0.01-100mg/kg每天两次(BID)、0.01-10mg/kg BID、0.01-2mg/kg BID或0.01-0.2mg/kg BID的范围内。所给予的化合物的量取决于特定NASP的效力和量值或期望的促凝血剂效果以及给药途径。
NASP(再次，优选作为药物制剂的一部分提供)可单独给药或与其它NASPs或诸如止血剂、血液因子或其它用于治疗特定病症或疾病的药物的治疗剂联合给药，根据临床医师的判断、患者的需要等等依照多种给药方案给药。特定的给药方案应为本领域技术人员所公知，并可使用常规方法通过试验确定。例证性的给药方案包括但不限于，每天5次、每天4次、每天3次、每天两次、每天一次、每周3次、每周两次、每周一次、每月两次、每月一次给药以及它们任意的组合。优选的组合物是那些需要剂量不超过每天一次的。
NASP可在其它试剂给予之前、给予同时或给予之后给予。如果与其它试剂同时提供，则NASP可在相同或不同的组合物中提供。因此，在同时治疗中NASPs和其它试剂可被单独给予个体。“同时治疗”意指给予受治疗者物质组合使得在受治疗者经受治疗过程中产生其治疗效果。例如，可通过给予一剂量的包含NASP的药物组合物和一剂量的包含至少一种其它试剂的药物组合物以实现同时治疗，所述其它试剂例如止血剂或凝血因子(如FVIII或FDC)，依照特定的给药方案该组合包含治疗有效的剂量。同样地，一种或多种NASPs和治疗剂可以在至少一次治疗剂量下给予。单独药物组合物的给药可同时进行或在不同时间进行(即顺次、以任一种次序，在同一天或在不同天给药)，只要受治疗者经受治疗过程中产生这些物质组合的治疗效果即可。
F.应用在一方面，在本发明的方法中，NASPs可被用于改善在治疗出血障碍，特别是那些与凝血因子缺乏相关的出血障碍中的止血，或逆转受治疗者中抗凝血剂效应。给予受治疗者NASPs，以治疗出血障碍，包括先天性凝血功能障碍、后天性凝血功能障碍和由创伤引起的出血病症。可用NASPs治疗的出血障碍的实例包括但不限于，血友病A，血友病B，血管性血友病，原发性血小板减少症，一种或多种接触因子的缺乏，例如凝血因子XI、凝血因子XII、前激肽释放酶和高分子量激肽原(HMWK)，一种或多种与临床上明显可见的出血相关的凝血因子的缺乏，例如凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II(低凝血酶原血)和血管性血友病因子，维生素K缺乏症，纤维蛋白原病症包括纤维蛋白原缺乏血症，低纤维蛋白原血症和异常纤维蛋白原血症，α2-抗血纤蛋白酶缺乏症以及过量流血，例如由肝病、肾脏病、血小板减少症、血小板机能障碍、血肿、内出血、关节积血、外科手术、创伤、低体温、行经以及怀孕引起的过量流血。在某些实施方案中，NASPs被用于治疗包括血友病A、血友病B和血管性血友病的先天性凝血功能障碍。在其它实施方案中，NASPs被用于治疗后天性凝血功能障碍，包括凝血因子VIII、血管性血友病因子、凝血因子IX、凝血因子V、凝血因子XI、凝血因子XII和凝血因子XIII缺乏，特别是由由凝血因子抑制剂或抗凝血因子的自身免疫所引起障碍，或由减少的凝血因子合成所引发的疾病或病症引起的止血障碍。
患者的需要应取决于所要治疗的具体出血障碍。例如，可在长时间内以多次剂量给予NASP以治疗慢性病症(如先天性或后天性凝血因子缺乏)。或者，在相对短的时间内，例如一到两周，以单次或多次剂量给予NASP以治疗急性病症(如由外科手术或或创伤或在接受凝血置换疗法的受治疗者中凝血因子抑制剂/自身免疫事件引起的出血)。此外，可将NASP治疗与其它止血剂、血液因子以及药物联合使用。例如，可给予受治疗者治疗有效量的一种或多种选自由凝血因子XI、凝血因子XII、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II、凝血因子VIIa和血管性血友病因子组成的组中的因子。治疗可进一步包含给予促凝血剂，例如内源性凝血途径活化剂，包括凝血因子Xa、凝血因子Ixa、凝血因子Xia、凝血因子XIIa和VIIIa、前激肽释放酶和高分子量激肽原；或外源性凝血途径活化剂，包括组织因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子Xa。此外，在经历过量流血的受治疗者中，可能需要输入血液制品以补充失血，在损伤的病例中，可能需要进行适当的手术修补来停止出血。
本发明也提供了一种用于逆转受治疗者中抗凝血剂效应的方法，所述方法包括给予受治疗者治疗有效量的含NASP的组合物。在某些实施方案中，所述受治疗者已用抗凝血剂治疗，所述抗凝血剂包括但不限于肝素、诸如丙酮苄羟香豆素或双香豆素的香豆素衍生物、TFPI、ATIII、狼疮抗凝物、线虫抗凝肽(NAPc2)、活性位点封闭的凝血因子VIIa(凝血因子VIIai)、凝血因子IXa抑制剂、凝血因子Xa抑制剂，包括磺达肝癸钠(fondaparinux)、依达肝癸钠(idraparinux)、DX-9065a和瑞扎沙班(razaxaban)(DPC906)、凝血因子Va和VIIIa抑制剂，包括激活蛋白C(APC)和可溶性血栓调节蛋白、凝血酶抑制剂，包括水蛭素、比伐卢定(bivalirudin)、阿加曲班(argatroban)和希美加曲(ximelagatran)。在某些实施方案中，所述受治疗者中的抗凝血剂可以是结合凝血因子的抗体，包括但不限于结合凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II、凝血因子XI、凝血因子XII、血管性血友病因子、前激肽释放酶或高分子量激肽原(HMWK)的抗体。
在某些实施方案中，NASP可单独给药或与一种或多种不同的NASPs共同给药和/或与一种或多种其它治疗剂联合给药，以逆转受治疗者中抗凝血剂效应。例如，可给予受治疗者治疗有效量的包含NASP和一种或多种因子的组合物，所述因子选自由凝血因子XI、凝血因子XII、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II、凝血因子VIIa和血管性血友病因子组成的组。治疗可进一步包括给予促凝血剂，例如内源性凝血途径活化剂，包括凝血因子Xa、凝血因子Ixa、凝血因子Xia、凝血因子XIIa和VIIIa、前激肽释放酶和高分子量激肽原；或外源性凝血途径活化剂，包括组织因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子Xa。
在另一方面，本发明提供了一种治疗经受外科或侵入性操作的受治疗者以改善其凝血的方法，所述方法包括给予受治疗者治疗有效量的包含非抗凝血的硫酸多糖(NASP)的组合物。在某些实施方案中，NASP可单独给予或与一种或多种不同的NASPs共同给予和/或与一种或多种其它治疗剂联合给予经受外科或侵入性操作的患者。例如，可给予受治疗者治疗有效量的一种或多种因子，所述因子选自由凝血因子XI、凝血因子XII、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II、凝血因子VIIa和血管性血友病因子组成的组。治疗可进一步包括给予促凝血剂，例如内源性凝血途径活化剂，包括凝血因子Xa、凝血因子Ixa、凝血因子Xia、凝血因子XIIa和VIIIa、前激肽释放酶和高分子量激肽原；或外源性凝血途径活化剂，包括组织因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子Xa。
在另一方面，本发明提供了一种抑制TFPI活性的方法，包括将包含TFPI的组合物与足够量的NASP结合以抑制TFPI活性。在某些实施方案中，通过一种方法抑制受治疗者中TFPI活性，该方法包括给予受治疗者治疗有效量的包含NASP的组合物。在某些实施方案中，本发明提供了一种抑制生物样品中TFPI活性的方法，所述方法包括将生物样品(如血液或血浆)与足够量的NASP结合以抑制TFPI活性。
III.实验以下是用于实现本发明特定实施方案的实例。这些实例仅作为例证性的目的来提供，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。
所使用的数值(如量、温度等)的精确度均能得到确保，但应当允许某些试验误差和偏差的存在。
实施例1材料和方法A.试剂肝素和改性的肝素，以及岩藻依聚糖购自Sigma(St.Louis，MO)。戊聚糖多硫酸钠(PPS)的来源是处方药物Elmiron，获自Ortho-McNeilPharmaceuticals(Raritan，NJ)。人血浆获自George King Biomedical(Overland Park，KS)。凝血因子VIIa和人重组TFPI获自AmericanDiagnostica(Stamford，CT)，凝血因子VIII是处方药物ReFactoR，获自Wyeth Pharmaceuticals(Madison，NJ)。SIMPLASTIN EXCEL和APTT试剂获自bioMerieux(Durham，NC)或Organon Teknika(Roseland，NewJersey)。
B.动物Hem-A小鼠(外显子16FVIII KO等位基因纯合的)是John HopkinsUniversity所许可的，Hem-B小鼠(外显子1-3FIX KO纯合的)是University of North Carolina at Chapel Hill所许可的。所有涉及的动物操作均根据“Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals”(National Research Council.Guide for the care and use oflaboratory animals.Washington，D.CNational Academy Press；1996)进行，所有的操作均经过实验动物护理和使用委员会(institutionalanimal care and use committee)检查和核准。
C.凝集测定活化部分凝血激酶时间(aPTT)测定aPTT测定按如前所述有所修改(PDR Staff.Physicians′DeskReference.2004，Anderson Lo，Barrowcliffe，T.W.，Homier，E.，Johnson，E.A.，Sims，G.E.C.Thromb.Res.1976；9575-580)。将25mM CaCl2和血纤蛋白杯(Fisher)在37℃下预保温。添加0.1ml解冻的人血浆(正常或血友病的)到保温的试管中。在室温下，5μl盐水(如Sigma)或溶解于盐水中的5μl测试试剂(如NASP)与95μl血浆温育30分钟。在3ml蒸馏水中重建APTT试剂(如Organon Teknika)，并将0.1ml的含APTT试剂的重建溶液添加到每个试管中。将含有测试试剂或盐水对照及aPTT试剂的0.2ml血浆从试管中转移到预保温的血纤蛋白杯中并温育2-3分钟。添加0.1ml预保温的25mM CaCl2以启动凝血并用BBL FIBROSYSTEM血纤蛋白仪(fibrometer)测定血浆凝固时间。
稀释凝血酶原时间(dPT)测定所使用的dPT测定是经修改的标准临床PT测定(Nordfang等.(1991)Thromb Haemost 66464-467；Welsch等.(1991)Thrombosis Research64213-222)。用厂商稀释剂重建SIMPLASTTN EXCEL凝血激酶试剂(Organon Teknika)并在0.9％盐水中进一步稀释到1∶100。在启动测定前于37℃下预保温凝血激酶试剂、25mM CaCl2和血浆样品。在微量离心管中等分100μl解冻的血浆。对于TFPI活性测定，添加5μl盐水(如Sigma)或5μl测试试剂(如硫酸多糖)到95μl血浆中并在室温下温育约30分钟。添加100μl稀释的凝血激酶试剂和100μl 25mM CaCl2到在37℃预保温的血纤蛋白杯(Fisher)中。将100μl含有测试试剂或盐水对照的血浆(正常或血友病的)添加到含有凝血激酶试剂和CaCl2的血纤蛋白杯中以启动凝血。使用BBL FIBROSYSTEM血纤蛋白仪(fibrometer)测定血浆凝血时间。
动物出血时间测定该出血时间测定可用于在给予测试试剂(如载体对照或NASP)后，于正常或血友病(FVIII或FIX或vWF缺乏)啮齿动物中测量止血功能的改变。经口、肠胃外或通过连续输注每日一次或两次给予啮齿动物测试试剂(如载体对照或NASP)。例如，可用小的量针将0.1ml/10g体重(肩胛下)的测试试剂以0.1-10mg/kg的剂量范围每日给予两次，持续至少一天，优选超过3天。在测定出血时间的这一天，用氯胺酮/甲苯噻嗪(或异氟烷)麻醉啮齿动物。在无菌衬垫上排齐啮齿动物，将尾部浸入盛盐水的皮氏培养皿中。将EMLA乳酪施用于啮齿动物尾部所要切口的部位。对于小鼠，剪断尾部末梢，将尾部置于盐水培养皿中并启动计时器。对于大鼠，在其尾部的背侧部位切一8mm长1mm深的切口，然后转移到盐水中。记录在盐水中可见出血停止的时间。对于啮齿动物，正常对照小鼠的出血时间约为10分钟，正常对照大鼠的为6分钟。在出血时间测定完成后，用无菌纱布(gauge)干燥啮齿动物尾部，检验止血情况，并将啮齿动物放回到笼子中。如果需要可在切口部位施用硝酸银。
或者，可通过其它方法在小鼠(Broze等.(2001)Thromb.Haemost.85747-748)或狗(Scallan等.(2003)Blood 1022031-2037；Pijnappels等.(1986)Thromb.Haemost.5570-73)中测定出血时间。可选的或其他的药效终点可包括从NASP-处理的受治疗者中抽血，用于直接分析或用于血浆分离以及测量离体凝血时间(如全血凝血时间和/或PT和/或APTT)或凝血因子水平。
全血凝血时间(WBCT)测定WBCT测定进行如下。在异氟烷室中简单地将小鼠麻醉。然后从后眼窝血管丛抽血(如150μl)到塑料血液收集试管中。将试管置于37℃水浴中并使用秒表测定凝血时间。在这一期间，每隔1分钟倒置试管一次。测定凝血(完全/非部分凝血)所需时间。
统计学分析对于凝集测定，使用学生t-检验(Student’s t-test)分析NASP处理的样品和载体对照之间的显著性。利用单向卡方分析(Chi-squaredanalysis)研究小鼠出血测试的数据较载体对照数据(或如下表所示的其它组)的显著性。通过Fisher氏精确检验(Fisher’s exact test)获得几乎一致的结果。
实施例2在dPT测定中TFPI增加了凝血时间进行以下试验以证实在dPT测定中TFPI增加了凝血时间，并测定供随后NASP试验使用的TFPI浓度。在盐水中将100μg/mL TFPI母液(American Diagnostica，Stamford，CT)进行连续稀释以产生如下浓度的TFPI溶液20、15、10、6和2μg/mL。将5μl的这些TFPI稀释液与95μl的FVIII缺乏的血浆混合并在室温下温育30分钟。dPT测定进行如下在盐水中以1∶100稀释SIMPLASTIN凝血激酶并预保温在37℃下。将25mM CaCl2和100μl含TFPI的测试血浆在37℃预保温。将100μl SIMPLASTIN凝血激酶和100μl CaCl2混合并使用BBL血纤蛋白仪测定凝血时间。结果概述于表1中。
表1TFPI存在下的凝血时间
TFPI增加了Hem-A血浆的凝血时间，具有线性剂量响应(见图1)。基于这些数据，选择0.5μg/ml浓度的TFPI用于NASP促凝血剂功能的测定。
实施例3筛选NASPs对包括改性的肝素、戊聚糖多硫酸酯和岩藻依聚糖的硫酸多糖化合物的抗凝血活性进行测试，并与肝素比较以确定它们是否具有“非抗凝血”资格。所测试的化合物列于表2中。
表2用于测试抗凝血活性的NASPs
将测试化合物稀释到100μM、10μM、2μM和200nM。对于每一测试化合物，添加12.5μl含测试化合物的稀释溶液到237.5μl的Hem-A血浆中并在室温下温育。移取100μl含测试化合物的血浆用于如实施例2所述血浆凝血时间的dPT测定。结果概述于下表3中。
表3
根据dPT测定NASPs对凝血时间*的影响
*所示值是所选择多糖的凝血时间(s)。在缺少NASPs下Hem-A血浆的凝血时间为41.5秒。
如表3和图2所示，超过10nM浓度的肝素明显抗凝，而N-乙酰基肝素(NAH)、N-乙酰基-脱-O-硫酸化肝素(NA-de-O-SH)、脱-N-硫酸化肝素(De-N-SH)在＞5000nM浓度下则显示很小的凝血时间延长或不延长凝血时间。同样地，岩藻依聚糖和PPS分别是弱抗凝血的，与肝素相比，在约10-至100-倍更高的浓度下显示50％的凝血时间延长，因此称为“非抗凝血的”。使用正常的人血浆观察到了几乎一致的分布图(数据未显示)。
实施例4根据aPTT测定NASPs对人血浆凝集的影响同样使用aPTT测定法测定NASPs对血浆凝血时间的影响，以确定它们是否具有“非抗凝血”资格。在人Hem-A血浆中制备FACT稀释液，一种“正常的”人参照血浆(George King Biomedical)，以产生具有0.31-100％正常血浆浓度的血浆。然后aPTT测定进行如下将100μl的FACT-Hem-A血浆混合液与100μl的aPTT试剂混合并在37℃下温育3分钟。添加100μl的CaCl2并使用BBL血纤蛋白仪测定血浆凝血时间。结果如表4所示。
表4FACT浓度对凝血时间的影响
基于此数据，选择1.25％的FACT浓度用于筛选用于促凝血剂活性的NASPs的测定。NASPs对血浆凝血时间的影响测定如下将5μl的NASP添加到95μl的在人Hem-A血浆中稀释的1.25％FACT中，并在室温下温育30分钟。如实施例1所述进行aPTT测定，以确定血浆凝血时间。结果如表5所示。
表5根据aPTT测定NASPs对血浆凝血时间的影响
通过在APTT凝集测定中使用Hem-A血浆评估三种化合物，证实了对“NASP”活性的进一步验证。与肝素相比，对于岩藻依聚糖、PPS和NAH产生大约50％凝血时间延长的浓度分别高于肝素的10-或100-或＞500倍(见图3)。
实施例5利用NASPs抑制TFPI活性A.在添加到血浆前预温育TFPI和NASPs在dPT凝集测定中使用正常的或血友病血浆以及添加的重组TFPI，以评估NASPs对TFPI活性的抑制。在添加血浆前将稀释的重组TFPI与NASPs在室温下预温育5分钟。添加血浆后，将混合液再温育25分钟，随后启动dPT。在Hem-A血浆中进行的测定结果如表6和图4所示。
表6NASP抑制Hem-A血浆中TFPI活性
Hem-A血浆本身的凝血时间是44秒。
Hem-A血浆+TFPI的凝血时间是151秒。
取决于试验和人血浆来源，TFPI在约0.5μg/ml的最终浓度下将血浆的凝血时间从约40秒延长到100-200秒。如果TFPI活性受硫酸多糖抑制，则在NASPs存在下应观察到凝血时间的缩短(参见Nordfang等.(1991)Thromb.Haemost.66(4)464-467)。如图4所示，添加大于1nM浓度的岩藻依聚糖和PPS明显加速了含TFPI的Hem-A血浆的凝集。相比之下，NAH需要大约100nM的浓度才能缩短凝血时间，而肝素(未显示)则仅能延长凝血时间。重要的是，在PPS或岩藻依聚糖在最佳浓度下，凝血时间缩短到无TFPI或载体对照水平，或稍微低于该水平，TFPI效应中和幅度横跨至少100-倍范围(如5-500nM)。
此外，也在Hem-B和正常血浆中测试了TFPI存在下NASPs加速血浆凝集。在Hem-B血浆中进行的测定结果如表7和图5所示。
表7NASP抑制Hem-B血浆中TFPI活性
仅有Hem-B血浆，无TFPI的凝血时间46秒。
Hem-B血浆+TFPI的凝血时间101秒。
在Hem-B血浆(表7和图5)和正常人血浆(数据未显示)中，类似地证实了NASPs通过抑制TFPI活性来加速血浆凝集的假设。NASPs之间效力的等级次序与Hem A血浆研究相同，浓度响应分布图也几乎相同。
B.TFPI不与NASPs预温育下对TFPI活性的抑制在暴露于血浆前不进行硫酸多糖和TFPI的预温育，而重复进行试验。为增加NASP抑制TFPI活性测试的严格性，在添加NASP前先将TFPI添加到血浆中。结果示于表8和图6中。
表8在Hem-A血浆中无预温育下NAH和PPS对TFPI的抑制
HemA+TFPI183秒仅有Hem-A，无TFPI45秒如图6所描述，清楚地证实了NASPs在Hem A血浆中与在预温育研究(图4)中具有相同的凝血时间加速特性以及几乎相同的剂量响应分布图。有趣的是，岩藻依聚糖是最有效的，明显加速凝集的浓度窗口大于100-倍。因此，这些研究确定了某些NASPs例如PPS和岩藻依聚糖可显示出TFPI中和活性，且这种效力在十分宽的浓度范围中都得到了证实，而在这些浓度范围内未观察到网状抗凝。
实施例6在缺少TFPI补充物下NASPs对血友病血浆凝血的改善同样地，在dPT测定中也测试了在缺少TFPI补充物下，NASPs加速因子缺乏的血浆凝集的能力。如果观察到促凝血剂响应，则可能是与内源TFPI活性的中和相关，其在人血浆中的浓度大约为100ng/ml(Nordfang等.，见上)，很大程度上与脂蛋白或血小板相关(Broze等.(1992)Semin.Hematol.29159-169；Broze等.(2003)J.Thromb.Haemost.11671-1675)。
A.在缺少外源TFPI下Hem-A血浆凝集的加速对在缺少外源TFPI下，NASPs加速Hem-A血浆凝集的能力进行了测试。将岩藻依聚糖或PPS滴定入Hem A血浆中并进行dPT测定。另外，对凝血因子VIIa的剂量响应进行分析，并作为放大外源性途径活化的阳性对照。结果示于图7和表9中。
表9在缺少外源TFPI下Hem-A血浆凝集的加速
仅有Hem-A，无NASP的凝血时间69秒岩藻依聚糖和PPS都以剂量依赖性方式明显地加速了凝血时间，岩藻依聚糖具有最好的效力和最高的功效。在其它研究中，在岩藻依聚糖存在下，促凝血剂效应的窗口为约5nM至＞100nM。注意在图7中，当响应曲线在岩藻依聚糖＞100nM的浓度处开始偏向上时，相对于载体对照仍然加速了凝集，因此岩藻依聚糖是促凝血剂。虽然在20nM岩藻依聚糖下，凝血时间从约70秒缩短到55秒并无大的差别，但NAH没有活性。在先前使用像FVIIa和凝血酶的促凝血剂因子中业已观察到了这样的加速。因此，将FVIIa添加到20nM加速凝血时间约20秒，优于岩藻依聚糖(图7)。但是，有趣的是注意到20nM岩藻依聚糖与5nM FVIIa的药理学浓度是可比较的。
B.在缺少外源TFPI下Hem-B血浆和FVII-缺乏的血浆的凝集的加速通过在Hem B血浆和FVII缺乏的血浆中测试NASP活性，评估NASPs对其它人出血障碍的表观促凝血剂活性。在Hem-B血浆中观察到了与Hem-A血浆类似的结果(数据未显示)。
在dPT测定中也评估了对凝血因子VII-缺乏的血浆凝集的调节。如所预期的，FVII-缺乏的血浆因没有FVIIa重建而无法在300秒内凝集。添加FVIIa到约0.1nM使凝血时间恢复到约150秒(数据未显示)。在dPT测定中显示出的这样的凝血时间的变化，模仿了人凝血因子VII-缺乏的某些形式。将岩藻依聚糖和PPS滴定到FVII-缺乏的血浆中加速了凝血时间。结果示于图8和表10中。
表10在缺少外源TFPI下凝血因子VII-缺乏的血浆凝集的加速
无NASP，无FVIIa凝血时间＞300秒无NASP，+0.1nM FVIIa凝血时间173秒如图8所示，岩藻依聚糖和PPS的滴定加速了凝血因子VII-缺乏的血浆的凝集，且如用Hem A血浆所观察到的，岩藻依聚糖较PPS明显更有效。另外，治疗窗口扩宽；就岩藻依聚糖而言，在约10nM-500nM浓度范围内就能观察到实质上的凝集加速。
实施例7NASP-处理的小鼠中改善的止血用PPS和岩藻依聚糖处理Hem A或Hem B小鼠，以评估体内潜在的止血改善。将NASPs进行皮下注射，所用剂量是患血友病小鼠能很好地合理耐受的常用剂量，且通过该途径的不同硫酸多糖的生物利用度已得到确定(MacGregor等.(1985)Thromb.Haemost.53411-414；Millet等.(1999)Thromb.Haemost.81391-395)。PPS和岩藻依聚糖半衰期可短至1-2小时。因此，采用每日两次的给药方案。最初的研究表明持续几天的剂量优选在1-2天内的给予。
在已处理的小鼠中评估NASP处理对凝血调节的影响是基于几个潜在的终点进行的。这些潜在的终点包括用于dPT测定的血浆分离、用于全血凝血时间(WBCT)测定的血样、急性出血时间以及剪尾或横切口后的长期存活，(Broze等.(2001)Thromb.Haemost.85747-748)。使用PPS和岩藻依聚糖的5-天体内研究结果概述于表11-13中。
A.在Hem-A和Hem-B小鼠中PPS的功效测试了PPS对改善Hem-A和Hem-B小鼠凝血的功效。皮下给予Hem-A和Hem-B雄性小鼠或雌性小鼠0.02、0.06或0.2mg/kg剂量的PPS或盐水载体，每天两次持续5天。在给药后第5天的早上，剪断距末梢1cm的尾部，并在随后的20-24小时内监测小鼠的行为和存活。结果示于表11中。
表11在PPS-处理的血友病小鼠中改善的止血
在切割尾部(t＝0)后，随机分组小鼠并皮下给予指示剂，每天两次持续4.5天。
#p＝0.07对载体用0.06mg/kg的PPS对Hem-A小鼠的处理显示几乎两倍改善的存活，但是该结果并不是统计学上显著的(0.05＜p＜0.1)(表11)。疗效还进一步得到了对处理组不知情的技术人员目视观察的支持。相对于载体对照，在中高剂量动物中观察到了更多的正常行为(较少的嗜睡和蹲伏)以及较小范围的出血。同样地，随后对Hem-B小鼠使用0.06mg/kg皮下每天两次更有效剂量的处理，产生了与在FVIII-缺乏的小鼠中所观察到的相同的结果。
在dPT测定中进一步测试了PPS在改善Hem-B小鼠凝血的功效。在研究前对所有的小鼠都放血以确定基线(预试验)凝血时间。用PPS皮下处理小鼠(14周大)，每天两次，持续4.5天，并采用如下剂量在250μl体积中的2、0.3和0.06mg/kg，。在4.5天后对小鼠放血并测定所收集血样的凝血时间。结果示于表12中。
表12用PPS处理的Hem-B小鼠的凝血NASPs改善了dPT
未用过药的Hem-B具有44-50秒的dPT。
B.在Hem-A小鼠中岩藻依聚糖的功效如上所述，已知在某些凝集测定中，与PPS相比，岩藻依聚糖具有改善的效力和功效量级。因此，在Hem-A小鼠中用岩藻依聚糖进行了额外的研究。在使用岩藻依聚糖进行的最初研究中，采用了几乎与PPS所述的相同的给药方案，但剂量水平稍有不同。以0.1或1.0mg/kg剂量皮下给予Hem-A雄性小鼠岩藻依聚糖或盐水，每天两次持续4天。在第5天的早上，在放血测试前给予小鼠两倍剂量的岩藻依聚糖。与载体对照相比，评估用岩藻依聚糖处理的小鼠的存活和动物行为。
在接下来的对岩藻依聚糖的研究中，评估了与凝血因子VIII联合治疗的潜力。除在第5天早上小鼠远离身体的尾静脉中接受了53mU/小鼠FVIII(约1.25％的FVIII正常水平)的静脉推注剂量之外，如上所述进行该研究。之前，侧面的尾静脉而非动脉在相应于约2.7mm直径的区域切断2小时。在这些岩藻依聚糖研究中，使用了尾静脉切断的改进处理，发现其能更精确地评估止血及其调节(Broze等，(2001)Thromb.Haemost.85747-748)。记录存活和临床观察20-24小时。结果示于表13中。
表13岩藻依聚糖和岩藻依聚糖+FVIII在血友病A小鼠中的功效
在尾静脉切口(t＝0)后，随机分组小鼠并皮下给予载体或NASP，每天两次持续4.5天。在此指出，在尾部切割前2小时给予FVIII。注意在这些小鼠中1％FVIII重建产生了-10％存活，而2％FVIII重建则提供了-100％存活。
*p＜0.05对载体+p＝0.06对载体#p＝0.06对岩藻依聚糖在最初的研究中，用0.1mg/kg剂量的岩藻依聚糖处理小鼠较1.0mg/kg剂量的处理似乎更有效(在约10小时处载体的存活是1/6，0.1mg/kg的是4/6以及1.0mg/kg的是3/6)。因此，用0.1mg/kg剂量的岩藻依聚糖进行接下来的研究。
正如表13顶部两行所表明的，Hem A小鼠的岩藻依聚糖处理明显改善了出血存活。如上所述，在所有岩藻依聚糖处理的小鼠中，在切口后最初8-10小时期间，动物行为更加正常，在几乎一半的动物中很清楚得到了长期改善。
通过用FVIII+/-岩藻依聚糖处理小鼠，预先评估了联合治疗的潜力(表13)。在尾部切口前2小时单独给予Hem A小鼠的初步剂量导向研究表明，对于存活有着非常明显的剂量响应关系。给予正常的1％的ReFactoR产生约10％的存活，而给予正常的2％则产生约100％的存活(数据未显示)。因此，选择1.25％剂量的FVIII重建以给出约50％的存活。值得注意的是，用岩藻依聚糖+FVIII处理组中的存活百分率一向高于用岩藻依聚糖或FVIII单独处理的组中的存活百分率。因此，PPS和岩藻依聚糖研究结果表明，在选择的NASP给予后，血友病动物模型中的止血得到了改善。
结论着手了一系列的研究以测试NASPs在离体和体内血友病模型中对凝血的改善。与肝素相比，硫酸多糖被确认为具有相当大程度上减少的抗凝血特性。那些NASPs的亚类，即岩藻依聚糖和PPS则显示出能有力地抑制凝血外源性途径主要下调物—TFPI的活性。岩藻依聚糖和PPS改善了缺乏凝血因子VII、VIII或IX的人血浆的稀释凝血酶原凝血时间。从血友病小鼠放血测试中显然可见岩藻依聚糖或PPS体内处理的疗效。
PPS和岩藻依聚糖在较高浓度下均可显示出抗凝血活性，很可能是与肝素辅因子II相互作用的结果(Church等，(1989)J.Biol.Chem.2643618-3623；Giedrojc等，(1999)J.Cardiovasc.Pharmacol.34340-345)。皮下给予大鼠PPS需要＞5mg/kg的剂量以延长凝血(Giedrojc等，见上)，而岩藻依聚糖似乎在兔中具有良好的耐受性，甚至其剂量为静脉内给予10mg/kg(Granert等，(1999)Infect.Immun.672071-2074)。因此，目前的结果显示在血友病啮齿动物中于＜0.1mg/kg剂量下止血得到改善。体内改善止血的剂量水平低于引起其它所报告结果的剂量水平(Toida等，(2003)Trends in Glycoscience andGlycotechnology 1529-46；Luyt等，(2003)J.Pharmacol.Exp.Ther.30524-30；Berteau等，(2003)Glycobiology 1329R-40R；Granert等，见上；and Sweeney等，(2002)Blood 9944-51)。
不受特定理论限制，NASP对TFPI的抑制能部分地解释为所观察到的离体或体内凝集的改善。抗体对TFPI的中和已显示出在兔Hem A模型中改善了止血，并加速了人血友病血浆凝血(Nordfang等，见上；Welsch等，见上；和Erhardtsen等，(1995)Blood Coagul.Fibrinolysis6388-394)。在目前的研究中，在血友病血浆dPT测定中，仅仅是那些抑制TFPI活性的化合物也减少了凝血时间。此外，与PPS相比，当TFPI先混合入血浆以最好地模拟天然条件时，在dPT凝集测试中岩藻依聚糖显示出更好的效力，而这或许是更强的最佳效应。同样地，与PPS相比，对小鼠用岩藻依聚糖处理产生了稍好的效力，尽管尚不明确的相对药物动力学可能会对出血效果有所影响。
值得注意的是在所有测试的NASPs中这样的行为并不都是明显的。例如，NAH仅具有弱的TFPI-中和活性(图4-6)，在缺少TFPI添加下并不能加速血友病血浆的凝血时间(数据未显示)。此外，三种在高达5000nM的浓度下都无法显示固有的抗凝血活性(图2；De-N-S-AH、De-N-SH和NA-De-O-SH)的NASPs并未显示出任何TFPI-中和活性，并且同样地在HemA血浆中也无法加速凝血时间(数据未显示)。
使用NASPs所观察到的改善的止血量级似乎与临床相关。在最佳岩藻依聚糖浓度下的Hem A血浆改善的凝血时间，可与已证实为在患者标准化的止血中有效的约5nM的FVIIa补充物(实施例6)相比较(Bishop等，(2004)Nat.Rev.Drug Discov.3684-694；Carcao等，(2004)BloodRev.18101-113；Roberts等，(2004)Anesthesiology 100722-730；Lee等，(2004)Int.Anes thesiol.Clin.4259-76；和Brummel等，(2004)J.Thromb.Haemost.21735-1744)。此外，用NASP处理小鼠明显有利于其存活(实施例7)。在岩藻依聚糖加速凝血的dPT测定中，与用小鼠血浆相比，用人血友病血浆的效果更为明显(数据未显示)。
就NASP用于出血障碍的潜在临床开发而言，显然要考虑到治疗指数。具体来说，该指数是指改善止血和转变为抗凝血之间的指数。根据诸如PPS或岩藻依聚糖的化合物在人血浆中的凝集测定结果，在抗-TFPI或加速dPT凝集“活性”和丧失这样的功效及发生网状抗凝血之间的差额应似乎要＞50-倍。如上所述对于小鼠的研究，在小鼠中出现的该指数应至少是10倍。此外，作为一类物质，肝素类硫酸多糖通常是良好耐受的。
总之，全身给予选择的NASPs代表的可能是一种独特的用于在出血障碍中调节止血方法。特别是，戊聚糖多硫酸酯和岩藻依聚糖抑制了TFPI活性，并改善了人凝血因子VII-、VIII-和IX-缺乏的血浆中凝血。因此，NASP处理改善了止血，并代表了当前的一种相对低成本、安全及便利的凝血因子治疗的备选方法或补充。
尽管本发明的优选实施方案业已得到说明和描述，但是应当明白的是在此可进行各种不背离本发明的精神和范围的改变。
权利要求
1.非抗凝血的硫酸多糖(NASP)在制备用于治疗需要增强凝血的受治疗者的组合物中的应用。
2.权利要求1的应用，其中所述NASP选自由N-乙酰基-肝素(NAH)、N-乙酰基-脱-0-硫酸化肝素(NA-de-o-SH)、脱-N-硫酸化肝素(De-NSH)、脱-N-硫酸化乙酰化肝素(De-NSAH)、高碘酸氧化肝素(POH)、化学硫酸化海带多糖(CSL)、化学硫酸化褐藻酸(CSAA)、化学硫酸化果胶(CSP)、硫酸葡聚糖(DXS)、肝素衍生的寡糖(HDO)、戊聚糖多硫酸酯(PPS)和岩藻依聚糖组成的组。
3.权利要求2的应用，其中所述NASP是NAH。
4.权利要求2的应用，其中所述NASP是PPS。
5.权利要求2的应用，其中所述NASP是岩藻依聚糖。
6.权利要求2的应用，其中所述NASP是在dPT测定中减少血液凝血时间的岩藻依聚糖的片段。
7.权利要求1-6中任一项的应用，其中NASP在约0.01 mg/kg至约100 mg/kg的剂量下给予。
8.前述权利要求的应用，其中受治疗者患有选自由慢性或急性出血障碍、由血液因子缺乏引起的先天性凝血功能障碍以及后天性凝血功能障碍组成的组的出血障碍。
9.权利要求8的应用，其中血液因子缺乏是一种或多种选自由凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII和血管性血友病因子组成的组的因子缺乏。
10.权利要求1的应用，其中对增强凝血的需要是在给予抗凝血剂或进行外科或其它侵入性操作之前。
11.前述权利要求的应用，其中通过给予选自由促凝血剂、内源性凝血途径活化剂、外源性凝血途径活化剂和第二种NASP组成的组的试剂对受治疗者作进一步治疗。
12.权利要求11的应用，其中内源性凝血途径活化剂选自由凝血因子Xa、凝血因子IXa、凝血因子XIa、凝血因子XII a和VIIIa、前激肽释放酶以及高分子量激肽原组成的组。
13.权利要求11的应用，其中外源性凝血途径活化剂选自由组织因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子Xa组成的组。
14.前述权利要求的应用，其中通过给予一种或多种选自由凝血因子XI、凝血因子XII、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II、凝血因子VIIa和血管性血友病因子组成的组的因子，对受治疗者作进一步治疗。
15.权利要求10的应用，其中抗凝血剂选自由肝素、诸如丙酮苄羟香豆素或双香豆素的香豆素衍生物、组织因子通道抑制剂(TFPI)、抗凝血酶III、狼疮抗凝物、线虫抗凝肽(NAPc2)、活性位点封闭的凝血因子VIIa(凝血因子VIIai)、凝血因子IXa抑制剂、包括磺达肝癸钠(fondaparinux)、依达肝癸钠(idraparinux)、DX-9065a和瑞扎沙班(razaxaban)(DPC 906)在内的凝血因子Xa抑制剂、包括激活蛋白C(APC)和可溶性血栓调节蛋白在内的凝血因子Va和VIIIa抑制剂、包括水蛭素、比伐卢定(bivalirudin)、阿加曲班(argatroban)和希美加曲(ximelagatran)在内的凝血酶抑制剂，以及结合凝血因子的抗体组成的组。
16.权利要求15的应用，其中抗凝血剂是结合凝血因子的抗体，所述凝血因子选自由凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II、凝血因子XI、凝血因子XII、血管性血友病因子、前激肽释放酶和高分子量激肽原(HMWK)组成的组。
17.非抗凝血的硫酸多糖(NASP)在制备用于抑制受治疗者中TFPI活性的组合物中的应用。
18.非抗凝血的硫酸多糖(NASP)在制备用于抑制生物样品中TFPI活性的组合物中的应用。
19.组合物，含有非抗凝血的硫酸多糖(NASP)；药学上可接受的赋形剂；和一种或多种选自由凝血因子XI、凝血因子XII、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子II和血管性血友病因子、组织因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子Xa、凝血因子IXa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa以及VIIIa组成的组中的因子。
20.治疗需要增强凝血的受治疗者的方法，包括给予所述受治疗者治疗有效量的含有非抗凝血的硫酸多糖(NASP)的组合物。
21.抑制受治疗者中TFPI活性的方法，该方法包括给予受治疗者治疗有效量的含有非抗凝血的硫酸多糖(NASP)的组合物。
22.抑制生物样品中TFPI活性的方法，该方法包括将生物样品与足够量的非抗凝血的硫酸多糖(NASP)结合以抑制所述TFPI活性。
23.在生物样品中利用非抗凝血的硫酸多糖(NASP)测定凝血加速的方法，该方法包括a)将生物样品与含有所述NASP的组合物结合，b)测定所述生物样品的凝血时间，c)比较所述生物样品与不暴露于NASP的相应生物样品的凝血时间，其中暴露于NASP的生物样品的凝血时间的减少意味着NASP加速了凝血时间。
全文摘要
披露了使用非抗凝血的硫酸多糖(NASPs)作为促凝血剂用于治疗出血障碍的方法。NASPs可作为单一试剂给药或与另外的NASPs或其它药物(例如凝血因子VII、VIII和IX)联合给药以促止血。特别是，描述了NASPs在治疗包括先天性凝血功能障碍、后天性凝血功能障碍和创伤引起的出血病症的出血障碍中的应用。
文档编号A61K31/717GK1984664SQ200580023658
公开日2007年6月20日 申请日期2005年5月27日 优先权日2004年5月27日
发明者科尔克·W·约翰逊 申请人:艾维根有限公司